1、腫瘤精準醫療之ctDNA檢測上海交通大學附屬胸科醫院檢驗科 婁加陶E-mail: 1血漿是健康的風向標 Diza JCO 2014自體免疫疾病腫瘤器官移植排異運動 （比如馬拉松）孕婦胚胎急性器官損傷 (中風，心肌梗塞，胰腺炎等）Liquid Biopsy四大類CTCcf-DNAct-DNAMicroRNAExosomeProtein/peptides循環腫瘤DNA（ctDNA） Mandel等1940s首次報道胞外核酸（cell-free nucleic acids, cfDNA）(1000-2000 copies/ml) ctDNA是由腫瘤細胞釋放入血的cfDNA（約0.1-1%） 讀取分析

2、ctDNA攜帶的信息（突變、表觀遺傳修飾及完整性），用于篩查、預后和進展判斷，尋找干預策略Schwarzenbach H, Nat Rev Cancer, 2011Nature ReviewsCancerNecroptosisApoptosisSecretioncfDNA的特點Taniguchi et. al., Clin Cancer Res (2011)In-house dataNewman et. al., Nat Med (2014)總量少 1000023(27%)48(56%)5(6%)6(7%)0(0%)3(3%)0(0%)1(1%)片段小 集中在170bp左右800,000600

3、,000400,000200,0000100150200250300MedianFragment length (bp)FrequencyDNA copies/200uL plasma (N=86)Number of samples (%) ctDNA豐度低Fraction of EGFR mutant in total cfDNANumber of EGFR M+ plasma samplesactivating mutations, N=32T790M, N=11141210864200.01%-0.1%0. 1%-1%1%-10%10%63135736ctDNA的生物學特征攜帶有腫瘤特異

4、性的遺傳學改變:SNV、CNV、InDel、SV顯著的片段化特征：166bp實時變化，半衰期短:2h含量低，不同癌癥及個體間差異明顯代表腫瘤的全局信息:原位+轉移6Nature Medicine 20, 548554(2014)Chetan Bettegowda et al., Sci Transl Med 2014;6:224ra24ctDNA更全面的反應腫瘤的分子異質性TumorMetastasis Tumor a single snapshotspatial selection bias ctDNAcfDNA的研究歷史Siravegna and Bardelli Genome Biolo

5、gy 2014, 15:449ctDNA多種檢測技術Heitzer et al. Clin Chem, 2015ctDNA檢測方法10檢測內容：濃度/含量+腫瘤特異性分子遺傳學改變分類基于PCR的檢測方法基于NGS的技術特點針對少量已知突變靶向多基因的未知遺傳學變異舉例ARMS-PCRTAM-Seqdigital PCRCAPP-SeqBEAMingcSMART敏感性高低ctDNA的檢測方法ARMS-PCR(super/plus+)11ARMS是目前最為成熟和常用的血液EGFR基因突變檢測的方法；優點：檢測敏感性高，達1%；缺點：只能檢測已知類型突變； 隨檢測位點的增加，非特異性結合概率及對D

6、NA模板量的需求會增加。Digital PCR 12優點缺點直接絕對定量目標拷貝數只能針對確定的SNP位點不受擴增效率影響，對PCR抑制物耐受性強每個病人都要設計個性化探針敏感性極高，適合在復雜背景中檢測稀有突變可同時檢測位點的通量較低 BEAMing13Devin Dressman et al. PNAS 2003;100:8817-8822優點：直接準確定量已知位點的突變發生率缺點：需要定制個性化的探針四種不同血漿檢測方法的性能比較Kenneth S et al. Lung Cancer, 2015, 90(3):509-515ARMS 平臺數字PCR平臺14靶向深度測序技術雜交法 (hy

7、bridization based)RNA (Agilent SureSelect)DNA (Roche/NimbleGen EZ SeqCap, IDT xGen LockDown)擴增法 (amplification based)AmpliSeq (Thermo/LifeTech)Padlock/MIP/Heat-Seq (Roche)Selector/Haloplex (Agilent)GoldenGate (Illumina)AMP (ArcherDX)RainDanceFluigidm Access ArrayCost, scalability robustness, batch s

8、ize, automation, sensitivity, input materials, uniformity, quantification accuracy 控制背景噪音是關鍵7/25/202217樣本準備文庫制備NGS測序數據分析2013_NGS-ACMG_GinM雜交法和擴增法對比TAM-Seq（tagged-amplicon deep sequencing）突變頻率檢出率可達2%敏感性和特異性高于97%Tim Forshew et al., Sci Transl Med 2012;4:136ra6818ConfidentialCAPP-Seqcancer personalized

9、 profiling by deep sequencing(COSMIC)19Selector 區域： 139個基因的521個外顯子和13個內含子，約125K，占人基因組的0.004%檢出率： Stage I 檢出率50% Stage II-IV 檢出率100% NSCLC檢出率96% 突變檢出率0.02%CAPP-Seq20ConfidentialcSMART技術Clinical Chemistry 2015; v. 61, p.172-181.優點：操作簡單，靈敏度高，可以檢測突變和簡單的融合模式；缺點：引物設計過于復雜，只能檢測有限的幾個位點，通量小，應用受限；21 ctDNA 檢測技術

