1、目錄2.1 微生物發酵與制藥2.2 微生物生長與生產的關系2.3 制藥微生物生產菌種建立2.4 培養基制備2.5 滅菌工藝2.6 發酵培養技術2.7 發酵工藝過程的控制2.8 抗生素的生產工藝2.1 微生物發酵與制藥發酵概念概念：通過微生物培養而獲得產物的過程種類：用產品說明，冠以產物名而成，如青霉素發酵，維生素發酵初級代謝產物：在初級代謝過程中形成的產物，包括各種小分子前體、單體和多糖、蛋白質、脂肪、核酸等。生長所必須的。幾乎所有生物初級代謝基本相同。氨基酸，核苷酸，有機酸次級代謝產物：比較復雜的化合物，不是細胞生長必需的，對生命活動有意義（抗逆境條件）。抗生素，毒素，色素發酵制藥發酵制藥利

2、用制藥微生物的生長繁殖，通過發酵，代謝合成藥物，然后從中分離提取、精制純化，獲得藥品的過程。（1）直接利用微生物發酵獲得藥物。（2）利用微生物或產生的酶進行生物轉化制藥。只有藥物產生菌才可能用于發酵培養制備藥物！發酵制藥的種類發酵類型發酵產物過程特點厭氧初級代謝產物，維生素B1產物積累量多、產量高、合成途徑明確好氧初級代謝產物，谷氨酸，檸檬酸產物積累量多、產量高、合成途徑基本明確好氧次級代謝產物，抗生素產量低、合成途徑復雜好氧蛋白酶，脂肪酶，淀粉酶具體向外分泌的高分子物質生物轉化甾體激素，醋酸可的松，黃體酮酶催化的脫氫、羥化等反應，非菌體代謝物有的藥物合成有多個微生物或酶共同參于！制藥微生物的

3、種類生產藥物的微生物主要包括：細菌：桿菌肽、氨基酸、維生素 放線菌：氨基糖苷類、四環類、大環內酯類 絲狀真菌 ：頭孢等 發酵制藥的基本過程發酵制藥的分離純化的特點含量低、成分復雜， 往往多種方法混合使用 ！2.2 微生物生長與生產的關系微生物發酵基本過程特征（批式，菌體生長與產物生成的特征，三個階段：發酵前期(fermentation prophase)菌體生長期（cell growth phase）發酵后期(fermentation anaphase)菌體自溶期(cell autolysis phase)發酵中期(fermentation metaphase)產物合成（生產）期(produc

4、t synthesis phase)發酵前期特征 從接種至菌體達到一定臨界濃度的時間，包括延滯期、對數生長期和減速期。代謝特征：碳源、氮源等基質不斷消耗，減少。生長特征：菌體不斷地生長和繁殖，生物量增加。溶氧變化：不斷下降，菌體臨界值時，濃度最低。pH變化：先升后降先氨基酸作為碳源，釋放出氨，而后氨被利用。先降后升先用糖作為碳源，釋放出丙酮酸等有機酸，后又被利用。發酵中期特征 以次級代謝產物或目標產物的生物合成為主的一段時間。菌體生長恒定就進入產物合成階段。呼吸強度：無明顯變化，不增加菌體數目產物量：逐漸增加，生產速率加快，直至最大高峰，隨后合成能力衰退。對外界變化敏感：容易影響代謝過程，從而

5、影響整個發酵進程。發酵后期特征菌體衰老，細胞開始自溶的一段時間。合成產物能力衰退，生產速率減慢。氨基氮含有增加，pH上升。發酵必須結束，否則產物被破壞。菌體自溶給過濾和提取等帶來困難。微生物的生長動力學生長曲線：生物量或細胞數目隨培養時間變化曲線。意義：描述微生物從生長到自溶死亡的整個過程。速率r：單位時間（t）內菌濃或質量（X）變化。r=dX/dt比生長速率：單位菌體濃度的生長速率生長速率的標準化，菌體活力大小。=DX/Xdt影響生長動力學的因素（1）基質濃度對菌體生長的影響菌體生長過程，基質逐漸被吸收利用，濃度呈現降低。基質濃度的減少可用基質消耗速率和比消耗速率表示。（2）溫度升高而速率增

