1、細(xì)胞凋亡與免疫細(xì)胞凋亡的發(fā)現(xiàn)及發(fā)展歷史 1842年，Vogt發(fā)現(xiàn)一種不同于細(xì)胞壞死的細(xì)胞死亡現(xiàn)象。1887年，F(xiàn)lemming將對(duì)這種細(xì)胞死亡做了形態(tài)描述。1972年，Kerr首次提出細(xì)胞凋亡的概念。1973年，首次在細(xì)胞凋亡中發(fā)現(xiàn)DNA的降解。今天，細(xì)胞凋亡進(jìn)入分子階段的研究，近幾年已進(jìn)入臨床應(yīng)用階段。H. Robert Horvitz Sydney Brenner John E. Sulston The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2002 課程內(nèi)容凋亡的概念；凋亡的形態(tài)學(xué)特征和生化改變；凋亡的檢測(cè)；凋亡的分期；凋亡的誘導(dǎo)因素和抑制因素；凋亡

2、的生物學(xué)意義凋亡相關(guān)基因；免疫相關(guān)的凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；凋亡與免疫生理；凋亡與免疫病理。Apoptosis and necrosis細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，遵循自身的程序，由基因調(diào)控的主動(dòng)的死亡過程。它是一個(gè)主動(dòng)的，高度有序的，基因控制的，一系列酶參與的過程。細(xì)胞壞死是由于某些外界的因素，如局部貧血、高熱以及物理、化學(xué)損傷和生物的侵襲等，造成細(xì)胞急速死亡而結(jié)束其生命。 壞死 凋亡 性質(zhì) 病理性 生理性或病理性生化特點(diǎn) 被動(dòng)過程，無新蛋白合成， 主動(dòng)過程，有新蛋白會(huì)成， 不耗能 耗能細(xì)胞數(shù)量 成群細(xì)胞死亡，組織損傷 單個(gè)細(xì)胞丟失細(xì)胞形狀 破裂成碎片 形成凋亡小體形態(tài)變化 細(xì)胞腫脹、破

3、壞、細(xì)胞結(jié)構(gòu) 細(xì)胞膜及細(xì)胞器相對(duì)完整， 全面溶解 細(xì)胞皺縮，核固縮 染色質(zhì) 稀疏、分散、呈絮狀 致密、固縮、邊集或中集DNA電泳 隨機(jī)降解，電泳呈彌漫條帶 DNA片段化( 80-200bp)， 電泳呈梯狀條帶炎癥反應(yīng) 溶酶體破裂，局部炎癥反應(yīng) 溶酶體相對(duì)完整，局部無炎 癥反應(yīng)基因調(diào)控 無 有 潛伏期 無 數(shù)小時(shí)細(xì)胞凋亡與壞死的比較細(xì)胞凋亡與壞死的形態(tài)變化細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化 細(xì)胞膜的變化：微絨毛、細(xì)胞突起和細(xì)胞表面皺褶消失；胞膜迅速發(fā)生空泡化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不斷擴(kuò)張并與胞膜融合，形成膜表面的芽狀突起，稱為出芽(budding)。細(xì)胞凋亡中細(xì)胞膜的變化細(xì)胞質(zhì)的變化：胞質(zhì)濃縮：由于胞質(zhì)脫水而導(dǎo)致細(xì)胞皺縮、

4、致密及固縮(condensation)，是細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化的一大特征；細(xì)胞器變化：線粒體變大，嵴增多，增殖并空泡化。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔擴(kuò)大、增殖并在凋亡細(xì)胞形成自噬體過程中提供包裹膜。其他多數(shù)細(xì)胞器完整存在，變得致密。細(xì)胞核的變化：染色質(zhì)濃縮，形成染色質(zhì)塊，并聚集在核膜的邊緣，呈新月形、馬蹄形或舟狀分布，稱為染色質(zhì)邊聚(margination)；或聚集在核中央，稱為染色質(zhì)中聚。隨著染色質(zhì)進(jìn)一步聚集，核纖層斷裂消失，核膜在核膜孔處斷裂，兩斷端向內(nèi)包裹將聚集的染色質(zhì)塊分割，形成若干個(gè)核殘塊。凋亡小體形成： 胞膜皺縮內(nèi)陷，分割包裹胞質(zhì)，內(nèi)含DNA物質(zhì)及細(xì)胞器，形成泡狀小體稱為凋亡小體(apoptosis b

