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1、基因定位的方法一定義基因所屬連鎖群或染色體以及基因在染色體上的位置的測(cè)定。基因定位是遺傳學(xué)研究中的重要環(huán)節(jié)。在遺傳學(xué)的早期研究中并未發(fā)現(xiàn)果蠅等 生物的基因在染色體上的位置和生理功能有什么關(guān)系。但以后發(fā)現(xiàn)一些有類似表 型效應(yīng)的基因是緊密連鎖的。例如1945年E.B.劉易斯在果蠅中發(fā)現(xiàn)與中胸發(fā)育 有關(guān)的幾個(gè)基因相鄰接,構(gòu)成一個(gè)復(fù)合座位或稱基因復(fù)合體或擬等位基因系列; 1960年J.莫諾和F.雅各布報(bào)道大腸桿菌的與乳糖發(fā)酵有關(guān)的幾個(gè)基因緊密連 鎖,構(gòu)成一個(gè)操縱子。可見(jiàn)基因的位置并不是和它們的功能完全無(wú)關(guān)的,因此基 因定位有助于了解基因的功能。此外,測(cè)定了某一基因在某一染色體上的位置以 后,便可以用這
2、一基因作為所屬染色體或其一部分的標(biāo)記,追蹤并研究染色體的 行為。例如通過(guò)分析大腸桿菌的接合過(guò)程中各個(gè)標(biāo)記基因在受體菌株中出現(xiàn)的先 后次序,就有助于了解接合過(guò)程中染色體的行為(見(jiàn)細(xì)菌接合);在許多生物中根 據(jù)雜交子代中各個(gè)標(biāo)記基因的組合,可以研究染色體干涉、染色單體干涉和染色 體畸變;在育種工作中也經(jīng)常通過(guò)標(biāo)記基因來(lái)識(shí)別染色體的替換。1913年C.B. 布里奇斯首先在果蠅中通過(guò)X染色體的不離開(kāi)現(xiàn)象證實(shí)了白眼基因(white,w) 是在X染色體上。同年A.H.斯特蒂文特根據(jù)兩個(gè)基因之間的距離愈遠(yuǎn)則交換頻 率愈高這一假設(shè),首先在果蠅中進(jìn)行了基因定位工作。二基因所屬連鎖群或染色體的測(cè)定(一)系譜分析法
3、通過(guò)分析、統(tǒng)計(jì)家系中有關(guān)性狀的連鎖情況和重組率而進(jìn)行基因定位的方法。其 中連鎖分析法是最常用的家系分析法(pedigree method)。早在20世紀(jì)30年代, 通過(guò)家系分析法已將人類的綠色盲、GD、紅色盲、血友病A的基因定位在X染 色體上。如果某性狀只出現(xiàn)在男性,則可將決定這個(gè)性狀的基因定位在Y染色體上。X連鎖基因的定位根據(jù)伴性遺傳原理,男性的X染色體總是來(lái)自他的母親, 而這條X染色體又總是傳給他的女兒,所以在正常情況下在X染色體上的基因不 會(huì)出現(xiàn)直接從男性到男性的傳遞方式,而是隔代交叉遺傳,亦即外祖父出現(xiàn)的某 種性狀在母親身上不出現(xiàn)(當(dāng)外祖母為純合正常時(shí)),往往出現(xiàn)在其外孫身上。如 果兩
4、個(gè)性狀都表現(xiàn)為隔代交叉遺傳,則可以判定這兩個(gè)性狀的基因都在X染色體 上,或可以說(shuō)這兩個(gè)基因是性連鎖的。但這種方法不能確定其排列順序和連鎖強(qiáng) 度。外祖父法在確定X染色體的連鎖關(guān)系后,進(jìn)一步確定其相對(duì)距離,但這一步 必須測(cè)定重組率才可完成。根據(jù)雙親的基因型來(lái)判斷子代中哪些是重組體,哪些 是親本型才可計(jì)算重組率。對(duì)于X染色體上的基因來(lái)說(shuō),只需要知道母親的基因 型是否為雙重雜合體(即兩對(duì)基因都處于雜合狀態(tài))。根據(jù)雙重雜合體的母親所生 兒子中有關(guān)性狀的重組情況,就可以估計(jì)重組率,而母親X染色體上的基因組成, 可以由外祖父的表型得知,因此,這種基因定位的方法稱為外祖父法(grandfather metho
