1、基因工程的下游技術 重組蛋白的表達、純化和分析 重組蛋白的表達表達體系： 表達載體 原核 受體細胞 真核選擇表達載體常用的關鍵元件：啟動子和調理序列表達強弱、細胞或組織特異性、表達調理等，如本實驗的乳糖支配子。交融基因純化、標簽，或加強蛋白可溶性等。如多聚His標簽6His，便于鎳柱親和層析純化。GST交融蛋白用GST柱親和層析分泌信號挑選標志其它6His 重組蛋白的純化親和層析離子交換層析凝膠過濾層析 本單元實驗流程：細菌pEF-GFPuv 親和層析IPTG誘導細菌總蛋白重組蛋白交融蛋白乳糖支配子的特性SDS初步分析實驗十 重組DNA在大腸桿菌中的誘導表達實驗目的實驗原理資料與試劑實驗儀器操

2、作步驟本卷須知實驗安排思索與討論實驗目的了解和掌握IPTG誘導表達的原理。了解降解物阻遏的景象及其機理。實驗原理支配子是基因表達的協調單位。通常由2個以上功能相關的構造基因以及一些調理序列如啟動子序列、支配序列等組成。乳糖支配子由三個構造基因Z、Y、A和支配序列、啟動子、CAP結合位點等調理序列組成。 乳糖支配子的誘導表達當沒有乳糖存在時，調理基因lacI表達，轉錄的mRNA翻譯成阻遏蛋白。阻遏蛋白與支配序列lacO結合，妨礙了結合在旁邊啟動子的RNA聚合酶向前挪動，使構造基因不能轉錄，也就不能翻譯出蛋白質。也就是說，當沒有乳糖存在時，乳糖支配子處于妨礙形狀。 乳糖支配子的誘導表達續當有乳糖存

3、在時，乳糖轉化為異乳糖，異乳糖作為誘導物與阻遏蛋白結合，使阻遏蛋白的構象發生改動，而不能結合到支配序列上，RNA聚合酶可以從啟動子向3端挪動，于是，構造基因可以轉錄出mRNA，然后翻譯出蛋白質。也就是說，當有乳糖存在時，乳糖支配子被誘導。 乳糖支配子的誘導物是異乳糖。IPTG是異乳糖的構造類似物。由于IPTG不會被分解，它的誘導作用是耐久的。 乳糖支配子的誘導表達續本實驗所運用的表達載體上含有乳糖支配子的調理序列，目的基由于綠色熒光蛋白基因。在IPTG的誘導下，目的基因表達可加強105倍。然而，誘導表達經常遭到溫度和誘導物的影響。乳糖支配子的降解物阻遏當細菌在含有葡萄糖和乳糖的培育基中生長時，

4、通常優先利用葡萄糖，而不利用乳糖。只需當葡萄糖耗盡后，細菌才干充分利用乳糖，這種景象稱葡萄糖效應，其本質是由葡萄糖降解物引起的阻遏作用，所以又稱降解物阻遏catabolic repression。乳糖支配子的降解物阻遏續降解物阻遏的機理：代謝物基因激活蛋白Catabolite gene Activation Protein，CAP，又稱cAMP受體蛋白cAMP Receptor Protein，CRP屬于激活蛋白的一種，對乳糖支配子進展正調理。 CAP分子內分別有DNA結合區和cAMP結合區。當CAP與cAMP結合后，就可結合到CAP結合位點上，促進轉錄。 葡萄糖降解物能抑制腺苷酸環化酶的活性

5、，并活化磷酸二酯酶的活性，從而降低cAMP的濃度，抑制轉錄。 阻遏蛋白負調理與CAP正調理的協調 當阻遏蛋白封鎖轉錄時，CAP對該系統不能發揚作用；而沒有CAP存在時，即使沒有阻遏蛋白與支配序列結合，支配子仍無轉錄活性。只需在CAP存在且沒有阻遏蛋白與支配序列結合時，或者說只需高乳糖低葡萄糖時，支配子發揚最大轉錄活性。 這種協調與細菌對碳源的優先利用相一致。The structure of lac operon調理序列構造基因Repressor and negative regulation異乳糖異丙基硫代半乳糖苷異乳糖CAP and positive regulation 低乳糖時 高乳糖時