5、ody)，這是凋亡細(xì)胞特征性的形態(tài)學(xué)改變。凋亡小體呈圓形、橢圓形或不規(guī)則狀，小體內(nèi)的成份主要是胞質(zhì)、細(xì)胞器和核碎片。吞噬： 凋亡小體形成后，鄰近巨噬細(xì)胞識(shí)別由細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)移到外側(cè)的磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine, PS)，并吞噬和消化凋亡小體。整個(gè)凋亡過程沒有細(xì)胞內(nèi)容物的外漏，因而不伴有局部的炎癥反應(yīng)。繼發(fā)性壞死(secondary necrosis)： 在體外誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)，由于沒有巨噬細(xì)胞吞噬凋亡小體，凋亡小體會(huì)發(fā)生繼發(fā)性壞死。體內(nèi)也有發(fā)現(xiàn)，機(jī)制不明。細(xì)胞凋亡的生化改變 胞漿Ca2+升高，pH降低；內(nèi)源性Ca2+/Mg2+依賴性核酸內(nèi)切酶激活，Zn2+是其抑制劑；生物大

6、分子的合成。但CTL、NK細(xì)胞釋放的顆粒酶誘導(dǎo)的靶凋亡無需新的RNA和蛋白的合成；線粒體內(nèi)膜的跨膜電位降低、呼吸鏈?zhǔn)軗p、ATP生成減少、細(xì)胞活性氧(ROS)產(chǎn)生增多、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(permeability transition pore, PTP)開放和線粒體膜通透性增高，導(dǎo)致線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor,AIF)、凋亡蛋白酶激活因子(apoptotic protease activating factor， Apaf)等凋亡啟動(dòng)因子釋放入胞漿。從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè)；磷脂酰絲氨酸外翻分析(Anne

7、xin V法)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡；DNA片斷化檢測(cè)；脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。HeLa細(xì)胞凋亡過程中核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)變化Confocal觀察HeLa細(xì)胞凋亡過程中的FITC-Annexin V和PI染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡在凋亡發(fā)生的各個(gè)過程當(dāng)中，都有相應(yīng)的流式細(xì)胞儀的檢測(cè)方法，可以采用以下檢測(cè)方法： 1、線粒體功能 2、DNA Cycle 3、Caspases 4、Annexin V Assay 5、DNA Fragm

8、entation AssaysAnnexin V AssayDNA Cycle AssayDNA LadderDNA LadderTUNEL法細(xì)胞凋亡的分期誘導(dǎo)期：凋亡誘導(dǎo)因素作用于細(xì)胞后，細(xì)胞通過復(fù)雜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑將信號(hào)傳入胞內(nèi)，由細(xì)胞決定生存或死亡；執(zhí)行期：決定死亡的細(xì)胞將按預(yù)定程序啟動(dòng)凋亡，激活凋亡所需的各種酶類及降解相關(guān)物質(zhì)，形成凋亡小體；消亡期：凋亡的細(xì)胞被鄰近的巨噬細(xì)胞所吞噬并在巨噬細(xì)胞內(nèi)降解。細(xì)胞凋亡的分期凋亡小體的吞噬巨噬細(xì)胞上的分子： ABC1 (the class A scavenger receptors); CD36 (the class B scavenger rece