5、d)。就Aa、Bb兩對(duì)連鎖基因而言,母親為雙重雜合體時(shí), 可能有兩種連鎖相:互引相AB / ab(或稱順式相cis phase)和互斥相Ab/ aB(或稱反式相trans phase)。現(xiàn)以人類X連鎖的色盲基因(a)和蠶豆病基因(GPD-)(g)為例說(shuō)明外祖父法: 6誰(shuí)親* 11 ;或i11 &II兒子 G. Y;|丫Y g | T正常 色盲,蠶豆病蠶豆病色拿(1)若X染色體沒(méi)有重組交換,則不論母親是順式還是反式雜合體,其兒子中的X染色體只有兩種類型(2)若母親的X染色體的兩個(gè)基因間發(fā)生了交換根據(jù)外祖父的表型確定作為母外祖父母親成重雜舍子兒子釧;Yag7A gYaG.Y怎引相)正常色盲、蠶豆病
6、色盲重蛆型.aY*aYA:Y怎引相)正常色盲、蠶病色盲重蛆型Y agY山:斥相)正常色盲、蠶豆病色苞重蛆型親的雙重雜合體的連鎖相(反式或順式),然后判斷其兒子中的各種表型中哪種屬 于重組型,統(tǒng)計(jì)其重組體所占的比例,就可計(jì)算兩個(gè)基因間的重組率,繼而確定 連鎖基因間的相對(duì)距離。根據(jù)這種外祖父法測(cè)得色盲基因與GPD基因間的相對(duì) 距離約為5cM(平均每20個(gè)兒子中有一個(gè)重組體)。 6家系分析法在原則上也可用于常染色體上的基因定位。當(dāng)已知某染色體上的某種 標(biāo)記與某基因間的連鎖關(guān)系后,就可以用家系分析法將該基因定位在這條染色體 上。如決定Duffy血型的基因就是這樣定位在人的1號(hào)染色體上的,這也是第一 個(gè)
7、用這種方法定位在常染色體上的基因。(二)非整倍體測(cè)交法非整倍體測(cè)交法可以用來(lái)測(cè)定基因?qū)儆谀囊粋€(gè)常染色體。用常染色體隱性突變型純合體(a/a)和野生型二倍體(+/+)雜交,再用子一代雜 合體(a/+)和隱性親本回交,在它們的子代中表型是野生型的和表型是突變型的 各占50%(見(jiàn)孟德?tīng)柖桑ks交 a/aX+/+!回交a/+Xa/a!回交子代a/aa/+突變型野生型比例1.1如果常染色體隱性突變型純合體和某一染色體的野生型三體(+/+/+)品系(見(jiàn)染 色體畸變)雜交,子一代中的三體個(gè)體再和隱性親本回交,在它們的子代中野生 型和突變型之比是5 : 1而不是1 : 1。a/a +/+卜回交1/+/+ X
8、 ays回整子代/1ay+fl/t /+旦,邑7E1I野主型夾變里比楓5:1如果常染色體隱性突變型純合體和某一染色體的野生型單體品系(+)雜交,在子 一代中就出現(xiàn)50%的突變型個(gè)體,而不是100%的野生型。雜交a/aX+!子一代a/+a野生型突變型比例11根據(jù)上述三種不同的雜交結(jié)果,可見(jiàn)只要具備相當(dāng)于每一染色體的一系列三體和 單體品系,便能從雜交子代的突變型和野生型的比數(shù)中判斷任何一個(gè)突變基因所 屬的染色體。小麥?zhǔn)嵌啾扼w植物,多倍體植物增加或減少一個(gè)染色體不會(huì)使它的 生活力受到嚴(yán)重的影響,因此容易建立整套三體或單體品系,使基因定位工作得 以順利進(jìn)行。除了小麥等植物以外,這一方法也用在酵母菌的遺
