1、學習好資料 歡迎下載河南科技大學實驗教學教案課 程 名 稱 分 子 生 物 學指 導 教 師 李市場學習好資料 歡迎下載河南科技大學實驗教學教案首頁實驗名稱實驗一、大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化實驗學時4 每次實驗組數(shù)6 每組人數(shù)5 實驗類型綜合性實驗?zāi)康暮鸵螅和ㄟ^本實驗，掌握大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化的方法和技術(shù)。實 驗 設(shè) 備 及 器 材 ：控溫搖床 (37 ) ，高速冷凍離心機，水浴鍋，冰箱（-20 , 70）超凈工作臺，培養(yǎng)箱 (37 ) ，752 分光光度計，滅菌鍋等。實 驗 原 理 ：細菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)叫感受態(tài)。轉(zhuǎn)化是指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導人細菌

2、的過程。其原理是細菌處于0， CaCl2 低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形。轉(zhuǎn)化混合物中的 DNA形成抗 DNA酶的羥基 - 鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，經(jīng) 42短時間熱擊處理，促進細胞吸收 DNA復合物。將細菌放置在非選擇性培養(yǎng)基中保溫一段時間，r 促使在轉(zhuǎn)化過中獲得的新的表型 （如 Amp等）得到表達，然后將此細菌培養(yǎng)物涂在含有氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基上。實 驗 內(nèi) 容 ：將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進受體細菌， 需誘導受體細菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源 DNA 。將已經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞在選擇培養(yǎng)基上進行篩選。學 生 實 驗 報 告 要 求 ：實 驗 報 告 要 求 把 每 個 實 驗 步 驟 都 進 行 分

3、析 。注 意 事 項 ：無菌操作 低溫操作學習好資料 歡迎下載實驗一 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化實驗?zāi)康?通過本實驗，掌握大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化的方法和技術(shù)。實驗原理 將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進受體細菌， 需誘導受體細菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源 DNA 。轉(zhuǎn)化 (Transformation)是將外源 DNA 分子引入受體細胞 ,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段 ,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實驗技術(shù)。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體 (R ,M ), 它可以容忍外源 DNA 分子進入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。

4、為了提高轉(zhuǎn)化效率, 實驗中要考慮以下幾個重要因素：1. 細胞生長狀態(tài)和密度 : 細胞生長密度以剛進入對數(shù)生長期時為好，可通過 監(jiān)測培養(yǎng)液的 OD600 來控制。DH5 菌株的 OD600 為 0.5 時,細胞密度在 5107 個/ml 左右(不同的菌株情況有所不同 ),這時比較合適。密度過高或不足均會影響 轉(zhuǎn)化效率。2. 質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度 : 1ng 的 cccDNA 即可使 50 l 的感受態(tài)細胞達到飽和。一般情況下 ,DNA 溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細胞體積的 5。3. 試劑的質(zhì)量 : 所用的試劑 ,如 CaCl2 等均需是最高純度的 (GR.或 AR.), 并 用超純水配制 ,最好分裝保

5、存于干燥的冷暗處。4. 防止雜菌和雜 DNA 的污染。本實驗以 E.coli DH5a 菌株為受體細胞 ,并用 CaCl2 處理 ,使其處于感受態(tài) ,然后與 pUC19 質(zhì)粒共保溫 ,實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。由于pUC19 質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Ampr ) ，可通過 Amp 抗性來篩選轉(zhuǎn)化子。如受體細胞沒有轉(zhuǎn)入 pUC19，則在含Amp 的培養(yǎng)基上不能生長。能在Amp 培養(yǎng)基上生長的受體細胞（轉(zhuǎn)化子）肯定已導入了 pUC19。轉(zhuǎn)化子擴增后，可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出，進行電泳、酶切等進一步鑒定。一. 儀器控溫搖床 (37) 高速冷凍離心機水浴鍋冰箱（ -20, 70）超凈工作臺培養(yǎng)箱 (37)學習好資料

6、歡迎下載752 分光光度計 滅菌鍋二. 試劑CaCl2 無菌水 ,冰胰蛋白胨酵母粉Amp NaCl 三. 其他用品移液器，槍頭1.5ml ,50ml 離心管三角瓶 500ml 200ml 6cm 平皿 試劑瓶 60ml 量筒 燒杯瓊脂 甘油酒精燈 三角玻棒酒精棉球 火柴溶液配制0.1 mol/L CaCl2 溶液 配置 滅菌LB 液體培養(yǎng)基氨芐青霉素（ Amp），用無菌水配制成 50_60 mg/mL 溶液，抽慮滅菌置 20冰箱中保存。四. 材料 E.coli.DH5 質(zhì)粒 DNA 五: 實驗步驟： (CaCl2) （20 人一班，分三組）第一天：從大腸桿菌 DH5 平板上挑取一個單菌落接于