9、ptors); CD14 (the class B scavenger receptors); v3-integrin (the vitronectin receptor).凋亡小體上的分子： anionic phospholipids; PS; ICAM3.細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)因素細(xì)胞的生存和死亡是對(duì)立統(tǒng)一的兩個(gè)方面。在進(jìn)化過程中控制細(xì)胞生死的程序已經(jīng)以基因的形式存儲(chǔ)于細(xì)胞中，正常情況下這兩類基因處于協(xié)調(diào)的對(duì)立統(tǒng)一狀態(tài)，以確保細(xì)胞生死有序。當(dāng)細(xì)胞受到來自細(xì)胞內(nèi)外的凋亡誘導(dǎo)因素作用時(shí)凋亡程序就會(huì)啟動(dòng)。常見誘導(dǎo)因素有：激素和生長(zhǎng)因子失衡；理化因素； 免疫性因素；微生物學(xué)因素；其他。1、激素和生長(zhǎng)因子失

10、衡： 生理水平的激素和生長(zhǎng)因子是細(xì)胞正常生長(zhǎng)不可缺少的因素，一旦缺乏，細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡；相反，某些激素或生長(zhǎng)因子過多也可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，例如：強(qiáng)烈應(yīng)激引起大量糖皮質(zhì)激素分泌，后者誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡，致使淋巴細(xì)胞數(shù)量減少。2、理化因素： 射線、高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、乙醇、抗癌藥物等，均可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。例如：電離輻射可產(chǎn)生大量氧自由基，使細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，DNA受損，引起細(xì)胞凋亡。3、免疫性因素： 在生長(zhǎng)、分化及執(zhí)行防御、自穩(wěn)、監(jiān)視功能中，免疫細(xì)胞可釋放某些分子導(dǎo)致免疫細(xì)胞本身或靶細(xì)胞的凋亡。例如： CTL細(xì)胞可分泌顆粒酶，引起靶細(xì)胞發(fā)生凋亡。4、微生物學(xué)因素： 細(xì)菌、病毒等致病微生物及其毒素可誘導(dǎo)細(xì)胞

11、凋亡。例如：HIV感染時(shí)，可致大量CD4+ T淋巴細(xì)胞凋亡。5、其他如缺血與缺氧，失去基質(zhì)附著等因素都可引起細(xì)胞凋亡。在腫瘤治療中，單克隆抗體、反義寡核苷酸、抗癌藥物等均可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。 細(xì)胞凋亡的抑制因素細(xì)胞因子 IL2、神經(jīng)生長(zhǎng)因子等具有抑制凋亡的作用；某些激素如ACTH、睪丸酮、雌激素等對(duì)于防止靶細(xì)胞凋亡，維持其正常存活是必需的。例如：當(dāng)腺垂體被摘除或功能低下時(shí)，腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞失去ACTH刺激，可發(fā)生細(xì)胞凋亡，引起腎上腺皮質(zhì)萎縮。睪丸酮對(duì)前列腺細(xì)胞，雌激素對(duì)子宮平滑肌細(xì)胞都有類似的作用。某些二價(jià)金屬陽離子如Zn2+ ，藥物如苯巴比妥，病毒如EB病毒，以及中性氨基酸等也具有抑制細(xì)胞凋亡

12、的作用。細(xì)胞凋亡的生物學(xué)意義發(fā)育生物學(xué)意義；生理學(xué)意義：參與了正常成年組織細(xì)胞更新、生理器官的內(nèi)分泌調(diào)控(如子宮產(chǎn)后復(fù)原，月經(jīng)期子宮內(nèi)膜的脫落)以及對(duì)受損不能修復(fù)的細(xì)胞或突變細(xì)胞的清除等重要生理過程，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。免疫學(xué)意義：當(dāng)機(jī)體受到病原微生物感染時(shí)，宿主細(xì)胞發(fā)生主動(dòng)凋亡，導(dǎo)致被感染細(xì)胞的死亡和微生物的清除。這是一種積極的防御功能。淋巴細(xì)胞的陰、陽性選擇，活化誘導(dǎo)的T細(xì)胞死亡以及淋巴細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的攻擊都是通過凋亡完成的。 發(fā)育中的細(xì)胞凋亡蝌蚪尾的消失發(fā)育過程中手和足的成形過程CTL細(xì)胞使腫瘤細(xì)胞凋亡在生物進(jìn)化過程中，多細(xì)胞生物獲得了細(xì)胞凋亡的能力，可以使單個(gè)細(xì)胞的死亡對(duì)周圍微環(huán)境的負(fù)面

