1、關于免疫組化的原理與操作第一張，PPT共三十九頁，創作于2022年6月概念：免疫組織化學(Immunohistochemistry,IHC) 是利用抗原抗體反應和組織化學呈色反應來檢測組織和細胞中某種化學成分的一門技術,是傳統的免疫學和組織化學相結合而發展起來的一門新興學科，也叫原位免疫學（In situ immunology）。特點或優點：（1）特異性強、靈敏度高； （2）可定性、定位、定量觀察； （3）將形態學改變與功能和代謝變化結 合起來；免疫組化概述第二張，PPT共三十九頁，創作于2022年6月 IHC不僅具有傳統形態學（包括LM和EM水平）能對組織和細胞進行仔細、客觀觀察的優點（特別

2、是經蘇木精或伊紅復染后），而且還克服了傳統免疫學反應只能定性和定量（離體、液相），而不能定位的缺點。IHC則可在原位和固相對染色結果進行觀察。目前IHC的定位可精確到亞微結構水平。 隨著IHC技術的發展和圖象分析技術的發展，IHC已進入多標記（雙標記）和定量研究的階段，使IHC在生物學和醫學各領域的應用日益廣泛，不僅用于研究，也用于診斷。IHC與核酸分子雜交相結合形成的原位雜交技術（in situ hybridization，ISH）既特異性強、靈敏，又具定位、可視的特點。第三張，PPT共三十九頁，創作于2022年6月 IHC技術源于免疫熒光術（immunofluorescence, IF），

3、從1941年1950年Coons等用了10年首創了 熒光素標記抗體技術檢測肺組織內的肺炎雙 球菌，六、七十年代IF在科研中占據著主導地位1968 年中根一穗（Nakane）等創建了酶標抗體技 術（immunoperoxidase，IPO）鐵蛋白標記 Ab技術; 1974年Stemberger 改良上述技術，建立辣根過氧 化物酶抗體過氧化物酶（PAP）技術，使免疫 細胞化學得到廣泛應用；一、IHC的發展簡史第四張，PPT共三十九頁，創作于2022年6月80年代Hsu等建立了ABC法之后，免疫金銀染色 法、半抗原標記法、免疫電鏡技術相繼問世。 90年代 分子雜交技術、原位雜交技術、免疫細 胞化學分

4、類方法迅速發展；2000年 各種免疫組化技術更加成熟，使免疫組 化技術成為當今生物醫學中形態、功 能代謝綜合 研究的一項有力工具。其應用范圍深達醫學各個 學科，是目前生命科學工作者應該掌握的基本技 術之一；國內起步晚，從70s開始。第五張，PPT共三十九頁，創作于2022年6月（一）方法學1.從傳統的抗原、抗體反應（免疫反應）親和反應。新的親和物質對有：生物素與卵白素（biotin&avidin)，葡萄球菌A蛋白（SPA）與IgG，凝集素與受體，激素與受體。這些親和對親和力強，且可與多種標記物（熒光素、酶、同位素、膠體金、鐵蛋白等）結合，由此產生了親和組織化學（affinity histoch

5、emistry），這些方法特異性、敏感性、穩定性高，更方便、適于某些特殊觀察（如EM）。2.從單一顯示某種物質（單標記）顯示多種物質（雙標記）。3.從LMEM（超微結構）：免疫電鏡、膠體金法、金銀法。4.從定性定量，圖象分析（IA）、流式細胞術（FCM）。5.IHC與ISH相結合，可在不同水平檢測DNA、mRNA、protein。6. 原位PCR+IHC可在組織原位通過擴增檢測微量目的DNA。7. 趨于標準化、自動化。二、IHC的現狀和發展前景第六張，PPT共三十九頁，創作于2022年6月（二）技術分類 1. 根據染色方式分成： 貼片染色 漂浮染色 2. 根據Ag-Ab結合方式分成： 直接法

6、間接法 多層法 3. 按標記物的性質分成： 免疫熒光技術（免疫熒光法） 免疫酶技術（酶標抗體法、橋法、PAD法、 ABC法） 免疫金屬技術（免疫鐵蛋白法、免疫金染色 法、蛋白A金法）第七張，PPT共三十九頁，創作于2022年6月（三）標記物 1. 必要性：組織細胞內Ag-Ab結合反應一般是不可 見的，若在鏡下檢測，則必須具有可視性標記物。 2. 常用標記物 熒光素：最常用的是異硫一氰酸熒光素（ Fluorescein isothiocyanate ，FITC）-熒光顯 微鏡下呈綠色熒光; 四乙基羅達明（rhodamine RB200）-熒光顯微鏡下發橙紅色熒光 酶：辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶。