9、傳學(xué)研究中。(三)四分體分析法四分體定義:由于子囊菌減數(shù)分裂所形成的四分體包被在一個(gè)子囊里,所以判斷兩個(gè)基因 是否連鎖,只需計(jì)算出各種類型的四分體數(shù)(即子囊數(shù))。如果其中一個(gè)基因所 屬的連鎖群已經(jīng)知道,便很容易測(cè)定另一基因是否屬于同一連鎖群。四分體有三種,即親代二型(PD)、非親代二型(NPD)和四型(T)。如果有關(guān)的兩個(gè) 基因是連鎖的,即PD是不交換或二線雙交換的結(jié)果,NPD是四線雙交換的結(jié)果, T是單交換或三線雙交換的結(jié)果(見(jiàn)連鎖和交換)。如果有關(guān)的兩個(gè)基因是不連 鎖的,那么雙基因雜交子代中所出現(xiàn)的四分體類型要看這兩個(gè)基因各自和著絲粒 之間是否發(fā)生交換而定(表1)。根據(jù)這些關(guān)系,可以得到這
10、樣的規(guī)律:在雙基因雜交子代的四分體類型中如果 PD數(shù)大大地超出NPD數(shù)而且T多而NPD少,那么這兩個(gè)基因是連鎖的,如果PD 數(shù)和NPD數(shù)接近而且T少而NPD多,那么是不連鎖的,一般把NPD/T的比值大于或 小于1/4作為判斷的標(biāo)準(zhǔn)。(四)連鎖群法利用近著絲粒距離基因的定位法如果某一染色體上有一個(gè)離著絲粒距離較近的已知基因,另外有一個(gè)基因同 樣離著絲粒很近,可是不知道它是否屬于同一染色體。把這樣兩個(gè)突變型品系進(jìn) 行雜交,如果這兩個(gè)基因?qū)儆谕蝗旧w,它們之間的重組頻率不應(yīng)超過(guò)兩者的 著絲粒距離之和;如果它們不屬于同一染色體,那么它們的重組頻率應(yīng)是50%。 由于這兩個(gè)基因與著絲粒距離都是較近的,所
11、以增加了這一判斷的可靠性。用這 一方法曾測(cè)得粗糙脈孢菌的連鎖群數(shù)是7。(五)同線法如果一個(gè)細(xì)胞得到或丟失一條染色體則將同時(shí)得到或失去這條染色體上的 全部基因。如果其中某些基因是已知的,而另一連鎖關(guān)系未知的基因恰恰和上述 基因同時(shí)得到或失去,便可以判定后一基因和前一基因?qū)儆谕贿B鎖群。1、對(duì)象:人的細(xì)胞鼠類:大鼠、小鼠、倉(cāng)鼠仙臺(tái)病毒或聚乙二醇能促使人的體細(xì)胞和嚙齒類動(dòng)物的體細(xì)胞相融合2、雜種細(xì)胞的特點(diǎn):在繁殖傳代過(guò)程中,人的染色體優(yōu)先丟失,以至最后只剩幾條或一條人的染 色體,而嚙齒類的染色體被保留下來(lái)。3、原理:細(xì)胞進(jìn)行融合時(shí),培養(yǎng)液中只有部分細(xì)胞融合成雜種細(xì)胞,還有大量未融合 的雙親細(xì)胞。這就
12、需要選擇分離純化雜種細(xì)胞。為此要?jiǎng)?chuàng)造一種只讓雜種細(xì)胞生 長(zhǎng)繁殖而親本細(xì)胞死亡的環(huán)境。這就要利用雜種細(xì)胞和親本細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)條件的要 求和代謝的差異來(lái)進(jìn)行選擇。其中最常用的是HAT選擇系統(tǒng)。4、HAT選擇系統(tǒng):人的突變細(xì)胞株(缺乏HGPRT酶)和小鼠細(xì)胞株(缺乏TK酶)兩者融合培 養(yǎng)于HAT培養(yǎng)基中。(?HAT培養(yǎng)基:H為次黃嘌吟,是HGPRT的底物,為DNA合成提供原料(核苷酸旁路合 成原料)A可阻斷正常的DNA合成(嘌吟及TMP合成受抑制)T在胸苷激酶(TK)的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸,為DNA合成提供原 料因此人細(xì)胞:由于A的存在,正常的DNA合成通路受阻。同時(shí)由于HGPRT的缺乏,無(wú)法利用次