13、影響降至最小。這對(duì)于多細(xì)胞生物而言是十分重要的。細(xì)胞壞死也不是完全沒有生物意義。例如：植物經(jīng)常用死亡的組織作為其結(jié)構(gòu)成分。另外，在凋亡通路被敲除的小鼠中，其前肢發(fā)育過程中的細(xì)胞丟失是通過細(xì)胞壞死來完成的。凋亡相關(guān)基因凋亡的啟動(dòng)者：TNF家族、細(xì)胞色素C 凋亡的執(zhí)行者：Caspase家族凋亡的調(diào)節(jié)者： 抑制凋亡基因：如IAP、Bcl-2等； 促進(jìn)凋亡基因：如Apaf-1、Bax、p53等； 雙向調(diào)控基因：如c-myc、Bcl-x等。Genes and molecules that regulate apoptosis(1) Gene/molecule EffectsBcl-2 subfamily

14、 (Ced9 in C elegans) Bcl-2 Promotes survival Bcl-xl Promotes survival Bcl-w Promotes survival Bcl-xs Promotes deathBax family Bax Promotes death Bak Promotes death Bok Promotes deathBH3 subfamily Bad Promotes death Bik Promotes death Bid Promotes death Blk Promotes death HRK Promotes death BimL Prom

15、otes death Egl (C elegans) Promotes deathGenes and molecules that regulate apoptosis(2) Gene/molecule EffectsCaspases 113(Ced3 in C elegans) These interleukin 1 converting enzyme (ICE) like cysteine protein- ases form a central part of the apop- totic cascade.Apaf-1 (Ced4 in C elegans) These adaptor

16、 molecules link caspase (Ced3) activation and Bcl-2 (Ced9) expression. Their functions in promoting death or survival remain to be defined.p53 family p53 is necessary for apoptosis induced by agents that cause DNA damage. p53 can also affect the expression of bcl-2 and bax directly.Nitric oxide This

17、 molecule prevents apoptosis by altering bcl-2 expression and by nitrosylation of caspasesCytochrome c This molecule induces apoptosis via caspase activation凋亡蛋白酶(cysteinecontaining asparte-specific protease, caspase)都是含有半胱氨酸的蛋白酶，作用部位都在天冬氨酸殘基的羧基與下一個(gè)氨基酸的氨基形成的肽鍵；以酶原的形式存在，并且在體內(nèi)低水平組成性表達(dá)。以級(jí)聯(lián)放大的方式活化。活化的Ca

18、spase分子催化裂解眾多的效應(yīng)分子，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。 都是由兩大、兩小亞基組成的異四聚體，大、小亞基由同一基因編碼，前體被切割后產(chǎn)生兩個(gè)活性亞基。Caspase的異四聚體Caspase的分類ICE亞族，參與炎癥反應(yīng)；CED-3家族，參與細(xì)胞凋亡，又分為兩類：initiator caspase：caspase-2、8、9、10； caspase-2、8、10參與死亡受體通路，caspase9參與線粒體通路。Executioner or effector caspase ：caspase-3、6、7。Caspase分子的Pro-domain起始Caspase分子的Pro-domain長(zhǎng)度大于100

19、個(gè)氨基酸，往往含有明顯的功能域，如DED(death effector domain)，CARD(Caspase recruitment domain) 等。這些功能域參與Caspase分子之間的相互作用及Pro-caspase活化及Caspase分子的亞細(xì)胞定位等。效應(yīng)Caspase分子的Pro-domain長(zhǎng)度則小于30個(gè)氨基酸，其功能可能是抑制Caspase被募集和活化。在Pro-caspase活化的過程中，Pro-domain會(huì)被剪切下來，可以抑制活化的Caspase分子的進(jìn)一步剪切，這可能是一種反饋機(jī)制。caspase-2、8、10的Pro-domainCaspase的效應(yīng)機(jī)制 滅活