6、加，超過一定溫度點后，隨溫度升高，速率迅速下降。（3）pH值對菌體生長速率的影響與溫度的影響類似，在適宜的pH值范圍，生長速率最大生長與生產關系的模型Gaden把生長與生產分為三種：I型：生長與生產偶聯型II型：生長與生產半偶聯型III型：生長與生產非偶聯型. 與生長偶聯的產物的生物合成菌體生長與產物生成直接關聯，生長期與生產期是一致菌體生長、基質消耗、能源利用和產物生成動力學曲線幾乎平行，變化趨勢同步，最大值出現的時間接近.產物：初級代謝的直接產物，如有機酸，乳酸、醋酸等。II型：生長與生產半偶聯型介于偶聯和非偶聯模型之間，產物生成與基質消耗、能量利用之間存在間接關系。生長期期內，無產物生成

7、，生長中后期生成大量的產物產物：氨基酸的發酵，一部分組成型表達的蛋白質藥物III型：生長與產物生成非偶聯型生長期與生產期在獨立的兩個階段先形成物質消耗和生長高峰后菌體靜止期，產物大量生成，出現產物高峰。抗生素等次級代謝產物誘導型基因工程菌的生產。代謝產物的生物合成代謝：生物體內進行生理生化反應的統稱 分解代謝與合成代謝初級代謝：營養物質轉變為細胞結構物質和對細胞具有生理活性作用的物質，為細胞提供能量，合成中間體及復雜大分子代謝網絡。在初級代謝中的產物為初級代謝產物。次級代謝：次級代謝是在一定的生長時期（一般是穩定生長期），微生物以初級代謝產物為前體合成的對微生物本身的生命活動沒有明確功能的物質

8、的過程。但對抵抗逆境、分解毒素、生殖具有重要意義。次級代謝生物合成的基本特征次級代謝產物的結構 結構特殊不常見次級代謝產物的組成 多途徑、多酶種參與次級代謝產物的種屬性 具有種屬特異性，但與種屬匪類無關次級代謝產物的形成時期 細胞生長后期 次級代謝產物的合成基因 多基因控制聚酮體：含有多羥基的聚合物。糖類：氨基糖、糖胺和核糖。不常見的氨基酸：非蛋白質氨基酸莽草酸：芳香族氨基酸、肉桂酸和多酚合成的前體。甲羥戊酸：異戊二烯類和萜類化合物合成的前體次級代謝生物合成的構建單位次級代謝生物合成的基本過程前提聚合 結構修飾 裝配思考題（1）微生物發酵過程可分為幾個時期，各有何特征？（2）描述微生物生長動力

9、學過程，分析其影響因素。（3）分析微生物生長與生產之間的關聯模型。生產菌的自然分離（出發菌的獲取）菌種選育菌種保藏制藥微生物生產菌種的建立生產菌的自然分離（1）來源：大陸土壤、海洋水體樣品的采集：表層土壤（0-10cm）， 海洋（0-100m）預處理：根據分離目的和微生物的特性。溫度；SDS-酵母膏，CaCO3、NaOH處理，減 少 細菌，有利于放線菌分離；乙酸乙酯、氯仿、苯處理，除去真菌。離心、膜過濾生產菌的自然分離(2)培養基： 選擇適宜的培養基，營養和pH；添加抑制劑。分離方法：稀釋法：無菌水，生理鹽水，緩沖液濾膜法：0.22 -0.45 m。細菌在膜上，放 線菌菌絲可穿透，進入培養基。

10、培養條件：溫度。放線菌：25-30，32-37， 45-50；7-14天至1月。藥物的篩選瓊脂擴散法活性測定： 非致病菌為對象，篩選生物活性物質。 耐藥和超敏菌種。 HPLC、LC-MS等，分析鑒定活性物質。靶向篩選高通量篩選高內涵篩選菌種單孢子優良菌株平板分離單菌落測活效率低, 增產幅度小2、菌種選育自然選育（1）定義：不經過人工誘變處理，根據菌種的自然突 變而進行的菌種篩選過程。 應用：（1）菌種的提純復壯。（2）防止退化，穩定生產水平。1年1次。 過程：2、菌種選育誘變育種（2）定義：人為創造條件（誘變劑處理），使菌種發生變異，篩選優良個體，淘汰劣質個體。 物理類：紫外線，快中子，激光，

11、太空射線。 化學類：堿基類似物，嵌合劑，亞硝酸。 生物類：噬菌體，轉座子。 特點：快速，簡單，效益大。 缺點：無定向性。誘變方案設計 出發菌種的選擇：較高產，對誘變劑敏感。 誘變劑的使用：交叉使用多種，合理組合。中 等劑量（80致死率）。 選擇壓：施加一定的選擇壓，獲得耐藥菌株。 措施：添加抗生素，提高前體濃度，增加產物濃度。投入生產出發菌種單孢子懸液誘變處理稀釋涂板單菌落初篩高產菌株復篩穩定性特性放大中試誘變育種流程 菌株 SYPH5-8的誘變譜系 SYPW50-11(His SGr1.2mg/mL D-Argr 10mg/mL H-Argr 10mg/mL) 24.5g/L NTG SYP

