1、Arg9/人抗HBsAg單鏈抗體/ EGFP交融卵白基因的構建、表達及活性分薛茜，溫偉紅，孟艷玲，張勇，張巍，王濤，張瑞，楊安鋼【關鍵詞】肝炎,乙型；肝炎外貌抗原,乙型；SFv；Arg9【Keyrds】hepatitisB;hepatitisBsurfaeantigens;SFv;Arg9【摘要】目的：構建帶有轉膜布局域Arg9編碼序列的R9/SFv14/EGFP交融基因，將其轉化入大腸桿菌中舉行表達，并闡發(fā)表達產物與HBsAg的結合活性.要領：方案引物，將Arg9的編碼序列引入單鏈抗體基因的5端，PR擴增后得到帶有Arg9編碼序列的SFv14基因，將PR產物連入pD18T載體，舉行序列測定.

2、將測序準確的SFv14基因和R9/SFv14基因別離與EGFP基因毗連后轉化入原核表達載體pET32a，得到SFv14/EGFP和R9/SFv14/EGFP兩種交融基因的表達載體，轉化大腸桿菌BL21(DE3)LysS，以IPTG誘導表達，對表達產物舉行SDSPAGE闡發(fā)，并用間接ELISA要領檢測其與HBsAg的親和活性.結果：經(jīng)酶切斷定及測序證明SFv14/EGFP交融基因和R9/SFv14/EGFP交融基因序列完全準確.SDSPAGE闡發(fā)表白兩種交融基因在大腸桿菌BL21中樂成得到表達，表達量別離占菌體總卵白的20%和25%.間接ELISA檢測證明所表達的SFv14/EGFP交融卵白和R

3、9/SFv14/EGFP交融卵白均具有HBsAg結合活性.結論：樂成構建了帶有轉膜布局域Arg9編碼序列的R9/SFv14/EGFP交融基因，并在大腸桿菌BL21中樂成表達，表達產物SFv14/EGFP和R9/SFv14/EGFP均具有與抗原HBsAg特異性結合的活性.【關鍵詞】肝炎，乙型；肝炎外貌抗原，乙型；SFv；Arg90弁言1質料和要領1.2要領14F5TTTGAATTATGGAGGTGAGTGGTGGAGT3；14R9F5TTTGAATTATGAGAGAGGAGAGAGGGGAGAGGGAGGTGAGTGGTGGAGT3；L35TTTGGATTGATTGATTTATTGGT3.此中劃

4、線部門為九聚精氨酸的編碼序列.2結果2.1目的基因擴增和酶切斷定PR產物經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠電泳證明別離擴增出巨細約為750bp和780bp的條帶(圖1A).測序結果證明擴增的SFv14和R9/SFv14基因完全準確.用ER和BaH雙酶切斷定，得到巨細約為750bp和780bp的條帶，與預期長度符合圖1B.2.2原核表達載體的酶切斷定重組載體pET32aSFv14/EGFP和pET32aR9/SFv14/EGFP用限定性內切酶ER和BaH雙酶切SFv14和R9/SFv14基因，別離得到巨細約為750bp和780bp的條帶；用ER和Nt雙酶切交融卵白基因，別離得到巨細約為1490bp和1520

5、bp的條帶,與預期長度符合圖2.2.3重組交融卵白表達的斷定和闡發(fā)SDSPAGE闡發(fā)表現(xiàn)，與未誘導菌比擬，兩種誘導菌在r約為73ku處均有一特異性卵白條帶，同預期的巨細符合.經(jīng)凝膠成像體系掃描表現(xiàn)，它們的表達量別離約占菌體總卵白的20%和25%圖3.取IPTG誘導后的菌液舉行超聲裂解，別離取其裂解上清和沉淀舉行SDSPAGE闡發(fā)，電泳結果表現(xiàn)兩種目的卵白均重要存在于誘導菌的裂解上清中圖4.2.4重組交融卵白的esternblt闡發(fā)在r約為73ku處有一特異性卵白條帶(圖5)，與SDSPAGE闡發(fā)結果符合，說明該誘導卵白為目的卵白.2.5交融卵白親和活性的ELISA檢測間接ELISA檢測結果表現(xiàn)

6、表達的兩種SFv14/EGFP交融卵白均能與HBsAg抗原特異性結合(圖6),二者比擬，R9/SFv14/EGFP與HBsAg的親和力稍大于SFv14/EGFP與HBsAg，但不具有統(tǒng)計學意義P0.05.2，4:未誘導的pET32a和pET32aR9/SFv14/EGFP的全菌卵白質；3，5：IPTG誘導的pET32a和pET32aR9/SFv14/EGFP的全菌卵白質.B1:arker；2，4:未誘導的pET32a和pET32aSFv14/EGFP的全菌卵白質；3，5：IPTG誘導的pET32a和pET32aSFv14/EGFP的全菌卵白質.3討論自然Fv片斷中VH和VL為非共價性結合，是抗

7、體分子中保存抗原結合部位的最小成效片斷.將VH和VL用一個小肽(linker)毗連起來，即單鏈抗體.單鏈抗體易與效應分子相連，與其他卵白交融，可得到具有多種生物學成效的交融卵白.比年來，以單鏈抗體為導向物的免疫交融卵白在抗腫瘤、抗病毒等的治療和診斷方面顯現(xiàn)了遼闊的遠景，引起了人們的普及存眷.由單鏈抗體與毒素、酶、細胞因子等的基因相連的免疫交融卵白，可以結合到特定的靶部位，高效的發(fā)揮生物學成效6-7.卵白轉膜布局域PTDs是一類可以或許介導與之交融的卵白內化入細胞的短肽.它們作為內化的東西被普及應用，它不但可以使多肽、多聚核苷酸、微小微粒進入細胞，乃至可以在體內介導卵白質的內化8.Futaki等

8、9創(chuàng)造多種富含精氨酸的肽都具有轉膜作用.在比力了差異長度的多聚精氨酸對內化服從的影響之后，他們創(chuàng)造八聚精氨酸Arg8的內化結果最好.ender等10創(chuàng)造Arg9具有更高效的內化作用.我們接納轉膜布局域Arg9來加強交融卵白的轉膜成效，以期使產物具有更高的內化服從.【參考文獻】1KasuyaK,ByerJL,TanY,etal.PassiveiuntherapyfranthraxtxinediatedbyanadenvirusexpressinganantiprtetiveantigensinglehainantibdyJ.lTher,2022,11(2):237-244.2NeveR,Niel

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