20、DNA酶抑制物；直接破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)；滅活細(xì)胞凋亡的抑制物(如 Bcl-2)，不僅消除了Bcl-2蛋白的抗凋亡作用，而且Bcl-2水解片段也有促細(xì)胞凋亡的作用； 滅活或下調(diào)與DNA修復(fù)有關(guān)的酶；基因表達(dá)調(diào)控。滅活DNA酶抑制物正常活細(xì)胞因?yàn)楹怂崦柑幱跓o活性狀態(tài)，這是由于核酸酶和抑制物結(jié)合在一起，如果抑制物被破壞，核酸酶即可激活，引起DNA片段化。現(xiàn)知caspase可以裂解這種抑制物而激活核酸酶，因而把這種酶稱為Caspase激活的脫氧核糖核酸酶(caspase-activated deoxyribonulease CAD)，而把它的抑制物稱為ICAD。在正常情況下，CAD不顯示活性是因?yàn)镃AD-I

21、CAD以一種無活性的復(fù)合物形式存在。ICAD一旦被Caspase水解，即賦予CAD以核酸酶活性，DNA片段化即產(chǎn)生。有意義的是CAD只在ICAD存在時(shí)才能合成并顯示活性，提示CAD-ICAD以一種共轉(zhuǎn)錄方式存在，因而ICAD對(duì)CAD的活化與抑制都是必需的。 CAD(caspase-activated Dnase)的激活死亡底物-PARPPARP (poly (ADP-ribose) polymerase, 多聚(ADP-核糖)聚合酶)，為存在于多數(shù)真核細(xì)胞中的一種修飾酶，與DNA修復(fù)、基因完整性監(jiān)護(hù)有關(guān)。活化的caspase-3能切割116kd的PARP成為85kd的片段，這是細(xì)胞凋亡過程的特

22、征性標(biāo)志，因此，85kd的片段又叫凋亡片段。結(jié)果使受PARP負(fù)調(diào)控影響的Ca2+/Mg2+依賴性核酸內(nèi)切酶的活性增高，裂解核小體間的DNA，引起細(xì)胞凋亡。大多數(shù)情況下，116kd的PARP被蛋白酶切割以后，細(xì)胞便進(jìn)入凋亡途徑，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，所以PARP也被稱為死亡底物。 凋亡酶激活因子-1(apoptotic protease activating factor-1, Apaf-1)Apaf-1在線蟲中的同源物為ced-4，在線粒體參與的凋亡途徑中具有重要作用。Apaf-1含有3個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域：CARD結(jié)構(gòu)域，能召集caspase-9；NBD 結(jié)構(gòu)域，能結(jié)合ATP/dATP；C端的WD40

23、結(jié)構(gòu)域，含有色氨酸/天冬氨酸重復(fù)序列，當(dāng)細(xì)胞色素c的結(jié)合到這一區(qū)域后，能引起Apaf-1多聚化而激活。Apaf-1具有激活Caspase-3的作用，而這一過程又需要細(xì)胞色素c(Apaf-2)和caspase-9(Apaf-3)參與。Apaf-1/細(xì)胞色素c復(fù)合體與ATP/dATP結(jié)合后，Apaf-1就可以通過其CARD結(jié)構(gòu)域召集caspase-9，形成凋亡體(apoptosome)，激活caspase-3，啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)。凋亡體(apoptosome)凋亡體的組裝分子警察P53一種抑癌基因，野生型p53蛋白是一種DNA結(jié)合蛋白，在G期監(jiān)視DNA的完整性，具有轉(zhuǎn)錄激活作用。Bax基因