12、D4(HisSGr1.2mg/mL D-Argr 15mg/mL H-Argr 10mg/mL ) 32.3 g/L NTG SYPH5-8(His-SGr 1.2mg/mL D-Argr15mg/mL ArgHXr10mg/mL H-Argr 10mg/mL) 37.6g/L2、菌種選育雜交育種（3） 概念：兩個不同基因型的菌株，通過結合或原生質體融合，使遺傳物質發生重新組合，從中分離篩選出具有優良性狀的新菌株。 特點：有一定的定向性。 種類： 體細胞重組 接合: 原生質體融合： 概念：準性生殖 范圍：放線菌，半知菌綱的真菌 過程 產黃青霉：提高青霉素產量 灰黃鏈霉菌：灰黃霉素產量兩條菌絲相

13、互結合異核體二倍體重組單倍體對氟苯丙氨酸（1）體細胞重組生殖育種概念范圍：細菌、放線菌過程：雖然有成功報導，但多數效果不顯著兩種細胞混合培養基因片段進入另一細胞重組單倍體合子（2）接合育種概念： 通過生物學、化學或物理學的方法，使兩個不同種類的體細胞融合在一起，從而產生具有兩個親本遺傳性狀的新細胞。（3）原生質體融合育種 定向分子育種概念： 在分子水平，體外模擬自然進化機制，是突變、 重組、選擇的重復循環。 獲得有益突變，淘汰有害突變，使進化向有益 的方向發展。原理與操作過程 突變：產生多樣性。隨機突變，誘變 重組：產生新功能。同源重組，非同源重組 選擇和篩選：表面展示，活性檢測野生型隨機突變

14、1-2循環，積累有益突變。多輪循環，組合有益突變，消除有害突變。2、菌種選育分子定向育種（4）采用基因工程技術，過量表達或抑制表達某一個或一組基因，調控代謝工程，希望目標產物的高效表達。基因工程育種 DNA shufflingDNA shuffling 技術是一種利用多次、反復選擇和重組以獲得具有預期性狀的多聚核苷酸的方法。隨機片斷化處理、無引物的PCR擴增、加入引物的PCR擴增、克隆、篩選、分析及多輪篩選基因組shuffling隨機突變獲得單個性狀優良的菌株。多個菌株的原生質體混合、融合、再生，形成第一個融合庫（F1）再次重復循環融合，得到融合庫F2、F3、F4篩選鑒定。2、菌種選育組合生物

15、合成（5） 將控制不同產物的生物合成基因進行有矢組合，形成新的基因模塊，從而合成新化合物。是基因工程育種的一種。合成生物學與細胞工廠細胞工廠是指利用生命的機能實現物質的加工生產。隨著系統生物學和合成生物學的快速發展，大規模地改造和設計細胞工廠逐漸成為可能。合成生物學是指人們將“基因”連接成網絡，讓細胞來完成設計人員設想的各種任務。3、菌種保藏原因：菌種經過多次傳代，會發生遺傳變異，導致退化，從而喪失生產能力甚至菌株死亡。目的：保持菌種原有優良特性，延長生命時限，長期存活、不退化。原理：使菌種代謝處于不活躍狀態，即生長繁殖受抑制的休眠狀態。措施：物理和化學方法（溫度：低溫；水分：干燥；氧氣：缺氧

16、；營養；缺乏）。菌種庫的建立與質量控制主菌種庫：來源于原始菌種或細胞培養物，一般在10-200份。工作菌種庫：由主菌種庫或主細胞庫繁殖而來，一般在40-1000份。新菌種或細胞系原始培養物MCBMCB1MCB2QCQCQCQC菌種庫與細胞庫建立的QC要求細胞類型QC細菌活性、純度、真實性、革蘭氏染色、形態特征、生化特征、遺傳特征真菌活性、純度、真實性、形態特征、生化特征、遺傳特征基因工程菌宿主菌特征、表達質粒結構與功能，鑒別標志，基因序列，穩定性，表達方式與水平動物細胞系活性、純度、真實性、吳軍實驗，核型，DNA分析、同工酶分析、支原體分析、其它外源性實驗，穩定性和基因型分析保藏方法低溫斜面保