7、2 mL LB 液體培養(yǎng)基的試管中 ,37振蕩培過夜。第二天：1. 取 0.5 mL 菌液轉(zhuǎn)接到一個含有 振蕩培養(yǎng)50 mL LB 液體培養(yǎng)基錐形瓶中， 3723 h(此時， OD 600 0.4-0.5 ，細胞數(shù)務(wù)必108mL。此為實驗成功的關(guān)鍵 )3. 將菌液轉(zhuǎn)移到 50 mL 離心管中，冰上放置 10 min。4. 離心 10 min（4000r/min）,回收細胞。 4學習好資料 歡迎下載5. 倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min 以便培養(yǎng)液流盡。6. 用冰冷的 0.1 mol/L CaCl2 10 mL 懸浮沉淀，立即放在冰上 30 min。7. 04 6000 r/min,離心 10 mi

8、n，回收細胞。8. 用冰冷的 0.1mol/L CaCl2 2 mL 懸浮細胞，（務(wù)必放在冰上）。9. 分裝細胞，每 200 L 一份。此細胞為感受態(tài)細胞。轉(zhuǎn)化：10. 取 200 L 新鮮制備的感受態(tài)細胞， 加入 DNA 2 L（50 ng ）混勻冰上 放置 30 min。同時作兩個對照管 受體菌對照： 200 L 感受態(tài)細胞 2 L 無菌水 質(zhì)粒對照： 200 L 0.1 mol/L CaCl2 溶液 2 L 質(zhì)粒 DNA 溶液 11 .將管放到 42循環(huán)水浴 12 min。12. 冰浴 2 min。13. 每管加 800 L LB 液體培養(yǎng)基， 37培養(yǎng) 1 h（慢搖）。14. 將適當體

9、積（ 200 L）已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞，涂在含有氨芐青霉素的 培養(yǎng)皿中。15. 倒置平皿 37培養(yǎng) 1216 h，出現(xiàn)菌落。16.計算轉(zhuǎn)化效率關(guān)于大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化講解：1、 感受態(tài)細胞的概念 重組 DNA 分子體外構(gòu)建完成后，必須導入特定的宿主（受體）細胞，使之無性繁殖并高效表達外源基因或直接改變其遺傳性狀，為重組 DNA 分子的轉(zhuǎn)化。這個導入過程及操作統(tǒng)稱在原核生物中，轉(zhuǎn)化是一個較普遍的現(xiàn)象，在細胞間轉(zhuǎn)化是否發(fā)生，一方面取決于供體菌與受體菌兩者在進化過程中的親緣關(guān)系，處于一種感受狀態(tài)有著很大的關(guān)系。所謂的感受態(tài)，即指受體（或者宿主）最易接受外源另一方面還與受體菌是否DNA 片段并

10、實現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)， 它是由受體菌的遺傳性狀所決定的，同時也受菌齡、 外界環(huán)學習好資料 歡迎下載境因子的影響。 cAMP 可以使感受態(tài)水平提高一萬倍，而 Ca 2+也可大大促進轉(zhuǎn)化的作用。細胞的感受態(tài)一般出現(xiàn)在對數(shù)生長期，新鮮幼嫩的細胞是制備感受態(tài)細 胞和進行成功轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。制備出的感受態(tài)細胞暫時不用時， 可加入占總體積 15%的無菌甘油或 -70保 存（有效期 6 個月）。2、 轉(zhuǎn)化的概念及原理 在基因克隆技術(shù)中， 轉(zhuǎn)化特指將質(zhì)粒 DNA 或以其為載體構(gòu)建的重組 DNA 導 入細菌體內(nèi)，使之獲得新的遺傳特性的一種方法。它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實驗技術(shù)之一。受體

11、細胞經(jīng)過一些特殊方法（如：電擊法，使細胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源CaCl2等化學試劑法）處理后，DNA 分子通過的感受態(tài)細胞。進入細胞的 DNA 分子通過復制、表達實現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細胞出現(xiàn)新的 遺傳性狀。大腸桿菌的轉(zhuǎn)化常用化學法（CaCl2 法），該法最先是由 Cohen 于 1972 年發(fā)現(xiàn)的。其原理是細菌處于 0，CaCl2 的低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物中的 DNA 形成抗 DNase的羥基 -鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，經(jīng) 42短時間熱沖擊處理， 促使細胞吸收 DNA 復合物，在豐富培養(yǎng)基上生長數(shù)小時后，球狀細胞復原并分裂增值， 被轉(zhuǎn)化的細菌中， 重組子