7、 生物素：（Biotin） 鐵蛋白金等：主要應用于免疫電鏡。 其他：如同位素（因涉及污染和防護難一般不用）第八張，PPT共三十九頁，創作于2022年6月（四）IHC的應用1. 只要是形態科學均可采用:包括病理學、神經科學、生物學、病原微生物的檢測（病毒、細菌、寄生蟲等）、皮膚病學、器官移植等。2. 可用于多種材料：A.各種組織（冰凍組織、formalin固定組織、石蠟包埋組織兼可）；B.各種細胞(穿刺、體液、涂片、血細胞、培養細胞等）。3. 用于診斷：腫瘤病理學等（大中醫院）。4. 用于科研：臨床和基礎醫學，尤其是形態學專業研究生常用IHC，或IHC+分生技術；最近幾年，分子生物學研究異常活躍

8、，但最終還要歸到形態上來，用免疫組織化學方法對所研究的大分子進行定位，進而深入研究其功能。第九張，PPT共三十九頁，創作于2022年6月（一）標本的收集與處理 IHC染色成功與否及其質量如何，除染色方法本身外，對材料的處理也至關重要，它包括：取材、固定、脫水、包埋、切片等。目的：保存好Ag的數量及活性、保持組織細胞的良好形態結構。材料的來源：人體及實驗動物；細胞和組織；新鮮的及固定的。 1、組織標本的取材與儲存 來源：活檢取材、手術切除、實驗動物組織等。 要求：要快、要小（110.4cm），避免擠壓。 處理：冰凍即用或保存；固定即用或保存。三、樣品的準備、處理第十張，PPT共三十九頁，創作于2

9、022年6月 2、細胞標本的取材與儲存來源：血細胞、穿刺細胞、體液細胞等。處理：細胞多時直接涂片、干燥、固定、染色； 細胞少需離心沉淀、涂片、干燥、固定、染色；對于體外培養細胞：貼壁生長細胞（內皮C、纖維C、神經C等）在培養皿底置載玻片；懸浮生長細胞需離心沉淀，再涂片、固定，即用或冰凍保存。 第十一張，PPT共三十九頁，創作于2022年6月 （二）固定（fixation） 1、固定的含義 固定是指以某種化學物質使蛋白質、酶類（變性）、脂質、糖類等物質保持在組織細胞原位，避免Ag溶解、擴散、丟失；保持組織細胞的正常形態結構。 根據Ag對固定劑的耐受性，可將其分為：不穩定Ag（如細胞表面Ag，不耐

10、甲醛，宜用丙酮）、半穩定Ag及穩定Ag，后二者多為蛋白、肽類、酶類物質。 固定有時間性，太短達不到固定目的，太長交聯過度，封閉Ag。 第十二張，PPT共三十九頁，創作于2022年6月 2、常用固定劑及其用途1. 10%的formalin（4%的甲醛formaldehyde）：以pH7.4的PBS配制，優點：穿透力強、固定快、組織收縮小；適于固定蛋白、肽類、酶、糖。IHC常用4%多聚甲醛polyformaldehyde灌注固定及后固定，時間46 h。2. 2.5%的戊二醛，同上。也可用2%戊二醛與2%多聚甲醛混合液固定，尤對超微結構保存好。醛類固定劑的缺點是易封閉抗原，必要時需抗原修復。3. 7

11、0%的酒精（乙醇），優點：固定蛋白好，缺點：組織收縮嚴重；時間：2h。4. 70%丙酮，優點：滲透快；缺點：對形態保存不好；用于對冰凍切片和細胞涂片的固定；時間：10min。5. 混合固定液：Bouin液：40%PF250ml、冰醋酸50ml、飽和苦味酸250ml；還有PLP固定液，較適合免疫組化。6. 四氧化鋨（OsO4 鋨酸）：常用PBS配制1%鋨酸溶液后固定1h，用于免疫組化及電鏡觀察。有強烈刺激，需在通風櫥內操作。第十三張，PPT共三十九頁，創作于2022年6月（三） 組織的脫水、浸蠟、包埋和切片 前三步只用于石蠟切片，冰凍切片和振動切片不需此步驟。 切片可分為： 石蠟切片：脫水、透明

12、、浸蠟、包埋、切片57m； 冰凍切片：浸糖，20%30%蔗糖4oC過夜，減少冰 晶；OCT包埋；液氮速凍，減輕組織破 壞。病理切片要薄，57 m；腦片通常 3050 m厚。 振動切片：不需做任何包埋，固定后的組織可直接 用振動切片機做各種厚度的切片，并在 染色后可進一步制作電鏡標本觀察。 第十四張，PPT共三十九頁，創作于2022年6月 （四）防脫片劑 （1） 蛋白甘油，蛋清與甘油1：1攪拌、過濾、防腐； （2）1%的鉻礬明膠涂片； （3）0.1%的多聚賴氨酸涂片，晾干備用。配制時用塑料 瓶而不能用玻璃瓶； （4） 購買商品化的進口硅化玻片； （5）APES（氨丙基三乙氧基硅烷），1：50丙酮