17、藏：低溫降低新陳代謝。4，RH70以下。短期保藏，1-6個月；易變異 石蠟封存：隔絕氧氣，減少蒸發。4，約1年。 砂土管保藏：干燥抑制生長。孢子吸附在砂土上，真空抽氣干燥。干燥器于冰箱，數年。 冷凍干燥保藏：保護劑降低菌體細胞冰點，減少冰晶對細胞傷害。低溫避光，中期保藏，5-10年。 液氮保藏：培養物與冷凍保護劑混合，密封。液氮-96）罐或-80冰箱。低溫、缺氧、避光和營養缺乏環境。長期保藏。保藏機構中國 中國典型培養物保藏中心:China Center for Type Culture Collection (CCTCC)。 中國科學院典型培養物保藏委員會,下設9個庫。 中國普通微生物菌種保

18、藏管理中心：China General Microbiological Culture Collection Center (CGMCC)，微生物所（真菌和細菌）；武漢所（病毒）。 抗生素菌種保藏管理中心（CACC）：中國醫學科學院抗生素所，四川抗生素所，華北制藥集團抗生素所。保藏機構國外 WFCC：World federation for culture collections, http:/www.wdcm.riken.go.jp/wfcc.thml ATCC: American Type Culture Collection, /IFO: Institute for Fermentati

19、on, Osaka, Japan NCTC: National Collection of Type Culture, London, UK小結 生產菌的分離：自然分離與篩選 菌種選育：自然選育、雜交育種、定向育種 菌種保藏：低溫、干燥；機構思 考 題（1）如何進行生產菌的分離與篩選？ （2）比較各種菌種選育方法的 優缺點。 （3）菌種保藏的原理是什么？有那些主要方法，各有何優缺點？2.4發酵培養基制備 概念（medium）：供微生物生長繁殖和合成各種代謝產物所需要的按一定比例配制的多種營養物質的混合物。 培養基的組成和比例是否恰當，直接影響微生物的生長、生產和工藝選擇、產品質量和產量。2.4

20、.1 培養基的成分碳源氮源無機鹽水生長因子前體與促進劑消泡劑1、碳源(carbon sources)概念：構成微生物細胞和代謝產物中碳素的營養物質。作用：為正常生理活動和過程提供能量來源，為細胞物質和代謝產物的合成提供碳骨架。碳源種類糖類：葡萄糖、淀粉、糊精和糖蜜脂肪：豆油、棉籽油和豬油醇類：甘油、乙醇、甘露醇、山梨醇、肌醇蛋白類：蛋白胨、酵母膏速效碳源：糖類、有機酸遲效碳源：酪蛋白水解產生的脂肪酸2、氮源（nitrogen sources）概念：構成微生物細胞和代謝產物中氮素的營養物質。作用：為生長和代謝主要提供氮素來源。種類：無機氮源、有機氮源。幾乎所有微生物都能利用有機氮源有機氮源 黃豆

21、餅粉、花生餅粉 棉籽餅粉、玉米漿、蛋 白胨、酵母粉、尿素無機氮源氨水、銨鹽和硝酸鹽等。氨鹽比硝酸鹽更快被利用。工業應用：主要氮源或輔助氮源；調節pH值生理酸性物質：代謝后能產生酸性殘留物質。（NH4）2SO4利用后，產生硫酸根生理堿性物質：代謝后能產生堿性殘留物質。硝酸鈉利用后，產生氫氧化鈉。3、無機鹽和微量元素概念：組成生理活性物質或具有生理調節作用礦物質。 作用方式：低濃度起促進作用，高濃度起抑制作用。 種類：鹽離子磷、硫、鉀、鈉、鎂、鈣，常常添加鐵、鋅、銅、鉬、鈷、錳、氯，一般不加。4、水菌體細胞的主要成分。營養傳遞的介質。良好導體，調節細胞生長環境溫度。培養基的主要成分之一。5、生長因

22、子（growth factor）概念：維持微生物生長所必需的微量有機物，不起碳源和氮源作用。種類：維生素、氨基酸、嘌呤或嘧啶及其衍生物、脂肪酸等。天然成分中含有：一般無需添加。營養缺陷型菌株：必需添加。6、前體(precursor)概念：加入到發酵培養基中的某些化合物，被直接結合到目標產物分子中，而自身的結構無多大的變化。 使用：添加前體是提高抗生素產量的重要措施。多次少量流加的工藝。6、促進劑(accelerant)概念：促進產物生成的物質，但不是營養物，也不是前體的一類化合物。種類：氯化物有利于灰黃霉素、金霉素合成。表面活性劑吐溫、清洗劑，脂溶性小分子化合物等，起誘導作用。7、消沫劑（de