12、中基因得到表達， 在選擇性培養(yǎng)基平板上，可選出所需的轉(zhuǎn)化子。Ca 2+處理的感受態(tài)細胞， 其轉(zhuǎn)化率一般能達到5 10 62 10 7 轉(zhuǎn)化子 /ug 質(zhì)粒DNA ，可以滿足一般的基因克隆試驗。如在 Ca2+的基礎(chǔ)上，聯(lián)合其它的二價金屬離子（如 Mn 2+、Co 2+）、DMSO 或還原劑等物質(zhì)處理細菌，則可使轉(zhuǎn)化率提高1001000倍。化學法簡單、快速、穩(wěn)定、重復性好，菌株適用范圍廣，感受態(tài)細菌可以在-70保存，因此被廣泛用于外源基因的轉(zhuǎn)化。除化學法轉(zhuǎn)化細菌外，還有電擊轉(zhuǎn)化法，電擊法不需要預先誘導細菌的感受態(tài)，依靠短暫的電擊，促使DNA 進入細菌，轉(zhuǎn)化率最高能達到10 910 10轉(zhuǎn)化子/ug

13、 閉環(huán) DNA 。因操作簡便，愈來愈為人們所接受。3、 感受態(tài)細胞制備及轉(zhuǎn)化中的影響因素學習好資料 歡迎下載、細胞的生長狀態(tài)和密度最好從 -70或 -20甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細胞的菌液。不要用已經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接，及貯存在4的培養(yǎng)菌液。細胞生長密度以每毫升培養(yǎng)液中的細胞數(shù)在 5 10 7個左右為佳。 即應(yīng)用對數(shù)期或?qū)?shù)生長前期的細菌，可通過測定培養(yǎng)液的 OD600 控制。對 TG1 菌株，OD600為 05 時，細胞密度在 5 10 7 個/ml 左右。（應(yīng)注意 OD600值與細胞數(shù)之間的關(guān)系隨菌株的不同而不同）。密度過高或不足均會使轉(zhuǎn)化率下降。此外，受體細胞一般應(yīng)是限制-修飾系統(tǒng)

14、缺陷的突變株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。并且受體細胞還應(yīng)與所轉(zhuǎn)化的載體性質(zhì)相匹配。、質(zhì)粒 DNA 的質(zhì)量和濃度 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒 DNA 應(yīng)主要是超螺旋態(tài)的，轉(zhuǎn)化率與外源 DNA 的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當加入的外源DNA 的量過多或體積過大時，則會使轉(zhuǎn)化率下降。一般地，DNA 溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細胞體積的 5%，1ng 的 cccDNA即可使 50ul 的感受態(tài)細胞達到飽和。對于以質(zhì)粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉(zhuǎn)化效率低，實驗證明，大于 30kb 的重組質(zhì)粒將很難進行轉(zhuǎn)化。此外，重組DNA 分子的構(gòu)型與轉(zhuǎn)化效率也密切相關(guān)，環(huán)狀重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率較分子量相同的線性重組質(zhì)

15、粒高 10100 倍，因此重組 DNA 大都構(gòu)成環(huán)狀雙螺旋分子。、試劑的質(zhì)量所用的 CaCl2等試劑均需是最高純度的，并用最純凈的水配制，最好分裝保存于 4。、防止雜菌和雜 DNA 的污染整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進行，所用器皿，如離心管，移液槍頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理。所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA 酶或雜 DNA 所污染，否則均會影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA 的轉(zhuǎn)入。、整個操作均需在冰上進行，不能離開冰浴，否則細胞轉(zhuǎn)化率將會降低。學習好資料 歡迎下載河南科技大學實驗教學教案首頁實驗名稱實驗二、質(zhì)粒 DNA 的提取及其酶切實驗學時4 每次實驗組數(shù)6 每組人數(shù)5 實驗類型

16、驗證實驗?zāi)康暮鸵螅和ㄟ^本實驗學習和掌握堿裂解法提取質(zhì)粒 DNA。實 驗 設(shè) 備 及 器 材 ：微量移液器，微量離心管，常用玻璃器皿，恒溫培養(yǎng)箱，恒溫搖床，臺式離 心機，高壓滅菌鍋 實 驗 原 理 ：堿裂解法提取質(zhì)粒是根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA 與線性染色體 DNA 在拓撲學上的差異來分離它們。在 pH 值介于 12.012.5 這個狹窄的范圍內(nèi)，線性的DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性， 盡管在這樣的條件下， 共價閉環(huán)質(zhì)粒 DNA 的氫 鍵會被斷裂，但兩條互補鏈彼此相互纏繞， 仍會緊密地結(jié)合在一起。 當加入 pH4.8的乙酸鉀高鹽緩沖液恢復pH 至中性時，共價閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA 的兩條互補鏈仍