13、稀釋， 浸片2030秒，晾干備用；貼片時要一步到位。第十五張，PPT共三十九頁，創作于2022年6月（五）抗原修復 近年興起的新技術。目的：暴露被交聯封閉的Ag。主要適用于經長期formalin固定的標本、石蠟包埋標本；也可用于冰凍切片。常用的方法有：（1） 微波加熱 切片煮沸1020min，室溫自然冷卻，所用溶液有：飽和NaCL溶液；10mMpH 6.0的枸櫞酸鈉緩沖液； 4M的尿素等；pH8.0TBS;（2）高壓鍋處理 將切片放入10mM、pH 6.0的枸櫞酸鈉緩沖液容器中，置鍋內加蓋噴氣310min，自然冷卻。（3）酶消化處理 ：常用0.1%的胰蛋白酶（含0.1%CaCL2，pH 7.8

14、）37。C 10min。或0.4%胃蛋白酶37。C 30min;第十六張，PPT共三十九頁，創作于2022年6月 （一）基本染色方法 熒光素標記抗體：FITC、 直接法 TRITC等標記抗體法 酶標記抗體：HRP、AP等 熒光素標記抗體 間接法 酶標記抗體（三步法） 非標記抗體法：酶橋法、PAP法、APAAP法; 親和組化法：ABC法、LAB法、LsAB法、BRAB法; 雙重標記：阻斷法（酸洗抗）、非阻斷法（連續染） 四、免疫組織化學技術第十七張，PPT共三十九頁，創作于2022年6月1直接法 熒光素直接標記特異性抗體（一抗）上，標記抗體與抗原結合（在切片上）熒光顯微鏡下觀察檢測抗原。 優點：

15、簡單，時間短， 特異性強。缺點：靈敏度低，所 需抗體量大 （不經濟）。應用：基本不用了！第十八張，PPT共三十九頁，創作于2022年6月2間接法 熒光素標記在二抗上（二抗：抗產生一抗動物的 IgG抗體）。顯色后鏡檢 特點：1、敏感性較直接法高3-4倍，但特異性較低； 2、不必標記每種一抗，只需標記某一種動物的二抗； 3、一抗可高度稀釋，節省一抗，且可用PBS代替一抗做空白對照。第十九張，PPT共三十九頁，創作于2022年6月3非標記Ab橋法： “橋法”是酶標記抗體的改進，經過三次抗體，其二抗為未標記橋抗體。（1）單橋法第二十張，PPT共三十九頁，創作于2022年6月(2)雙橋法 在三抗之后，將

16、二抗和三抗再重復一次， 可增大染色強度。 特別提示：注意動物種屬關系 特點：敏感性高，但酶濃度不好掌握；與組織非特異性結合的酶不易洗去，背景染色重。第二十一張，PPT共三十九頁，創作于2022年6月4過氧化物酶抗過氧化物酶法（Peroxidase anti- peroxidase method，簡稱PAP法） 是橋法的改良，用第二抗體作“橋梁”，先與第一抗體結合，再與PAP復合物聯結，形成抗原抗體抗IgG抗體PAP復合物，最后用底物顯色劑顯色。特點：靈敏度高，比間接熒光法敏感20倍，比間接酶標記抗體法敏感100倍第二十二張，PPT共三十九頁，創作于2022年6月 5親和素-生物素-過氧化物酶復

17、合物法（avidin-biotin- peroxidase complex technique，簡稱ABC法）。 關鍵的程序步驟為3步： Ag +Ab1 +（Ab2-B）+ABC 復合物 （ Ab2-B 為生物素標記的第二抗體） （B 為生物素標記的過氧化物酶） ABC復合物是avidin與酶聯biotin 在使用前30min配置，混勻。1個avidin分子結合了3個biotin分子，剩下1個結合點與2抗的生物素結合，avidin起橋聯作用。第二十三張，PPT共三十九頁，創作于2022年6月（1）ABC復合物的制備：（2）ABC法反應原理：特點：ABC法敏感性更高，比PAP法敏感2040倍，背