24、首先被發(fā)現(xiàn)可由p53誘導(dǎo)，其它被p53誘導(dǎo)參與細(xì)胞凋亡的基因有fas、Apaf-1等。突變型p53(mtp53)基因編碼的P53蛋白對(duì)細(xì)胞凋亡有抑制作用。人類腫瘤一半以上具有p53基因突變和缺失。 p53導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的三個(gè)步驟：誘發(fā)氧化還原相關(guān)基因的表達(dá)；制造活性氧因子；氧化破壞線粒體的細(xì)胞膜，使細(xì)胞死亡。Bcl-2家族 Bcl-2家族的作用機(jī)制Bcl-2家族的結(jié)構(gòu)和能形成離子通道的一些毒素非常相似，可以插入膜結(jié)構(gòu)中形成較大的通道，允許細(xì)胞色素c等蛋白質(zhì)通過線粒體膜，從而導(dǎo)致凋亡；Bcl-2家族蛋白對(duì)于PTP 孔(permeability transition pore)的開放和關(guān)閉起關(guān)鍵的調(diào)

25、節(jié)作用。PTP孔主要由位于內(nèi)膜的腺苷轉(zhuǎn)位因子(Adenine nucleotide translocator, ANT)和位于外膜的電壓依賴性陰離子通道(Voltage dependent anion channel，VDAC)等蛋白所組成，PT孔開放會(huì)引起線粒體跨膜電位下降和細(xì)胞色素c釋放。促凋亡蛋白Bax等可以通過與ANT或VDAC的結(jié)合介導(dǎo)PTP孔的開放，而抗凋亡類蛋白如Bcl-2、Bcl-xL等則可通過與Bax競(jìng)爭(zhēng)性地與ANT結(jié)合，或者直接阻止Bax與ANT、VDAC的結(jié)合來發(fā)揮其抗凋亡效應(yīng)。現(xiàn)在普遍認(rèn)為，Bcl-2家族中抑制凋亡因子與促進(jìn)凋亡因子的比例決定細(xì)胞的命運(yùn)。主要分布在線粒體

26、膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、核膜等處，是膜整合蛋白。其高表達(dá)能阻抑多種凋亡誘導(dǎo)因素(如糖皮質(zhì)激素、射線照射、佛波酯等)所引發(fā)的細(xì)胞凋亡。其抗凋亡機(jī)制有：阻止線粒體膜電位的下降和通透性的增強(qiáng)，抑制線粒體釋放促凋亡因子，從而防止細(xì)胞凋亡；阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+流的釋放，使胞漿中Ca2+水平維持穩(wěn)定；能結(jié)合Apaf-1和caspase-9，并維持其非活化狀態(tài)，阻止caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，防止細(xì)胞凋亡；抑制促凋亡的Bax，Bak細(xì)胞毒作用；直接的抗氧化作用。Bcl-2Bax (Bcl-2 associated X protein, Bcl-2相關(guān)X蛋白) Bax首先因與Bcl-2形成異源二聚體而被發(fā)現(xiàn)。Bax具有孔形成

27、能力，并能誘導(dǎo)細(xì)胞色素c的釋放，激活caspase-9，啟動(dòng)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)。Bcl-2可以與Bax形成異源二聚體，能抑制Bax誘導(dǎo)細(xì)胞色素c的釋放的作用，從而阻止細(xì)胞凋亡。但是Bax不但可以與Bcl-2形成異源二聚體，也可以自身形成同源二聚體。這些多聚體的形成是通過Bcl-2家族的同源區(qū)BH1和BH2實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)Bax在細(xì)胞內(nèi)超表達(dá)，并形成同源二聚體時(shí)，細(xì)胞對(duì)死亡信號(hào)的反應(yīng)增強(qiáng)。所以Bcl-2與Bax的比例，即Bcl-2/Bax異源二聚體與Bax/Bax同源二聚體的比例，決定了細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)的反應(yīng)。Bcl-2與Bax的比例決定細(xì)胞凋亡與否 Bid死亡受體通路和線粒體通路的聯(lián)系者Bid蛋白是Bcl