17、保持在一起，因此復性迅速而準確，而線性的染色體DNA 的兩條互補鏈彼此已完全分開， 復性就不會那木迅速而準確， 它們纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)， 通過離心，染色體 DNA 與不穩(wěn)定的大分子 被除去。實 驗 內(nèi) 容 ：用堿裂解法提取質(zhì)粒 DNA 學 生 實 驗 報 告 要 求 ：RNA ，蛋白質(zhì) SDS 復合物等一起沉淀下來而分 析 實 驗 的 每 一 個 步 驟 。注 意 事 項 ：1、 時 間 要 嚴 格 控 制 ； 2、 注 意 實 驗 所 用 的 溫 度 。學習好資料 歡迎下載實驗二、質(zhì)粒 DNA 的提取及其酶切實驗?zāi)康耐ㄟ^本實驗學習和掌握堿裂解法提取質(zhì)粒DNA 。實驗原理堿裂解法提取質(zhì)粒是根據(jù)共

18、價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA 與線性染色體DNA 在拓撲學上的差異來分離它們。在 pH 值介于 12.012.5 這個狹窄的范圍內(nèi)，線性的 DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性，盡管在這樣的條件下，共價閉環(huán)質(zhì) 粒 DNA 的氫鍵會被斷裂， 但兩條互補鏈彼此相互纏繞， 仍會緊密地結(jié)合在一起。當加入 pH4.8 的乙酸鉀高鹽緩沖液恢復 pH 至中性時，共價閉合環(huán)狀的質(zhì)粒 DNA 的兩條互補鏈仍保持在一起，因此復性迅速而準確，而線性的染色體 DNA 的兩條互補鏈彼此已完全分開， 復性就不會那木迅速而準確， 它們纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA 與不穩(wěn)定的大分子RNA，蛋白質(zhì) SDS 復合物等一起沉淀下來而

19、被除去。實驗儀器： 微量移液器，微量離心管，常用玻璃器皿，臺式高速離心機，分光光度計，恒溫培養(yǎng)箱，恒溫搖床，臺式離心機，高壓滅菌鍋。試劑及溶液：(1) 用堿法提取質(zhì)粒 DNA 溶液 1（GET 緩沖液）：50 mmol葡萄糖， 10mmol/L EDTA ，25mmol/LTris.HCI pH 8.o，用前加溶菌酶 4rngmL。溶液 2（變性液）：02 rnoI/I NaOH ，1 SDS。溶液 3（乙酸鉀溶液）：60 ml 的 5 molL KAc, 11.5 ml,冰醋酸， 28.5Ml H 2O。（2）緩沖液EcoR 酶解緩沖液（ l 0 ）TBE 緩沖液（I O ）：稱取 Tris

20、 108g,硼酸 55g, 0.5moIL, EDTA（pH8.o）40 ml，用 H2o 定容到 l000 ml，高壓滅菌作為 l 0 貯液 9 稀釋 1 0 倍后作為工作液使用。TE 緩沖液： 1 0 rnmolL Tris HCl， I mmolL EDTA pH 8.o，其中含有 RNase2 0 gmL。（3）上樣液及其他試劑 上樣液（ 6 ）：0.25溴酚藍 ,質(zhì)量濃度 40蔗糖水溶液。溴化乙啶染色液（ 10 rngm t）：在 20ml 水中溶解 0.2g 溴化乙啶，混勻后 4避學習好資料 歡迎下載光保存。異丙醇， 7 0乙醇等。實驗步驟（一）提取質(zhì)粒1. 將 2 ml 含相應(yīng)抗

21、生素的LB液體培養(yǎng)基加入試管中， 接入上述的含 pUC19質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落， 37振蕩培養(yǎng)過夜。2. 取培養(yǎng)物倒入微量1.5ml 離心管中， 4000 r/min 離心 2 min 。3. 棄上清，吸盡殘液，使細胞沉淀盡可能干燥。4. 加入 100ul 溶液，充分混勻，室溫放置10 min。加 200 ul 溶液 （新鮮配制 ），蓋緊管蓋，輕輕顛倒數(shù)次混勻，將離心管放冰上 5min。5. 加入 150ul 溶液 （ 冰上預冷 ），蓋緊管口，顛倒數(shù)次使混勻。冰上放置 15min。6. 12000 r/min , 離心 15 min ，將上清轉(zhuǎn)至另一離心管中。7. 加入等體積酚：氯仿（ 1：1

22、）（去蛋白），反復混勻， 12000 r/min ，離心 5 min ，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。8. 加入 2 倍體積無水乙醇，混勻后，室溫放置510 min 。12000r/min 離心 5 min 。倒去上清液，把離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體。9. 用 1 ml 70% 乙醇洗滌質(zhì)粒 DNA沉淀，振蕩并離心，倒去上清液，真空抽 干或空氣中干燥。10. 加 50 ul TE 緩沖液，其中含有20保存。（二） 酶切20 ug/ml 的胰 RNA酶，使 DNA完全溶解，取 DNA溶液，加酶切緩沖液， EcoRI 酶 1 ul ，無菌水補至總體積 10 ul ，37保溫 3h, 加終止液，準備