18、景也更清晰。第二十四張，PPT共三十九頁，創作于2022年6月ABC法示意圖第二十五張，PPT共三十九頁，創作于2022年6月染色結果觀察（BrdU）第二十六張，PPT共三十九頁，創作于2022年6月 6、酶標親和素-生物素技術（labelled avidin-biotin technique， 簡稱LAB法）。 即用辣根過氧化物酶直接標記avidin，用biotin標記2抗。 關鍵步驟為3步： Ag +Ab1 +（Ab2-B）+A （A為HRP標記的卵白素） A與2抗的生物素結合，avidin起橋聯作用。 如將該法中的卵白素（avidin）變換成鏈霉卵白素(streptavidin)，LAB

19、法即成LsAB法，或稱SP法。 據認為LAB法比ABC法敏感24倍，而LsAB法因鏈霉卵白素不與組織細胞中內源性生物素結合而特異性更高。現在SP法已趨于取代ABC法而廣為應用。第二十七張，PPT共三十九頁，創作于2022年6月生物素化抗AB復合物酶標鏈卵白素AvidinBiotinPeroxidase抗組織抗原ABC法（3步完成）LsAB（SP）法（3步完成）第二十八張，PPT共三十九頁，創作于2022年6月鏈霉卵白素酶生物素底物抗原SP法示意圖第二十九張，PPT共三十九頁，創作于2022年6月（二）免疫組化染色步驟（以ABC法為例）1)、切片常規脫蠟至水：二甲苯雖然可以反復使用，但次數不宜多

20、。乙醇的濃度是從高到低，與脫水時相反。2)、滅活內源性酶：博士德推薦應用3%的雙氧水，但實際操作中，使用30%雙氧水和純甲醇按1:9的溶劑比混合較為理想。3)、抗原修復：暴露被交聯封閉的Ag 。4)、正常山羊血清封閉：封閉時應該注意室溫與時間的相對關系。室溫低，時間就要長一些，反之亦然。另外，保持反應池濕潤是重要的一環，否則，前功盡棄。后面的步驟也是如此。5)、一抗反應：一抗的稀釋度、孵育時間和溫度與染色強度與背景有直接關系。一般說來，陽性染色強度不夠時，可提高一抗濃度和延長孵育時間；背景過高時則相反。 孵育時間與溫度：抗原抗體充分反應是得到可靠結果的關鍵。因此，控制溫度與時間也是一個嚴肅的問

21、題。由于室溫控制較為困難，建議4冰箱過夜（18h）。第三十張，PPT共三十九頁，創作于2022年6月6)、二抗（生物素化IgG）反應：建議濕盒內 37OC1h，另外儀器顯示溫度37，但實際只有23，自然結果難以令人滿意。7)、SABC染色（37）：這是博士德的人性化之處，直接就可以用。8)、DAB顯色鏡下控時：DAB濃度應該比推薦的要低一些，這樣可以便于控制反應時間以及在合適的時候中止反應。同時注意，使用后殘余的DAB應妥善處理，而不是隨便倒入下水道，因為它有致癌性。9)、蘇木素輕度復染：不建議使用。盡管復染后標本層次分明，但實際情況是，這樣有時也會掩蓋陽性結果，從而使前功盡棄。10)、脫水透

22、明：脫水乙醇的濃度由低到高，有一個較準確判斷脫水成功與否的辦法是：觀察透明后盛二甲苯容器的壁，若發現白色霧狀現象，則說明脫水不成功，應再次脫水。透明時間不要太長，1分鐘左右就可以了。11)、封片：封片時，中性樹脂量宜少，同時注意不要產生氣泡。第三十一張，PPT共三十九頁，創作于2022年6月（三）免疫組化染色基本技術及注意事項1實驗計劃根據課題的內容選用動物，選用配套的Ab。如Ab-I鼠抗人的抗體，與其他種屬間無交叉，則不能用其他動物，而且Ab-必須是羊抗鼠，若 PAP法Ab-必須來源于鼠，否則不能連接成復合物 若要比較染色深淺在對照組與實驗組間的差 異，在貼片方面最好貼于同一張載片上，否則無可比性。 選用的試劑可靠，貨源充足，隨時可取。第三十二張，PPT共三十九頁，創作于2022年6月2Ab稀釋度 （如系購買的藥盒有工作液和原液）（1）工作液：無須稀釋（2）原液：應參照其提供的工作液濃度進行預試驗原液的保存（-20）凍存應選最佳稀度凍存。若工作濃度大于1500則要先將原液稀釋十倍，而 后分裝10l/瓶凍存（-20 ）于 冰箱備用。（3）Ab濃度的選擇 Ab濃度不可太高或太低，因為Ag-Ab結合需在一定濃度范圍內進行，若一方過剩則形成復合物小且少；極過剩時已形成的復合物亦會解體而呈現假陰性。 并非Ab濃度