6、在協調調理下，lac operon的強誘導作用發生在高乳糖、低葡萄糖的形狀。資料與試劑資料 含pUC18質粒工程菌及含pGFPuv質粒工程菌。試劑LB 液體培育基 ： 蛋白胨tryptone10g、酵母粉yeast extract5g、NaCl 10g，加800mL雙蒸水溶解，用10M NaOH調pH至7.2-7.5，定容至1000mL。 分裝，高壓滅菌，4保管。氨芐青霉素溶液： 無菌雙蒸水配成100mg/mL，分裝，-20保管，運用終濃度為50g/mL或100g/mL。IPTG溶液： 將238.3mg IPTG溶解于10mL雙蒸水，0.22m細菌濾器過濾除菌，分裝，-20保管備用，儲存濃度為

7、100 mM。20%葡萄糖溶液： 20g葡萄糖溶解于適量雙蒸水，定容至100mL，121，15min 滅菌，4保管。實驗儀器 超凈任務臺、 恒溫搖床、離心機等。操作步驟挑取含pUC18質粒工程菌及含pGFPuv質粒工程菌單菌落，分別接種于含氨芐青霉終濃度為100g/mL，以下同)的5mL的LB培育基中，于37、250rpm過夜培育12h-14h至對數生長期。取3支已滅菌的大試管，分別參與5mL含有氨芐青霉素的LB培育液，編號為1#，2#，3#，另取一個250mL的滅菌三角瓶，編號為6#，參與50mL含氨芐青霉素的LB培育液。1#：接50L空載工程菌含pUC18過夜培育物，25-28培育10 h

8、-12h； 2#：接50L重組菌含pGFPuv過夜培育物，25-28培育10 h-12h； 3#：接50L重組菌含pGFPuv 過夜培育物，37培育至O.D600約為0.5約3h-4h)，然后參與20%葡萄糖50L至終濃度為0.2%，及100mM IPTG 5L至終濃度為0.1mM，25-28培育8h-10h或過夜； 6#：接500L重組菌含pGFPuv過夜培育物，37培育至O.D600約為0.5約3h-4h)，然后只參與100mM IPTG 50L至終濃度為0.1 mM，25-28培育8h-10h或過夜。4. 搜集菌體。分別將1#-3#全部培育物搜集到三個7mL離心管中，編上相應編號，離心棄

9、上清；三角瓶培育的50mL菌液混勻后取5mL于7mL離心管中編號為4#，離心，上清搜集到另一個指管，編號為5#，其他的培育液用 50mL離心管于5000rpm，4，離心10min，棄上清，菌體用裂解緩沖液重懸后用超聲波破碎細胞或保管于20備用見實驗十二。 5. 于紫外燈下察看1# -5#管搜集的菌體或上清液，察看哪支管有熒光，記錄察看到的景象。留意：把1#和2#管置4保管。分別標Sample1和Sample2。 1236pUC18pGFPuv挑取單菌落，接種于5mLLBA培育基中。37過夜培育。按1:100接種對照IPTG+GlcIPTG12361234525 -28培育過夜5000rpm離心

10、，收菌體取5mL離心其他離心收菌體，提取蛋白本卷須知本實驗的目的是比較該重組DNA在大腸桿菌中表達時受IPTG和葡萄糖存在的影響。在轉管培育及收菌時要留意各管編號要相應對好，不能混亂。 1#、2#管不加IPTG和葡萄糖。3#管除加IPTG外還參與葡萄糖濃度要大于0.2%以上。 6#瓶僅加IPTG 。不同的重組DNA在不同的宿主菌中蛋白的表達量往往遭到IPTG濃度和培育溫度的影響。在科研中普通都采用不同溫度或不同濃度的IPTG來誘導，以獲得最大的蛋白表達量。本實驗所表達的綠色熒光蛋白基因，其產物在大腸桿菌中有很強的熒光。離心后搜集的菌體在紫外線的照射下可見黃綠色熒光，所以把1#、2#、3#、4#