13、黃嘌吟通過(guò)旁路合成DNA (嘌吟 合成障礙)鼠細(xì)胞:由于A的存在正常的DNA合成通道受阻。有HGPRT可以利用次黃嘌吟合成腺嘌吟,鳥嘌吟,但由于無(wú)TK,無(wú)法 合成胸腺嘧啶。(嘧啶合成障礙)雜種細(xì)胞有HGPRT旁路合成腺嘌吟,鳥嘌吟;并可以利用TK合成胸腺嘧啶(嘌吟 和嘧啶都可以正常合成)將篩選出來(lái)的雜種細(xì)胞轉(zhuǎn)移到正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)通過(guò)細(xì)胞學(xué)觀察,特別是應(yīng)用 顯帶染色(見(jiàn)核型)方法,可以選出具有某個(gè)或某幾個(gè)人染色體的融合細(xì)胞株, 再經(jīng)組織培養(yǎng)并測(cè)定其中是否出現(xiàn)待測(cè)基因的表型就可以判斷待測(cè)基因所屬的 染色體。假定有五個(gè)人一鼠融合細(xì)胞株A、B、C、D、E,它們分別保留有人染色體1、2、 3中的這一個(gè)
14、或那一個(gè),例如細(xì)胞株A保留染色體2,細(xì)胞株D保留1、2、3這三 個(gè)染色體等。分別測(cè)定甲、乙、丙、丁四種表型,如某種酶的活性或某種抗原的 存在與否等。已經(jīng)知道這些特性都是小鼠細(xì)胞所沒(méi)有的,從表2的結(jié)果可以看到 任何一個(gè)細(xì)胞株只要測(cè)得(或不能測(cè)得)甲這一性狀時(shí)必然同時(shí)可以測(cè)得(或不能 測(cè)得)丙這一性狀。這一結(jié)果說(shuō)明這兩種酶或抗原蛋白的基因?qū)儆谕蝗旧w。 其次可以看到任何一個(gè)細(xì)胞株凡是保留染色體2的必然出現(xiàn)上述性狀,可見(jiàn)上 述兩個(gè)基因都在人的2號(hào)染色體上。(六)單元化定位法在構(gòu)窠曲霉這一類真菌的準(zhǔn)性生殖過(guò)程中,雜合二倍體細(xì)胞在有絲分裂時(shí)常 隨機(jī)地丟失它的染色體。染色體在多次有絲分裂過(guò)程中逐條丟失而
15、使二倍體細(xì)胞 終于轉(zhuǎn)變?yōu)閱伪扼w細(xì)胞的過(guò)程稱為單元化。如果一對(duì)染色體中帶有顯性的野生型 基因的染色體丟失了,那么同源染色體上隱性基因的性狀便得以表現(xiàn)。此外,通 過(guò)體細(xì)胞交換也可以從雜合二倍體得到表現(xiàn)隱性性狀的子代細(xì)胞。不過(guò)一次體細(xì) 胞交換只能導(dǎo)致著絲粒一側(cè)的隱性基因的性狀得以表現(xiàn),而同一染色體同時(shí)發(fā)生 兩次交換的概率極低,因此假如一個(gè)染色體的著絲粒兩側(cè)的隱性基因的性狀都在 一個(gè)子代細(xì)胞中表現(xiàn),那就說(shuō)明這是帶有顯性基因的染色體丟失的結(jié)果。另一個(gè) 待測(cè)的隱性突變型如果同時(shí)得以表現(xiàn),這就是它和已知基因有連鎖關(guān)系的證據(jù)。(七)染色體易位的基因定位直接觀察法:易位(見(jiàn)染色體畸變)使染色體上的基因改變連鎖關(guān)
