1、差異刺激劑和造就環境對CD4+ 、 CD8+ T細胞內細胞因子表達的影響【關鍵詞】流式細胞術;,T細胞亞群;,細胞因子;,刺激劑;,造就條件ytkineexpressinfD4+andD8+TellsinduedbydifferentstiuliunderdifferentulturenditinsAbstratAI:TinvestigatetheeffetfdifferentstiulianddifferentulturenditinsntheytkineexpressinfD4+andD8+Tells.ETHDS:PBsereislatedfrnralhuanperipheralbldan

2、dulturediththreekindsfstiuli(PHA,antiD3andantiD28Abs,PAandinyin)underfurdifferentulturenditins(rteperature,37aterbath,37inubatr,37and50L/L2inubatr)fr4.55handintraellularytkines(IL2,IFNandTNF)inTellsereassessedbyflytetry(F).RESULTS:ytkineexpressinfD4+andD8+Tellsvariedhentreatedithdifferentstiuliunder

3、differentnditins.PAhadthestrngeststiulativeeffetnytkineexpressinfPB,hiletheeffetfantiD3Abaseaker,andthatfPHAastheeakest.DifferentulturenditinsdidntgreatlyhangetheytkineexpressinprfilefTells(P0.05)exeptthatthereereveryfeytkineprduingellshenPBsereulturedatrteperature.NLUSIN:AntiD3andantiD28Abs,PAandin

4、yinarereendedfrthestiulatinfPBsanddetetinfintraellularytkineusingF.ultureteperaturebutntthenentratinf2isthestiprtantfatrduringtheshrtterTellstiulatin.Keyrdsflytetry;Tellsubset;ytkine;stiulus;ulturenditin摘要目的:探究差異的刺激劑和差異的造就條件對D4+和D8+T細胞內細胞因子表達的影響。要領:分散正凡人的外周血單個核細胞PB,別離參加3種差異的刺激劑PHA,抗D3和抗D28Ab,PA和離子霉素

5、,置于4種差異的造就環境下室溫,37水浴,37造就箱,3750L/L2造就箱造就455h。網絡細胞,以熒光素Ab標識表記標幟后,用流式細胞術闡發D4+、D8+T細胞內IL2、IFN和TNF的表達。結果:D4+和D8+T細胞內細胞因子的表達,隨著刺激劑的差異而有所差異,且在上述4種造就環境中,PA的刺激結果最強,抗D3Ab次之,PHA的刺激效應最弱。以上述3種刺激劑刺激后,差異造就條件對T細胞內細胞因子的表達有必然的影響。室溫造就時險些檢測不到細胞因子的表達,而在37水寓37造就箱和3750L/L2造就箱中造就時,表達細胞因子的D4+和D8+T細胞的百分率差異無統計學意義P0.05。結論:差異刺

6、激劑體外刺激T細胞表達細胞因子的效應差異,依次為PA和離子霉素抗D3和抗D28AbPHA。體外刺激造就的T細胞活化歷程中,溫度是緊張的條件,2無顯著影響。關鍵詞流式細胞術;T細胞亞群;細胞因子;刺激劑;造就條件應用熒光素標識表記標幟的抗細胞外貌抗原的單克隆抗體Ab和抗細胞因子的Ab,流式細胞術不但可檢測單個細胞內的多種細胞因子,還可區分表達特定細胞因子的細胞亞群1。但該技能涉及的環節較多,因此,需對各方面的影響因素舉行探究。我們曾闡發了刺激時間和結實破膜劑等因素對該要領的影響2,但對付差異刺激劑和差異造就環境對細胞內細胞因子表達的影響尚未見報道。為此,本研究中闡發了3種刺激劑PHA,抗D3和抗