23、下個實驗電泳，分析質(zhì)粒DNA的限制性酶切圖譜。質(zhì)粒提取的關(guān)鍵問題即質(zhì)粒提取中三種溶液的作用：堿法質(zhì)粒抽提用到三種溶液：溶液 I ，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0 ； 溶液 II ，0.2 N NaOH / 1% SDS； 溶液 III ，3 M 醋酸鉀 / 2 M 學習好資料歡迎下載醋酸。 讓我們先來看看溶液I 的作用。 任何生物化學反應(yīng)， 首先要控制好溶液的 pH，因此用適當濃度的和適當 pH值的 Tris-Cl 溶液，是再自然不過的了。那么 50 mM葡萄糖是干什么的呢？說起來不可思議，加了葡萄糖后最大的好處只是懸浮后的大腸桿菌不會

24、快速沉積到管子的底部。因此，如果溶液 I 中缺了葡萄糖其實對質(zhì)粒的抽提本身而言，幾乎沒有任何影響。 所以說溶液 I 中葡萄糖是可缺的。那么 EDTA呢？大家知道 EDTA是 Ca 2+和 Mg 2+等二價金屬離子的螯合劑，配在分子生物學試劑中的主要作用是：抑制 DNase的活性， 和抑制微生物生長。在溶液 I 中加入高達 10 mM 的 EDTA，無非就是要把大腸桿菌細胞中的所有二價金屬離子都螯合掉。如果不加EDTA，其實也沒什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太長的時間里完成質(zhì)粒抽提，就不用怕 DNA會迅速被降解， 因為最終溶解質(zhì)粒的 TE緩沖液中有 EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液

25、I ，可不可以抽提質(zhì)粒呢？實話告訴你，只要用等體積的水，或 以了。LB培養(yǎng)基來懸浮菌體就可有一點不能忘的是，菌體一定要懸浮均勻，不能有結(jié)塊。輪到溶液 II 了。這是用新鮮的 0.4 N 的 NaOH和 2的 SDS等體積混合后使用的。要新從濃 NaOH稀釋制備 0.4N 的 NaOH，無非是為了保證 NaOH沒有吸收空氣中的 CO2而減弱了堿性。很多人不知道其實破細胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。事實上 NaOH是最佳 的溶解細胞的試劑， 不管是大腸桿菌還是哺乳動物細胞，碰到了堿都會幾乎在瞬間就溶解，這是由于細胞膜發(fā)生了從bilayer （雙層膜）結(jié)構(gòu)向 micelle （微囊）

26、結(jié)構(gòu)的相變化所導致。用了不新鮮的 0.4 N NaOH，即便是有 SDS也無法有效溶解大腸桿菌 （不妨可以自己試一下） ，自然就難高效率抽提得到質(zhì)粒。 如果只用 SDS當然也能抽提得到少量質(zhì)粒， 因為 SDS也是堿性的， 只是弱了點而已。很多人對NaOH的作用誤以為是為了讓基因組DNA變性，以便沉淀，這是由于沒有正確理解一些書上的有關(guān)DNA變性復性的描述所導致。 有人不禁要問，既然是 NaOH溶解的細胞，那為什么要加 SDS呢？那是為下一步操作做的鋪墊。這一步要記住兩點：第一，時間不能過長，千萬不要這時候去接電話，因為在這樣的堿性條件下基因組DNA片斷會慢慢斷裂； 第二，必須溫柔混合 （象對待

27、女孩子一樣），不然基因組DNA也會斷裂。基因組DNA的斷裂會帶來麻煩。學習好資料 歡迎下載每個人都知道， 溶液 III加入后就會有大量的沉淀， 但大部分人卻不明白這沉淀的本質(zhì)。 最容易產(chǎn)生的誤解是， 當 SDS碰到酸性后發(fā)生的沉淀。 如果你這樣懷疑，往 1%的 SDS溶液中加如 2M的醋酸溶液看看就知道不是這么回事了。大量沉淀的出現(xiàn)，顯然與SDS的加入有關(guān)系。如果在溶液II 中不加 SDS會怎樣呢，也會有少量的沉淀，但量上要少得多，顯然是鹽析和酸變性沉淀出來的蛋白質(zhì)。既然 SDS不是遇酸發(fā)生的沉淀， 那會不會是遇鹽發(fā)生的沉淀呢？在 1的 SDS溶液中慢慢加入 5 N 的 NaCl，你會發(fā)現(xiàn) S

28、DS在高鹽濃度下是會產(chǎn)生沉淀的。因此高濃度的鹽導致了 SDS的沉淀。但如果你加入的不是 NaCl 而是 KCl，你會發(fā)現(xiàn)沉淀的量要多的多。這其實是十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate）遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate, PDS），而 PDS是水不溶的， 因此發(fā)生了沉淀。 如此看來， 溶液 III加入后的沉淀實際上是鉀離子置換了 SDS中的鈉離子形成了不溶性的 PDS，而高濃度的鹽， 使得沉淀更完全。大家知道 SDS專門喜歡和蛋白質(zhì)結(jié)合， 平均兩個氨基酸上結(jié)合一個 SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白