11、沉淀菌體放在紫外燈下察看其能否有熒光以及熒光的強弱，就可判別其能否有表達及其所表達的強度。實驗安排 第一天： 上午配試劑，滅菌； 下午開場接種，約3 h-4h后開場誘導。步驟2、3 第二天： 收菌、紫外察看結果和拍照； 破碎細菌，分別上清，待過柱。思索與討論對紫外燈下察看到的結果作出解釋。為什么誘導表達的大腸桿菌要在其OD600濃度約為0.5時參與IPTG？大腸桿菌的誘導表達常受哪些要素的影響？實驗十二 金屬鰲合親和層析分別目的蛋白質 實驗目的實驗原理資料與試劑實驗儀器操作步驟本卷須知實驗安排思索與討論一實驗目的學習親和層析的原理。掌握親和層析法分別蛋白質的技術與操作。實驗原理以普通凝膠作載體

12、，銜接上金屬離子制成螯合吸附劑，用于分別純化蛋白質，這種方法稱為金屬螯合親和層析。蛋白質對金屬離子具有親和力是這種方法的實際根據。知蛋白質中的組氨酸和半胱氨酸殘基在接近中性的水溶液中能與鎳或銅離子構成比較穩定的絡合物，因此，銜接上鎳或銅離子的載體凝膠可以選擇性地吸附含咪唑基和巰基的肽和蛋白質。過渡金屬元素鎳在較低pH范圍時pH 6-8，有利于選擇性地吸附帶咪唑基和巰基的肽和蛋白質。在堿性pH時吸附更有效，但選擇性降低。金屬螯合親和層析在很大程度上，由被吸附的肽和蛋白質分子外表咪唑基和巰基的稠密程度所支配，吲哚基能夠也很重要。用IPTG誘導表達的蛋白質含有特定的組氨酸標簽，這種可溶性蛋白質能用金

13、屬親和層析法進展分別，且操作簡單，快速，純化效率高。資料與試劑資料 含pUC18質粒工程菌及含重組pGFPuv質粒工程菌經誘導表達的細胞裂解蛋白。試劑0.05mol/L EDTA-0.5mol/L NaCl溶液 50mL2mol/L NaCl 溶液 50mL1mol/L NaOH溶液 50mL0.2mol/L NiSO4溶液 30mL起始緩沖液：50mmol/L Tris-HCl; 500mmol/L NaCl; pH7.0 500mLChelating Sepharose Fast Flow 4-5 mL大腸桿菌細胞裂解蛋白樣品 10-20mL洗滌液：50mmol/L咪唑；50mmol/L

14、Tris-HCl； 0.5mol/L NaCl，pH 7.0洗脫液：300mmol/L咪唑；50mmol/L Tris-HCl；0.5mol/L NaCl，pH7.0 實驗儀器 1.5cm X 50cm層析柱、自動分部搜集器、紫外分光光度計、紫外檢測儀及記錄儀等。操作步驟樣品的制備: 細胞的培育及熒光蛋白表達見實驗十，細胞的破碎及蛋白的搜集如下： 搜集在25培育的細胞培育液，5000r/min，離心10min，去上清液，菌體用起始緩沖液洗滌一次，離心搜集菌體，用三分之一細胞培育液體積15mL的起始緩沖液充分懸浮，冰浴下進展超聲波處置，功率為400W，任務4秒，間隙4 秒，為一次，99次為一周期

15、。共處置六周期。然后8000r/min,離心30min，取上清液。放冰箱備用。親和層析柱的安裝 把層析柱固定在鐵支架上，柱下端出口封鎖。參與少量的無離子水，排去下端的空氣泡。取出20%乙醇浸泡的螯合凝膠4mL到燒杯中，參與少量的無離子水制成糊狀，沿著貼緊柱內壁的玻璃棒把糊狀凝膠倒進柱內，翻開下端的排水口，讓親和凝膠劑隨水流自然沉下。親和層析劑為4-5mL。親和凝膠的再生處置：用10 倍柱體積的再生溶液0.05mol/L EDTA、 0.5mol/L NaCl過柱，流速3mL/min。1drops/2s!用5倍柱體積的2 mol/L NaCl 溶液洗親和層析柱除去多余的EDTA。流速3mL/mi