16、系,所以易位可 以用來(lái)進(jìn)行基因定位。如果易位所涉及的染色體是可以被識(shí)別的,那就更有利于 定位工作。如果在遺傳學(xué)分析中發(fā)現(xiàn)某兩個(gè)連鎖群的連鎖關(guān)系都發(fā)生了改變,同 時(shí)在顯微鏡下又可以辨認(rèn)出有兩個(gè)染色體發(fā)生了相互易位,那么就可以知道兩個(gè) 連鎖群和兩個(gè)染色體的對(duì)應(yīng)關(guān)系。例如遺傳學(xué)分析的結(jié)果說(shuō)明小鼠品系T1380 的相互易位涉及連鎖群LGII和LGIX。品系RB163H的相互易位涉及連鎖群LGII 和LGXL細(xì)胞學(xué)觀察說(shuō)明前者涉及染色體9和17,后者涉及染色體9和19,因 此知道連鎖群LGII屬于染色體9,連鎖群LGX屬于染色體17,連鎖群LGX屬 于染色體19。某些生物的染色體具有天然的標(biāo)記,例如果蠅
17、的唾腺染色體具有容易辨認(rèn)的 橫紋,玉米的染色體有容易辨認(rèn)的巨大的染色粒,所以通過(guò)直接的細(xì)胞學(xué)觀察就 可以辨認(rèn)出易位所涉及的染色體,但是對(duì)于染色體數(shù)較多而又沒(méi)有天然標(biāo)記的生 物,就需用顯帶技術(shù)鑒定染色體的易位。上述小鼠的連鎖群所屬的染色體便是應(yīng) 用顯帶技術(shù)鑒定的(八)假連鎖法相互易位雜合體只有在減數(shù)分裂過(guò)程中通過(guò)交互離開(kāi)所形成的平衡配子才 能夠存活,并使非同源染色體上的基因顯示假連鎖現(xiàn)象。所以把帶有屬于已知染 色體的標(biāo)記基因的相互易位品系作為測(cè)交品系和一個(gè)突變型品系雜交,如果發(fā)現(xiàn) 這一突變基因經(jīng)常和標(biāo)記基因的野生型等位基因相連鎖,就可以判定突變基因一 定在相互易位的兩個(gè)染色體中的一個(gè)上面。例如在
18、粗糙脈孢菌中有一個(gè)品系(圖 1),它的第I染色體上帶有白色分生孢子基因(albino,al),第W染色體上 帶有溫度敏感的蔓延菌落基因(colonial temperature sensitive,cot),第丑染 色體上帶有黃色分生孢子基因(yellow conidia,ylo),同時(shí)它還是染色體1一 II、W V和III H相互易位品系。用它作為測(cè)試菌株和任何一個(gè)突變型菌株進(jìn) 行雜交,就可以通過(guò)一次雜交大致上測(cè)得這一突變型所屬的染色體。例如具有這 一突變性狀的雜交子代菌株總是菌絲蔓延的,就知道它的突變基因?qū)儆谌旧wW 或V。又假如這個(gè)突變型和al、cot和ylo都沒(méi)有連鎖關(guān)系,那么由于粗糙
19、脈孢 菌只有7個(gè)染色體,就可以推測(cè)這一突變基因在染色體W上。三、基因在染色體上的位置的測(cè)定根據(jù)重組頻率的基因定位同一染色體上兩個(gè)基因之間的距離愈遠(yuǎn),則發(fā) 生交換的機(jī)會(huì)愈多,雜交子代中重組體也就愈多。所以測(cè)定雜交子代中重組體的 多少,就可以知道有關(guān)的基因的距離,這是最基本的基因定位方法。A.H.斯特蒂 文特把雜交子代中出現(xiàn)1%重組體的兩個(gè)基因之間的距離定為一個(gè)圖距單位,后 來(lái)又有人稱之為一個(gè)分摩,用來(lái)紀(jì)念首先提出交換概念的T.H.摩爾根。同一原 理也適用于單倍體微生物的基因定位。(一)三點(diǎn)測(cè)驗(yàn)法在包括兩對(duì)基因的雜交中,一次雜交可以測(cè)定兩個(gè)基因之間的距離,通過(guò)三次雜 交便可以測(cè)定三個(gè)基因的排列順序