29、質(zhì)沉淀了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組 DNA也一起被共沉淀了。這個過程不難想象，因為基因組 DNA太長了，長長的 DNA自然容易被 PDS給共沉淀了，盡管 SDS并不與 DNA分子結(jié)合。那么 2 M 的醋酸又是為什么而加的呢？是為了中和NaOH，因為長時間的堿性條件會打斷 DNA，所以要中和之。 基因組 DNA一旦發(fā)生斷裂， 只要是 50100 kb 大小的片斷，就沒有辦法再被PDS共沉淀了。所以堿處理的時間要短，而且不得激烈振蕩， 不然最后得到的質(zhì)粒上總會有大量的基因組 DNA混入，瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃的總 DNA條帶。很多人誤認為是溶液 III 加入后基因組 DNA無法快速復性就

30、被沉淀了，這是天大的誤會，因為變性的也好復性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本來是為了溶解細胞而用的，DNA分子的變性其實是個副產(chǎn)物， 與它是不是沉淀下來其實沒有關(guān)系。溶液 III 加入并混合均勻后在冰上放置，目的是為了PDS沉淀更充分一點。不要以為 PDS沉淀的形成就能將所有的蛋白質(zhì)沉淀了，其實還有很多蛋白質(zhì)不能被沉淀， 因此要用酚 / 氯仿 / 異戊醇進行抽提， 然后進行酒精沉淀才能得到質(zhì)量穩(wěn)定的質(zhì)粒 DNA，不然時間一長就會因為混入的DNase而發(fā)生降解。這里用2學習好資料 歡迎下載5/24/1 的酚/ 氯仿/ 異戊醇是有很多道理的，這里做個全面的介紹。酚（Phenol

31、）對蛋白質(zhì)的變性作用遠大于氯仿，按道理應(yīng)該用酚來最大程度將蛋白質(zhì)抽提掉，但是水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液 （比如 4M的異硫氰酸胍） ，離心后酚相會跑到上層， 不利于含質(zhì)粒的水相的回收； 但加入氯仿后可以增加比 重，使得酚 / 氯仿始終在下層，方便水相的回收；還有一點，酚與水有很大的互溶性，如果單獨用酚抽提后會有大量的酚溶解到水相中，而酚會抑制很多酶反應(yīng)（比如限制性酶切反應(yīng)） ，因此如果單獨用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次將水相中的酚去除，而用酚 / 氯仿的混合液進行抽提，跑到水相中的酚則少得多，微量的酚在乙醇沉淀時就會被除干凈而不必擔心酶切等反應(yīng)不能正常進行。至于異戊醇的添加，

32、其作用主要是為了讓離心后上下層的界面更加清晰，也方便了水相的回收。回收后的水相含有足夠多的鹽， 因此只要加入 2 倍體積的乙醇， 在室溫放置幾分鐘后離心就可以將質(zhì)粒DNA沉淀出來。這時候如果放到 20，時間一長反而會導致大量鹽的沉淀， 這點不同于普通的 DNA酒精沉淀回收， 所以不要過分小心了。高濃度的鹽會水合大量的水分子，生沉淀。如果感覺發(fā)生了鹽的沉淀，就用因此 DNA分子之間就容易形成氫鍵而發(fā) 70的乙醇多洗幾次，每次在室溫放置一個小時以上， 并用 tip 將沉淀打碎， 就能得到好的樣品。 得到的質(zhì)粒樣品一 般用含 RNase（50 ug/ml ）的 TE緩沖液進行溶解，不然大量未降解的

33、RNA會干 擾電泳結(jié)果的 . 學習好資料 歡迎下載河南科技大學實驗教學教案首頁實驗名稱6 實驗三、瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)5 實驗學時4 每次實驗組數(shù)每組人數(shù)實驗類型驗證實驗?zāi)康暮鸵螅和ㄟ^本實驗學習瓊脂糖凝膠電泳檢測實 驗 設(shè) 備 及 器 材 ：DNA的方法和技術(shù)。恒 溫 培 養(yǎng) 箱 ，瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 ，臺 式 離 心 機 ，高 壓 滅 菌 鍋 ，紫 外 線 投 射 儀 器 。實 驗 原 理 ：DNA 分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA 分子在高于等電點的pH 溶液中帶負電荷在電場中向正極移動。由于糖磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈 DNA 幾乎具有等量的