28、-2家族中促凋亡類的蛋白，是Fas細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中的一種特異性底物。被死亡受體如Fas，TNF激活的caspase-8可切割Bid，使其變?yōu)橛谢钚缘膖Bid(truncated Bid)。tBid導(dǎo)致Bax轉(zhuǎn)位和構(gòu)象變化，使Bax得以插入線粒體膜，誘導(dǎo)細(xì)胞色素c從線粒體泄漏到胞漿，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。 Bax轉(zhuǎn)位和插入依賴于Bid。Bid經(jīng)caspase-8 切割可以放大Fas/TNF細(xì)胞凋亡信號(hào)，經(jīng)修剪后的tBid,能將細(xì)胞凋亡信號(hào)自胞質(zhì)傳遞至線粒體使之釋放細(xì)胞色素c，引發(fā)第二條通路。提示上述兩條通路有交叉。凋亡抑制蛋白(IAPs, inhibitors of Apoptosis protien

29、)家族是一組可以抑制細(xì)胞凋亡的蛋白， IAP既通過BIR結(jié)構(gòu)域抑制抑制caspase-3，7，9等的活性，也通過RING結(jié)構(gòu)域催化caspase泛素化降解，從而阻止多種因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Smac/DIABLO Smac/DIABLO在溶液中以同源二聚體存在，可以結(jié)合在IAP上，拮抗其作用，對(duì)caspase3的成熟及成熟后的活性進(jìn)行調(diào)控，促進(jìn)凋亡。Smac/DIABLO的N端的7個(gè)保守氨基酸對(duì)其功能是必須的。Caspase-8激活的Caspase-3活性能被凋亡蛋白抑制IAP阻斷，然而Caspase-8 可以激活Bid , tBid能促使線粒體協(xié)同釋放Cytc和Smac，Smac捕獲IAP而重

30、新激活Caspase-3。這個(gè)過程可被Bcl-2或者Bcl-xL阻斷。機(jī)理是Bcl-2或者Bcl-xL可阻止線粒體內(nèi)容物的釋放。凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor，AIF) AIF是由X染色體上單拷貝基因編碼的保守的黃素蛋白，先在胞漿中合成其前體，然后移位至線粒體的內(nèi)外膜間隙，與FAD結(jié)合形成成熟的AIF，具有雙重功能。正常時(shí)AIF作為線粒體氧化還原酶，能催化細(xì)胞色素c和NAD之間的電子傳遞。在各種凋亡誘導(dǎo)因子的作用下，AIF從線粒體釋放至胞漿，然后進(jìn)入細(xì)胞核，與Endo G一起引起細(xì)胞染色體的凝聚和斷裂成50kD的大片斷等凋亡的特征性改變。釋放入胞漿的AIF通過

31、促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素c而增強(qiáng)凋亡信號(hào)。AIF引起的細(xì)胞凋亡不依賴于caspase的活性，但AIF和Cyt c/caspase/CAD誘導(dǎo)的凋亡通路之間并不是完全獨(dú)立的，胞漿中的AIF可以使線粒體釋放更多的Cyt-c，而活化的caspase也能使線粒體釋放AIF因子。c-myc重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子；既可激活介導(dǎo)細(xì)胞增殖的基因，也可激活介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基因，具有雙向調(diào)節(jié)作用；在c-myc基因表達(dá)后，如果沒有足夠的生長(zhǎng)因子持續(xù)作用，細(xì)胞就發(fā)生凋亡；反之，細(xì)胞就處于增殖狀態(tài)。 免疫相關(guān)的凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)死亡受體途徑線粒體途徑顆粒酶B途徑死亡受體與配體FLIP(FLICE-like inhibitory pr

32、otein)caspase8 也稱為FLICE(FADD homologous ICE like proteinase)。 FLIP在結(jié)構(gòu)與序列上與caspase-8有很多相似之處，能抑制caspase-8 結(jié)合到死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物(DISC)上從而阻斷Fas 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)。死亡受體途徑Fas/FasL信號(hào)通路在免疫系統(tǒng)中的作用參與免疫調(diào)節(jié)，活化成熟的外周T細(xì)胞主要通過Fas/FasL系統(tǒng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡清除與自身抗原有交叉反應(yīng)的克隆和由自身抗原激活的細(xì)胞克隆，以限制T細(xì)胞克隆的無限增殖，防止對(duì)自身組織的損傷，即產(chǎn)生外周免疫耐受。淋巴細(xì)胞凋亡異常導(dǎo)致的免疫耐受失控，是自身免疫性疾病的主