20、和距離。但是在包括三對(duì)基因的一次雜交中, 便可以測(cè)定三個(gè)基因的排列順序和距離,這就是1913年由斯特蒂文特首創(chuàng)的三 點(diǎn)測(cè)驗(yàn)方法。例如黑腹果蠅的X染色體上有黃體基因(yellow body,y;野生型 灰體,y+)、白眼基因(white eye, w;野生型紅眼,w+)和短翅基因(miniature和野生型雄I再和雄性子代ywmwing,m;野生型長(zhǎng)翅,m+)。將黃體、白眼、短翅雌蠅I蠅(y+w+m+即+)雜交,將得到的雌性雜合體 雜交,得到子二代個(gè)體(表3)。基因定位從表中的數(shù)值求得:基因y和w之間的重組頻率1.3%基因w和m之間的重組頻率32.8%基因y和m之間的重組頻率因此這三個(gè)基因在染色
21、體上的相對(duì)位置如圖2。三點(diǎn)測(cè)驗(yàn)或者包括更多的基 因的雜交還可以用來(lái)研究交叉干涉、染色單體干涉等現(xiàn)象。(二)著絲粒距離法 一個(gè)基因與它所屬染色體的著絲粒之間的距離稱為著絲 粒距離。在不同的生物中,可用不同的方法測(cè)定著絲粒距離。在粗糙脈孢菌中, 著絲粒和基因之間的距離可以根據(jù)子囊中子囊孢子的排列順序來(lái)測(cè)定,這是 1932年美國(guó)微生物遺傳學(xué)家CC.林德格倫所首創(chuàng)的方法。在同一染色體上兩個(gè)基 因的著絲粒距離都被測(cè)定后,這兩個(gè)基因之間的距離就可以斷定為兩者之和或者 兩者之差。子囊的排列方式有6種,AAaa和aaAA這兩種稱為第一次分裂分離,AaAa、 aAaA、AaaA、aAAa這四種稱為第二次分裂分離
22、。前者基因A(a)和著絲粒之間沒(méi) 有發(fā)生交換,后者A(a)和著絲粒之間發(fā)生了交換。所以某一基因和著絲粒之間交換頻率愈高,第二次分裂分離子囊愈多。由于 每次交換導(dǎo)致半數(shù)染色單體成為重組類型,所以在高等植物如小麥和棉花中,可 以利用衍生的端著絲粒染色體進(jìn)行著絲粒距離測(cè)定。例如某一雄性親本除了有一 個(gè)正常的具中央著絲粒的染色體以外,還有一個(gè)由它的同源染色體衍生來(lái)的端著 絲粒染色體。如果在正常染色體上有一個(gè)待測(cè)著絲粒距離的隱性基因,在端著絲 粒染色體上有野生型的等位基因,帶有端著絲粒染色體的花粉缺少一條染色體 臂,使它不能順利受精,因此大部分受精的配子都帶有隱性基因,即帶有正常的 染色體。只有待測(cè)基因
23、和端著絲粒染色體基因之間發(fā)生了一次交換,才能得到具 有顯性野生型基因的配子。因此由這樣的雄性親本和純合隱性的雌性親本雜交子 代中出現(xiàn)的野生型個(gè)體數(shù)便可推知交換發(fā)生的頻率,從而求得隱性基因的著絲粒 距離。(三)缺失定位法一個(gè)細(xì)胞中的兩個(gè)同源染色體中的一個(gè)上有一個(gè)突變基因,另一染色體上有 一小段已知范圍的缺失,如果這一突變基因的位置在缺失范圍內(nèi),便不可能通過(guò) 重組而得到野生型重組體;如果突變基因不在缺失范圍內(nèi),那么就可以得到野生 型重組體。利用一系列已知缺失位置和范圍的缺失突變型,便能測(cè)定突變型基因 的位置。(四)共轉(zhuǎn)導(dǎo)法每一種轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體有一定的大小,只能攜帶一定長(zhǎng)度的供體細(xì)菌的DNA。例 如大腸