34、凈電荷，因此他們能以相同的速度向正極方向移動。在一定的電場強度下，DNA 分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即 DNA 分子本身的大小和構(gòu)型。具有不同的相對分子質(zhì)量的 DNA 片段泳動速度不一樣，可進行分離。DNA 分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量對數(shù)值成反比關(guān)系 .。凝膠電泳不僅可以分離不同相對分子質(zhì)量的 DNA, 也可以分離相對分子質(zhì)量相同 ,但構(gòu)型不同的 DNA 分子。如上次實驗提取的 pUC19 質(zhì)粒，有 3 種構(gòu)型：超螺旋的共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒 DNA(covalently closed circular DNA ，簡稱CCCDNA) ，開環(huán)質(zhì)粒 DNA ，即共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒 DNA1 條鏈斷

35、裂，（open circular DNA, 簡稱 OCDNA ）,線狀質(zhì)粒 DNA ，即共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA2 條鏈發(fā)生斷裂， （linear DNA ，簡稱 L DNA ）。這 3 種構(gòu)型的質(zhì)粒 DNA 分子在凝膠電泳中的遷移率不同。因此電泳后呈 3條帶，超螺旋質(zhì)粒 DNA 泳動最快，其次為線狀 DNA ，開環(huán)質(zhì)粒 DNA 。實 驗 內(nèi) 容 ：利 用 電 泳 技 術(shù) 分 離 已 經(jīng) 酶 切 過 的 質(zhì) 粒 DNA. 學 生 實 驗 報 告 要 求 ：要 求 星 期 一 做 完 實 驗 后 ， 星 期 五 交 上 ， 實 驗 結(jié) 果 要 有 圖 示 。注 意 事 項 ：1、 注 意 瓊 脂

36、糖 的 濃 度 ， 2、 用 溴 化 乙 錠 染 色 時 要 戴 上 手 套 。學習好資料 歡迎下載實驗三 瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)實驗?zāi)康?通過本實驗學習瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的方法和技術(shù)。實驗原理 DNA 分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點的 pH 溶液中帶負電荷在電場中向正極移動。由于糖磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA 幾乎具有等量的凈電荷，因此他們能以相同的速度向正極方向移動。在一定的電場強度下，DNA 分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA 分子本身的大小和構(gòu)型。具有不同的相對分子質(zhì)量的 DNA 片段泳動速度不一樣， 可進行分離。

37、DNA 分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量對數(shù)值成反比關(guān)系 .。凝膠電泳不僅可以分離不同相對分子質(zhì)量的 DNA, 也可以分離相對分子質(zhì)量相同 ,但構(gòu)型不同的 DNA 分子。如上次實驗提取的 pUC19質(zhì)粒，有 3 種構(gòu)型：超螺旋的共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA(covalently closed circular DNA ，簡稱 CCCDNA) ，開環(huán)質(zhì)粒 DNA ，即共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒 DNA1 條鏈斷裂，（open circular DNA, 簡稱 OCDNA ） ,線狀質(zhì)粒DNA ，即共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA2 條鏈發(fā)生斷裂，（linear DNA ，簡稱 L DNA ）。這 3 種構(gòu)型的質(zhì)粒 DNA 分

38、子在凝膠電泳中的遷移率不同。因此電泳后呈3 條帶，超螺旋質(zhì)粒DNA 泳動最快，其次為線狀 DNA ，開環(huán)質(zhì)粒 DNA 。 儀器、材料與試劑 一、儀器 1.恒溫培養(yǎng)箱 2.瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng) 3.臺式離心機 4.高壓滅菌鍋 5.紫外線透射儀 二、材料 1.三羥甲基氨基甲烷 (Tris) 2.硼酸 3.乙二胺四乙酸 (EDTA) 4.溴酚藍 5.蔗糖 6.瓊脂糖學習好資料 歡迎下載7.溴化乙錠8.DNA marker 實驗步驟 (一)制備瓊脂糖凝膠電泳槽及用膠量：稱取0.3g 瓊脂糖，放入錐形瓶中，加入30ml0.5 TBE緩沖液，置微波爐或水浴加熱至完全溶化取出搖勻，則為 冷卻至 60, 加入適

39、量 EB, 混勻。（二）膠板的制備1%的瓊脂糖凝膠液。1. 取有機玻璃內(nèi)槽，洗凈，晾干，用橡皮膏將有機玻璃內(nèi)槽的兩端邊緣 封好（ 一定封嚴，不能留縫隙 ）。2. 將有機玻璃內(nèi)槽放置于一水平位置，并放好樣品梳子。梳子調(diào)整齊 3. 將冷到 60左右的瓊脂糖凝膠液，緩緩倒入有機玻璃內(nèi)槽，直至有機玻璃板上形成一層均勻的膠面（注意不要形成氣泡 ）。4. 待膠凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，將膠槽放在電泳槽內(nèi)。5. 加入電泳緩沖液至電泳槽中。（三）加樣, 用移液器將已加入上樣緩沖液的 順序及點樣量 ）。（四）電泳DNA 樣品加入樣品孔 （記錄點樣1. 接通電泳槽與電泳儀的電源（注意正負極， DNA 片段從負