33、要病因；其二是CTL可以通過FasL誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡；某些腫瘤細(xì)胞也可以通過這一途徑誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡，從而逃脫免疫監(jiān)控。線粒體途徑死亡受體途徑與線粒體途徑的整合對(duì)Fas應(yīng)答的細(xì)胞：type I型細(xì)胞：如胸腺細(xì)胞； 其caspase-8有足夠的活性，被Fas活化后導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，在這類細(xì)胞中高表達(dá)Bcl-2不能抑制Fas誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。type II型細(xì)胞：如肝細(xì)胞。 Fas介導(dǎo)的caspase-8活化不能達(dá)到足夠的水平，因此這類細(xì)胞中的凋亡信號(hào)需要借助凋亡的線粒體途徑來放大。死亡受體途徑與線粒體途徑的整合.Mitochondrial PathwayDeath Receptor PathwayFas

34、LCaspase 3DDDDFas/Apo1/CD95FADDProcaspase 8Caspase 8BIDoxidantsceramideothersBcl-2DCytochrome cdATPProcaspase 9Apaf -1dATPApaf -1Caspase 9Procaspase 3apoptosomeDNA damageCellular targets線粒體的雙重功能線粒體既是細(xì)胞的能量工廠，也是細(xì)胞的凋亡控制中心。顆粒酶B途徑顆粒酶中B是最主要的效應(yīng)分子。GraB可以在細(xì)胞質(zhì)、線粒體和細(xì)胞核三個(gè)層次作用于不同的分子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。最早發(fā)現(xiàn)它能激活CASPASE-3，從而使細(xì)胞

35、走向凋亡。另外，GraB也可能作用于CASPASE家族的其他成員，如CASPASE 8。GraB還作用于線粒體的內(nèi)膜，破壞線粒體的結(jié)構(gòu)，而且不依賴于CASPASE的活性。據(jù)報(bào)道，GraB可以直接酶解Bid等，啟動(dòng)細(xì)胞色素C的釋放，而且這種途徑勿需激活CASPASE 。免疫相關(guān)的凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞凋亡和免疫生理T細(xì)胞在胸腺中的發(fā)育分化與凋亡；B細(xì)胞在骨髓中的發(fā)育分化與凋亡；外周免疫自穩(wěn)與細(xì)胞凋亡；CTL與NK細(xì)胞的致凋亡效應(yīng)。T細(xì)胞在胸腺中的發(fā)育分化與凋亡前體T細(xì)胞在IL-7作用下，高表達(dá)Bcl-2或缺失Bax，存活；TCR基因重排后，不表達(dá)功能性TCR的前T細(xì)胞通過死亡受體途徑凋亡；陽性選擇中， Bcl-2起關(guān)鍵性作用；陰性選擇可能涉及Fas死亡受體途徑，另外Bim可能起重要作用。B細(xì)胞在骨髓中的發(fā)育分化與凋亡BCR基因重排中，Bax/Bak可以誘導(dǎo)未成功重排的前B細(xì)胞凋亡；陰性選擇中，Bcl-2起關(guān)鍵性作用。外周免疫自穩(wěn)與細(xì)胞凋亡活化的T細(xì)胞的凋亡：活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(AICD)：主要通過死亡受體途徑；死亡忽視途徑：由于細(xì)胞因子撤離所致，可能主要通過線粒體途徑。正信號(hào)的撤除，不是負(fù)信號(hào)成熟B細(xì)胞的凋亡：主要通過Fas死亡受體途徑。 活化誘導(dǎo)的T細(xì)胞死亡正常的T淋巴細(xì)胞在受到入侵的抗原刺激后，T淋巴細(xì)胞被激活，并誘導(dǎo)出一系列的免疫應(yīng)答反應(yīng)。機(jī)體為了防止過高的免疫應(yīng)答，或防止這