10、對比檢測方法技術分辨率定量結果重復性(CV)*多突變Panel檢測新發突變檢測PCR平臺ARMS-PCR1/100N/A否否ddPCR1/100020%否否BEAMing1/100020%否否NGS平臺PCR擴增子測序1/10020%是是捕獲測序1/500010%是是cSMART1/100005%是是ctDNA的臨床應用早期篩查治療反應評估預后復發監測靶向治療血ctDNA的含量監測腫瘤負荷及動態發展，微小殘余病變、評估疾病預后；ctDNA的遺傳學變異個體化用藥、治療反應、復發、休眠性克隆等23ctDNA: specific aimsTumor genotyping complementary

11、to tissue biopsyDetecting minimal residual disease(MRD): longitudinal trackingResistance surveillance: relapse warning, drug selectionPredictive/diagnostic value (+ methylation etc.)ctDNA含量檢測預后晚期早期殘余病變？隨后的22個月病人表現出無疾病狀態放化療有效？7個月之后死于NSCLC一個隱匿性的微小病變？殘余腫瘤?or 放療后炎癥反應？在接下來隨訪的21個月里均為無疾病狀態隨訪到35個月均為無疾病狀態，治愈

12、25Nature Medicine 21,795-801(2015)ctDNA遺傳學變異檢測實時調整個體化用藥方案根據ctDNA中KRAS mutation 的濃度調整anti-EGFR 的劑量間歇療法26ctDNA遺傳學變異追蹤耐藥突變Geoffrey R. Oxnard et al. Clin Cancer Res 2014;20:1698-1705 EGFR敏感性突變 T790M耐藥性突變27Remon J, et al. Future Oncol, 2015.NSCLC靶向治療分子靶點PatientsBiopsy Site 1T790M /Biopsy Site 2T790M /Pat

13、ient 1 Lung tumorBrain tumorPatient 2 Lung tumorBrain tumorPatient 3Lung tumorCSFPatient 4Pleural effusionCSFPatient 5Pleural effusionCSFPatient 6Pleural effusionCSFPatient 7Pleural effusionCSFPatient 8Pleural effusionCSFPatient 9Pleural effusionCSFPatient 10Pleural effusionCSFPatient 11Pleural effu

14、sionCSFPatient 12Pleural effusionCSFPatient 13Lung tumorCSFPatient 14Lung tumorCSFPatient 15Lung tumorCSFPatient 16Lung tumorCSFPatient 17Pleural effusionCSFPatient 18Pleural effusionCSFPatient 19Pleural effusionCSFPatient 20Pleural effusionCSFPatient 21Pleural effusionCSFPatient 22Clavicular LNCSFP

15、atient 23Lung tumorPleural effusionPatient 24Lung (primary)Lung (meta)Patient 25Lung tumorPleural effusionPatient 26Lung tumorPleural effusionPatient 27Abdominal LNSkin tumorPatient 28Lung tumorPleural effusionPatient 29Lung tumorClavicular LNPatient 30Lung tumorPericardial effusion腦部胸部總計+-+202-1010

16、20總計121022 一致性 :12/22（55%） 其中22例匹配的胸部和腦部標本30位TKI耐藥后接受多位點再次活檢患者的T790M狀態T790M組織檢測的空間異質性Akito Hata, et al. JTO, 2015 :代表接受TKI治療；：代表停止TKI治療A ：阿法替尼；III ：三代TKI；B ：貝伐單抗；H-E：高劑量erlotinib；G：易瑞沙24例(12例胸部、6例CSF，6例胸水)使用TKI前后均檢測T790M突變狀態 5位患者停止TKI治療一段時間后，T790M狀態從陽性變成陰性 1位患者在接受高劑量的厄洛替尼后腦脊液的T790M由陰性轉陽性T790M組織檢測的時間

17、異質性Akito Hata, et al. JTO, 2015EGFR基因突變血檢共識2014年歐洲藥品管理局：當難以獲取腫瘤組織樣本時，可采集外周血作為補充標本評估EGFR基因突變，以明確吉非替尼治療中受益的患者2015年NSCLC血液EGFR基因突變檢測中國專家共識：腫瘤組織仍是優先選擇的生物樣本，但難以獲取時血液可作為合適的替代生物材料WT: 10000MT: 10000WT: 10000MT: 1000WT: 10000MT: 500WT: 10000MT: 100WT: 10000MT: 50WT: 10000MT: 10WT: 10000MT: 5WT: 10000MT: 1數字P

18、CR檢測ctDNA T790M突變線性評估將1、5、10、50、100、500、1000、10000個拷貝的含有T790M突變的H1975細胞基因組DNA加入到10000個拷貝的含有野生型EGFR的A549細胞基因組DNA中，根據檢測到的突變型拷貝數建立數字PCR拷貝數和突變比例的檢測線性范圍。數字PCR檢測ctDNA T790M突變線性評估Theoretical copies Measured copies Expected mutant%Observed mutant%R2=0.9998R2=0.993拷貝數的線性范圍突變比例的線性范圍數字PCR檢測ctDNA T790M突變空白限設定False positive droplet eventsNormalized countT790M設定為1LOB：以泊松分布95%的置信區間為上限 利用20例健康體檢者的cfDNA進行檢測，將泊松分布的95%置信