16、n。用5倍柱體積的1 mol/L NaOH溶液洗滌層析柱，流速2mL/min。用10倍柱體積的無離子水洗至pH8-9，流速3mL/min。用2倍柱體積的0.2mol/L的硫酸鎳溶液過層析柱，使凝膠金屬鎳離子結合, 流速2mL/min。過完后放置5 分鐘。用10倍柱體積的無離子水洗滌層析柱除去多余的鎳離子。流速3mL/min。用5 倍柱體積的起始緩沖溶液平衡層析柱，備用。 上樣： 先從15mL裂解上清液中取出50L預備用于電泳，作為親和層析分別前上清液中的總蛋區帶對照圖譜Sample3。然后以每分鐘1mL的流速上層析柱，分部搜集流出液，每管3mL，測得的OD280值曲線為穿流峰，取最高的一管樣品

17、液用作電泳，標Sample4。再用10mL起始緩沖液過層析柱，操作同前。 洗滌： 用含50 mmol/L咪唑的洗滌緩沖液25mL洗脫，分部搜集洗脫液，每管5mL，取中間管樣品電泳Sample5 。 洗脫： 用含300mmol/L咪唑的洗脫緩沖液10mL洗脫，用Ep管分部搜集洗脫液。每管收0.5mL。測得的OD280值曲線峰為目的蛋白峰GFP，標Sample6 。 12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測：進展12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測親和層析分別純化的結果。Sample1-6，外加Marker見實驗十一。 本卷須知不論是裝柱還是上樣、洗脫，在整個操作過程中，水或溶液面都不能低于凝膠柱

18、平面。否那么，凝膠柱會產生氣泡，就會影響層析效果。樣品上柱和洗脫過程，其流速都要慢，分別效果才好。親和層析劑可回收，經再生可循環運用。該親和層析劑用20%乙醇浸泡于冰箱保管。親和層析柱在再生處置、上樣、洗脫過程中其顏色都有明顯變化白、藍、綠，只需細心操作，樣品能否被吸附上去或被洗脫下來？都能察看到從而作出判別。實驗安排 先用母液配制其它未配制溶液，再生鎳柱；然后，過柱純化重組蛋白。 思索與討論解釋IPTG誘導表達的熒光蛋白經12 SDS電泳結果圖譜。鎳柱在再生處置、上樣、洗脫過程中其顏色有何變化？為什么？要到達好的分別效果要留意哪些問題？實驗十一 SDS電泳分別蛋白質實驗目的實驗原理資料與試劑

19、實驗儀器操作步驟本卷須知實驗安排思索與討論一.實驗目的 了解SDS靈敏度高，分辯率強的原理。用此法分析不同條件下培育的菌其熒光蛋白表達情況。 實驗原理聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質的一種電泳方法。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體acrylamide,簡稱ACR和交聯劑甲叉雙丙烯酰胺N,N-methylene bisacrylsmide 簡稱BIS在催化劑的作用下聚合交聯而成的三維網狀構造的凝膠，經過改動單體濃度與交聯劑的比例可以得到不同孔徑的凝膠。聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種：1化學聚合：催化劑采用過硫酸銨，加速劑為N、N、N、N四甲基乙二胺簡稱TEMED。通?？刂七@兩種

20、溶液的用量使聚合在1h內完成。2光聚合：通常用核黃素為催化劑，經過控制光照時間和強度來控制聚合時間也可加速反響。本實驗采用化學聚合。聚丙烯酰胺凝電泳常分為二大類：第一類為延續的凝膠僅有分別膠電泳；第二類為不延續的凝膠濃縮膠和分別膠電泳。通常聚丙烯酰胺凝膠不延續電泳有三種效應：電荷效應；電泳物所帶電荷的差別性。 凝膠的分子篩效應。凝膠的網狀構造及電泳物的大小外形不同所致濃縮效應，凝膠濃度的不延續性、緩沖液離子成分的不延續性、電位梯度的不延續性以及pH的不延續性所致。因此，樣品分別效果好，分辨率高。SDS，是在聚丙烯酰胺凝膠系統中引進SDS十二烷基磺酸鈉。SDS破壞蛋白質的二級和三級構造；強復原劑