7、D28Ab,PA和離子霉素以及4種造就環境室溫,37水浴,37造就,3750L/L2條件下造就對D4+和D8+T細胞內細胞因子表達的影響。本研究可為在沒有2造就箱的條件下,用流式細胞術檢測細胞外貌和細胞內的細胞因子提供實行根據,同時為流式細胞術檢測的尺度化奠基了基矗1質料和要領1.1質料PerP標識表記標幟的抗D8AbPerPantiD8Ab、AP標識表記標幟的抗D4Ab(APantiD4Ab)、PE標識表記標幟的抗TNFAb(PEantiTNFAb)、PE標識表記標幟的抗IL2AbPEantiIL2Ab、FIT標識表記標幟的抗IFNAb(FITantiIFNAb)及匹配的同型比擬Ab抗體,均

8、購自美國BD公司。佛波酯PA、離子霉素(Inyin)、布雷桿氏菌素ABFA、皂苷(Sapnin)等,均購自Siga公司。鼠抗人D3和抗D28Ab購自美國BDPharingen公司。RPI1640造就液和Hanks液購自GIB公司。葡聚糖泛影葡胺Fillhypaque購自上海華精生物科技公司。BDFASalibur流式細胞儀為美國BD公司產物。2造就箱為美國RSBiteh公司產物。1.2要領圖1在PA刺激下,4種造就環境造就的T細胞中3種細胞因子的表達略Fig1Expressinf3ytkinesinD4+andD8+Tellsulturedunderthenditinsf4differentu

9、lturesafterPAstiulatinFS:Frardsatter;SS:Sidesatter.R1:Lyphytes;R2:D8+Tells;R3:D4+Tells.ThenubersinthedensitypltaretheperentagefytkineprduingellsangD4+()andD8+(D)Tells.A:DensitypltfFSvsSSallsidentifiatinflyphytes;B:DensitypltfD8vsD4allsidentifiatinfD4+andD8+Tells;:Expressinf3ytkinesinD4+Tells;D:Expre

10、ssinf3ytkinesinD8+Tells.RT:Rteperature;B:aterbath.2結果Fig2TheeffetsfdifferentstiulatrsandulturenditinsnytkinesexpressininD4+andD8+TellsatRT;Bat37;Inubatrat37;Inubatrntaining50L/L2at37.aP0.05,bP0.01vsatRTunderthesaestiulatinnditin.2.2D4+和D8+T細胞表達細胞因子的差異當以PA或抗D3Ab刺激PB時,在37水寓37造就箱和3750L/L2造就箱中造就4.55h后,D

11、4+和D8+T細胞均可表達細胞因子。進一步闡發的結果表白,當以抗D3Ab刺激PB時,D8+T細胞中IFN和TNF的表達均明顯高于D4+T細胞。當以PA刺激PB時,表達IL2的T細胞中,D4+T細胞的陽性率明顯高于D8+T細胞P0.05;而在表達IFN的T細胞中,D8+T細胞的陽性率那么明顯高于D4+T細胞P0.05。表達TNF的T細胞中,D4+T細胞與D8+T細胞的陽性率無統計學差異圖3。2.3抗D3Ab/PA誘導細胞因子表達的特點當以抗D3Ab刺激時,大多數D4+T細胞只表達TNF或同時表達TNF和IFN;而大多數D8+T細胞可同時表達TNF和IFN或只表達IFN,僅表達IL2的細胞只占少數

12、。當以PA刺激時,得到雷同的結果,但表達細胞因子的細胞的百分率顯著增長圖4。圖3D4+和D8+T細胞表達細胞因子的差異略Fig3DifferenefytkineexpressininD4+andD8+Tells圖4抗D3Ab/PA誘導D4+和D8+T細胞表達細胞因子的特點略Fig4harateristisfytkinesexpressinfD4+andD8+TellsinduedithantiD3AbrPA3討論比年來,使用流式細胞術在單個細胞程度上闡發細胞外貌標識表記標幟和細胞內細胞因子的表達,它具有特異性強、敏感度高、快速省時及易于操縱等特點,在臨床和科研中已普及應用3-5。由于活化的T細