40、極向正極移動）。DNA 的遷移速度與電壓成正比，最高電壓不超過 5 V/cm。2. 當溴酚藍染料移動到距凝膠前沿（五）染色12cm 處，停止電泳。將電泳后的凝膠浸入溴化乙錠染色液中，染色以觀察在瓊脂糖凝膠中的帶（戴手套操作）。問題討論 1）在細胞內(nèi)質(zhì)粒 DNA 是共價閉環(huán) DNA （covalently closed circular DN A ，學習好資料 歡迎下載cccDNA），常以超螺旋形式存在。如果兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處缺刻，分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，這種松弛型的分子叫作開環(huán) DNA（open circular DNA ，ocDNA ）；若兩條鏈在同一處或其附近斷裂，則變成性

41、狀 D N A 分子。在電泳時，同一質(zhì)粒的電泳速度因 DNA 的構(gòu)型不同而異，其次序為：cccDNA直線 DNA ocDNA ，因此在本次實驗中瓊脂糖凝膠電泳上的自制質(zhì)粒呈現(xiàn) 3 條帶。如果你不小心在溶液II（實驗二）加入后過度振蕩，會有第四條帶，這條帶泳動得較慢，遠離這三條帶，是 20-100kb 的大腸桿菌基因組 DNA 的片斷。非常偶然的是，有時候抽提到的質(zhì)粒會有 710 條帶，這是由于特殊的 DNA 序列導致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈數(shù)不同）所致。2）瓊脂糖是一種從海藻中提取出來的線狀高聚物，當熔化再凝固后就會形成固體基質(zhì)， 其密度取決于溶液中所含瓊脂糖的量。帶負電荷的核酸就可以在

42、這種基質(zhì)中。于電場的作用下向陽極移動。 核酸在瓊脂糖基質(zhì)中的遷移率取決于下列參數(shù)： DN A 的分子大小；瓊脂糖的濃度；DNA 的構(gòu)象；所加電壓；電場方向；堿基組成與溫度；嵌入的染料；電泳緩沖液的組成等。瓊脂糖濃度對核酸遷移率的影響是：一定大小的DNA 片段，在不同濃度的瓊脂糖凝膠中的遷移率不同； 在一定濃度的瓊脂糖凝膠能夠分辨的核酸片段大小范圍內(nèi)，核酸片段的遷移率與其相對分子質(zhì)量大小相反。3）溴化乙啶的化學名稱是3， 8二氨基 r乙基 6 一苯基菲錠溴鹽（ 3，S diamino 5 ethyl 6 phenyl phenanthridinium bromide ， 簡 稱 Ethidium

43、Bromide 或 EB 或 EtBr），由于溴化乙錠分子插入，在紫外光的照射下，瓊脂糖凝膠電泳中 DNA 的條帶呈現(xiàn)出桔黃色的熒光， 便于檢測。EB 能插人 DNA分子中的堿基對之間，完成與DNA 結(jié)合（超螺旋 DNA 與 EB 結(jié)合能力小于雙鏈閉環(huán)，而雙鏈閉環(huán)DNA 與 EB 結(jié)合能力小于線狀雙鏈DNA），DNA 所吸收的260nm 的紫外光（ UV ）傳遞給 FE，或者結(jié)合的 EB 本身在 3O0nm 和 360nm 吸收的射線均在可見光譜的紅橙區(qū)，以 點：操作簡便快速，室溫下染色590nm 波長發(fā)射出來。 EB 染色具有以下特 15mm20mm；不會使核酸斷裂；靈敏度高，10ng 或更

44、少的 DNA 即可檢出；可以加到樣品中，隨時用紫外吸收追蹤 檢查。但應(yīng)該特別注意的是，溴化乙啶是誘變劑，配制和使用時應(yīng)戴乳膠（或一 次性塑料） 手套，并且不要將該染色液灑在桌面或地面上。凡是沾污溴化乙啶的學習好資料 歡迎下載器皿或物品，必須經(jīng)特殊處理后，再進行清洗或棄去。河南科技大學實驗教學教案首頁實驗名稱學習好資料歡迎下載實驗學時4 實驗四植物基因組DNA 的提取每次實驗組數(shù)6 每組人數(shù)5 實驗類型驗證實驗?zāi)康暮鸵螅和ㄟ^本實驗學習從植物組織中提取 DNA的方法。實 驗 設(shè) 備 及 器 材 ：低 溫 離 心 機 ，臺 式 離 心 機 ，恒 溫 水 浴 鍋 ，紫 外 分 光 光 度 計 ，液 氮 灌 等 。實 驗 原 理 ：利用液氮對植物組織進行研磨， 從而破碎細胞。 細胞提取液中含有的 SDS溶解膜蛋白而破壞細胞膜，