21、使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，因此，蛋白質在一定濃度的含有強復原劑的SDS溶液中，與SDS分子按比例結合，構成帶負電荷的SDS-蛋白質復合物。這種復合物由于結合大量的SDS，降低或消除了各種蛋白質分子之間天然的電荷差別。而由于SDS與蛋白質的結合是按大小成比例的，在進展電泳時，蛋白質分子的遷移速度取決于分子大小。當分子量在15KD到200KD之間時，蛋白質的遷移率和分子量的對數呈線性關系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數。試劑30%的凝膠貯備液: Acr 29g + Bis 1g溶于100mL去離子水中。避光儲存棕色瓶中。3M Tris-HCl (p

22、H8.9): 36.6g Tris-base + 48mL 1M HCl + dH2O至100mL5Tris-甘氨酸電泳bufferpH8.3): Tris-base15.1g + 甘氨酸94g + 5gSDS + H2O至1L用時稀釋5倍。 10%SDS：10g SDS溶解于100mL去離子水中，儲存于室溫中。0.5M Tris-HCl(pH6.8): 6.05g Tris-base + 48mL 1M HCl + dH2O至100mLTEMED(四甲基乙二胺):濃度10%，20 mL (共用)10% AP(過硫酸銨):10 mL，1g AP溶解于10mL去離子水中，新穎配制。 2x樣品緩沖

23、液： 100mM Tris-HCl(pH6.8) 200mM DTT(二硫蘇糖醇) 4% SDS 0.2% 溴酚藍 20% 甘油 考馬斯亮藍染色液：0.25g考馬斯亮藍R250溶于45mL甲醇中，加10mL冰醋酸 + H2O至100mL。濾紙過濾除去不溶物 脫色液：75mL冰乙酸 + 50mL甲醇 + 875mL H2O如只配500mL，各物質減半實驗儀器 電泳儀、垂直板電泳安裝、微量進樣器50L、染色/脫色搖床等。操作步驟膠板模型的安裝：在干凈的帶隔板的玻璃板的三條邊上把橡膠條壓上，然后將另一塊凹形玻璃板壓上，放入電泳槽中。示范12%分別膠的制備每次配10 mL 去離子水 3.2mL 30%

24、 凝膠液 4.0mL 3mol/L Tris-HCl(pH8.9) 2.6mL 10% SDS 0.1mL 10% APS 0.1mL TEMED 0.005mL 用手輕搖約2分鐘混勻(留意不要產生氣泡,小心將混合液注入預備好的玻璃板間隙中，為濃縮膠留足夠的空間，悄然在頂層參與幾毫升去離子水復蓋，以阻止空氣中氧對凝合的抑制造用。剛參與水時可看出水與膠液之間有界面，后漸漸消逝，不久又出現界面，這闡明凝膠已聚合。再靜置片刻使聚合完全。 ！留意：為防止凝膠過快聚合，配膠用的無離子水、30%的凝膠液及Tris-HCl緩沖液應事先于4或冰上放置,以下同。濃縮膠的制備：先吸去已聚合好的分別膠上層的水，用水

25、洗界面一次，再用濾紙吸干殘留的水液。按以下配方制備5毫升濃縮膠溶液?；旌虾髮⑵渥⑷敕謩e膠上端，插入梳子應小心防止氣泡。 去離子水 3.2mL 30% 凝膠液 0.83mL 0.5M Tris-HCl(pH6.8) 0.75mL 10% SDS 0.050mL 10% AP 0.050mL TEMED 0.005mL在濃縮膠聚合的同時，將樣品與5樣品緩沖液16L 4L混合，100加熱3分鐘以變性蛋白質。Sample1,2用600L起始緩沖液懸浮，取16L同上操作。濃縮膠聚合完全后，小心地拔出梳子，用無離子水沖洗梳孔，將凝膠模板放入電泳槽上固定好，上下槽均參與1X電泳緩沖液，檢查有無漏液，除去兩玻璃板間凝膠底部的氣泡，上樣前用上槽緩沖液沖洗梳子孔。按次序上樣：用微量進樣器往凝膠梳孔中加樣品混合液，20L/孔，一孔加一個樣品，同時安排知分子量的規范物作對照。電泳：開場時濃縮膠電壓為80V，染料進入分別膠后，將電壓增到