13、胞才氣產生細胞因子,為此,我們接納了3種多克隆刺激劑PHA、PA和離子霉素、抗D3和抗D28Ab刺激PB后,并置于4種差異的造就環境室溫,37水浴,37造就箱,3750L/L2造就箱中舉行造就,不雅察T細胞中細胞因子的表達環境。結果表白,PA的刺激結果最強,抗D3Ab次之,PHA的刺激效應最弱。幾種差異的造就環境對D4+和D8+T細胞表達細胞因子影響的結果表現,室溫造就時,表達細胞因子的T細胞的比率很低,但其他3種造就環境比擬力,差異無統計學意義P0.05,尤其用抗D3Ab刺激時,結果非常不變,提示溫度是緊張的條件。2的重要作用是維持造就體系的酸堿度,假設細胞在體外只短期4.55h造就,造就箱

14、中有無2對實行的結果影響不大。T細胞非均一的細胞群體,按照成效和H分子限定性的差異,可將成熟的T細胞分為D4+和D8+T細胞兩個亞群6,7,它們表達的細胞因子有所差異8,9。Jasn等8報道,在PHA/PA/離子霉素刺激淋巴細胞45.5h后,表達IL2的D4+T細胞的百分率高于D8+T細胞;而表達IFN的T細胞的比率那么恰相反,但表達TNF的細胞的比率在兩群T細胞間無顯著差異,與本實行的結果根本同等。但上述細胞因子的表達環境在以抗D3Ab刺激時那么稍有差異,即表達TNF的D8+T細胞的比率高于D4+T細胞。關于上述3種細胞因子同時表達的環境,本研究的結果也與Jasn等的報道根本同等,即以PA刺

15、激時,D4+和D8+T細胞中同時表達IFN和TNF、IFN和IL2的細胞的比率均較高,而以抗D3Ab刺激時,同時表達IFN和IL2的D4+和D8+T細胞的比率很低,與用特異性抗原刺激時所不雅察到的結果較為相似10。總之,通過闡發差異的刺激劑和差異的造就環境對細胞內細胞因子表達的影響,可選擇差異的刺激劑和差異的造就條件,這不但更有利于流式細胞術的普及,并且為該技能在科研和臨床中的應用并使其尺度化奠基了基矗參考文獻:1PerfettSP,hattpadhyayPK,Rederer.Seventeenlurflytetry:unravelingtheiunesysteJ.NatRevIunl,202

16、2,4(8):648-655.2周茂華,王丁,張建軍,等.四色法流式細胞術測定淋巴細胞內細胞因子的要領學探究J.當代查驗醫學雜志,2022,184:1-3.3ShlbinA,estEE,LehtzinN,etal.PersistentytegalvirusspeifieryrespnsesinthelungallgraftandbldfllingpriaryinfetininlungtransplantreipientsJ.JIunl,2022,176(4):2625-2634.4KtakeS,NankeY,gi,etal.IFNgaaprduinghuanTellsdiretlyindues

17、telastgenesisfrhuannytesviatheexpressinfRANKLJ.EurJIunl,2022,35(11):3353-3363.5錢莘,施明,王福生.流式細胞術檢測細胞內細胞因子的研究希望J.細胞與分子免疫學雜志,2022,211:S62-64.6dlandDL,DuttnR.HetergenEityfD4(+)andD8(+)TellsJ.urrpinIunl,2022,15(3):336-342.7SederRA,AhedR.SiilaritiesanddifferenesinD4+andD8+effetranderyTellsgeneratinJ.NatIunlRev,2022,4(9):835-842.8JasnJ,LarnedJ.Singleellytkineprfilesinnralhuans:parisnfflytetrireagentsandstiulatinprtlsJ.JIunlethds,1997,207(1):13-22.9LeeBN,Fllen,ShenDY,etal.Depressedtype1ytkinesynthesisbysu