24、桿菌噬菌體PI的頭部中只能包裝大約分子量為5.8X107的DNA,大腸桿菌 的染色體DNA的分子量是2.5X109,所以PI所能包裝的DNA至多相當(dāng)于大腸桿 菌的遺傳學(xué)圖上相距兩分鐘這樣一段DNA分子。如果兩個(gè)基因能同時(shí)被轉(zhuǎn)導(dǎo),這兩個(gè)基因之間的距離必然較近,而且距離愈近則共轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率愈高,因此可以由共 轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率來(lái)推算基因間的距離。其中d是以分鐘計(jì)算的供體大腸桿菌兩個(gè)基因之間的距離,L是以分鐘計(jì)算 的轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA的長(zhǎng)度,取為兩分鐘。大腸桿菌遺傳學(xué)圖的大部分位置上的基因都曾 用共轉(zhuǎn)導(dǎo)方法定位。(五)標(biāo)記獲救法這是一種結(jié)合物理圖譜制作和遺傳學(xué)分析的基因定位方法,它適用于病毒等 基因組較小的生物。以大腸
25、桿菌噬菌體0X174為例,把野生型噬菌體的雙鏈復(fù) 制型DNA分子用限制性內(nèi)切酶Hind II切為13個(gè)片段,把每種片段和突變型amg 的DNA單鏈在使DNA分子變性并復(fù)性的條件下混合保溫,然后用各個(gè)樣品分別轉(zhuǎn) 化受體細(xì)菌。如果在某一樣品處理后的受體細(xì)菌中出現(xiàn)了大量的野生型噬菌體, 于是就說(shuō)明這一樣品中的Hindi片段包含著amg的相應(yīng)的野生型基因,由于13 個(gè)Hindi片段的位置在物理圖譜中全部都是已知的,因此便可以推知amg基因 在染色體上的相應(yīng)位置。(六)轉(zhuǎn)錄定位法許多RNA病毒的整個(gè)基因組往往作為一個(gè)單位轉(zhuǎn)錄。隨著轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行,由 基因組上各個(gè)基因所編碼的蛋白質(zhì)也依序在寄主細(xì)胞中出現(xiàn)。當(dāng)寄
26、主細(xì)胞被紫外 線照射使本身的蛋白質(zhì)合成受到抑制時(shí),病毒蛋白的出現(xiàn)更為明顯。紫外線照射 也起著抑制病毒基因組的轉(zhuǎn)錄的作用。紫外線在RNA分子的某一部位造成損傷 后,損傷的部位和它后面的基因的轉(zhuǎn)錄都將受到影響,損傷部位以前的基因的轉(zhuǎn) 錄則不受影響。因?yàn)檗D(zhuǎn)錄沿負(fù)鏈RNA的3端向5端進(jìn)行,所以愈是接近3, 端的基因的轉(zhuǎn)錄和由它編碼的蛋白質(zhì)在寄主細(xì)胞中的合成受到紫外線損傷的影 響愈小,而愈是接近5,端的基因和相應(yīng)的蛋白質(zhì)的合成愈容易為紫外線照射所 抑制。因此只要先用相同劑量的紫外線照射待測(cè)病毒,然后再測(cè)出寄主細(xì)胞中該 病毒編碼的各種蛋白質(zhì)的產(chǎn)量,便可以推知該病毒各個(gè)基因的位置。(七)共缺失法缺失帶來(lái)和基因突變相同的表型。由一次缺失所造成的突變只涉及相鄰接的 基因,因此可以從缺失所帶來(lái)的基因突變的分析來(lái)測(cè)定一些基因的相對(duì)位置,這 一方法被廣泛應(yīng)用于酵母菌的線粒體基因的定位。根據(jù)基因行為的定位基因的某些行為可以反映它們的位置。在細(xì)菌
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