23、foamingagent）概念：降低泡沫的液膜強度和表面黏度，使泡沫破裂的化合物。種類：表面活性劑，低表面張力。天然動植物油脂類、高分子化合物（高碳醇脂肪酸和酯類、聚醚類、硅酮類）。作用：消除泡沫，防止逃液和染菌。8.4.2 培養基種類及其質量控制技術培養基的種類按用途：選擇性、鑒別性、富營養培養基等按物理性質：固體，半固體、液體培養基按化學組成：合成、半合成、天然培養基按發酵過程中所處位置和作用：斜面或平板固體、種子、發酵和補料培養基。1、固體培養基概念：（solid medium）細菌和酵母的固體斜面或平板培養基，鏈霉菌和絲狀真菌的孢子培養基。 制備：液體培養基添加1.0-2.0%瓊脂粉。

24、 作用：提供菌體的生長繁殖，形成孢子。1、斜面培養基要求與質量控制單細胞培養基：營養豐富，滿足菌體生長迅速，不能引起變異。孢子培養基：基質濃度較低，無機鹽濃度適量，以利于孢子形成。營養不宜太豐富，否則不易產生孢子。2、種子培養基概念：（seed medium）供孢子發芽和菌體生長繁殖，搖瓶和種子罐培養基,為液體。作用：使種子擴大培養，增加細胞數目，生長形成強壯、健康和高活性的種子。培養基成分必需完全，營養豐富。縮短發酵的延滯期。2、種子培養基要求與質量控制用速效性、容易被利用的碳、氮源和無機鹽等物質，但濃度不宜高。種子培養基要與發酵培養基相適應，主要成分接近，不能差異太大。3、發酵培養基概念：

25、(fermentation medium)提供微生物生長、目標產物生成的生產用培養基。作用：不僅要滿足菌體的生長和繁殖，還要滿足菌體合成目標產物，是發酵生產中最關鍵和最重要的培養基。要求：營養物質濃度和粘度適中組成上豐富完整不同菌種和不同產物，對培養基的要求差異很大，組成和配方需要優化4、補料培養基(fed medium）概念：發酵過程中添加補充的培養基。作用：穩定工藝條件，延長發酵周期，提高目標產物產量組成：各種必要的營養物質，碳源、氮源、前體制備：按單一成分配制，各自獨立控制，或按一定比例制成復合補料培養基。5、控制發酵培養基質量（1）控制水質：恒定水源和恒定的水質。地下深層井水，對水質定

26、期化驗檢查，使用符合要求的水質配制各種培養基措施：檢測與控制水質參數pH、溶解氧、可溶性固體、污染程度、各種礦物，特別是重金屬的種類和含量（2）控制培養基原料的質量：來源與種類的選擇農產副品：因品種、產地、加工、貯存條件不同而質量差異較大。化學原料：雜質含量也不相同。措施：保持穩定的原料來源。更換原料時，必需再進行一系列試驗，確保產量和質量的控制和穩定性。原料的選擇試驗：不同碳源、氮源對菌種生長的能力和產物的生產能力很不相同。對原料進行試驗，選擇滿足發酵要求的來源。注意：碳氮濃度與配比：適宜速效和緩效成分相互配合，發揮綜合優勢pH：配制時加入酸堿性物質搭配，甚至使用緩沖劑。（3）控制培養基的黏

27、度：對發酵的影響：高黏度的培養基，不易徹底滅菌影響發酵的通氣攪拌等物理過程直接影響菌體對營養的利用目標產物的分離提取造成困難措施：固體不溶性成分，淀粉、黃豆粉等增加培養基的黏度，酶水解，降低大分子物質（4）控制滅菌操作高壓蒸氣滅菌影響培養基的有效成分甚至是活性。較高溫度下長時間滅菌，營養成分會破壞，甚至產生有毒物質。磷酸鹽與碳酸鈣、鎂鹽、銨鹽也能反應，生成沉淀或絡合物，降低利用度。維生素等不耐高溫分解破壞、失活。8.4.3 制藥生產用培養基的配制一般設計原則設計思路計算與定量配制優化1、培養基設計一般原則生物學原則：根據不同微生物營養和反應需求設計。營養物質組成：較豐富，濃度適當。成分之間比例

28、：恰當，C/N比適宜，有機和無機氮原料之間：不能產生化學反應。適宜的pH和滲透壓工藝原則：不影響通氣攪拌、分離精制和廢物處理，過程容易控制。低成本原則：原料來源方便，質量穩定，質優價廉。高效經濟原則：滿足菌體生長和合成產物的需求，最 高得率，最小副產物。2、培養基設計基本思路起始培養基：根據他人的經驗和使用。單因素實驗：確定最適宜的培養基成分。多因素實驗：各成分之間最佳配比和濃度優化。中試放大試驗：搖瓶、小型發酵罐，到中試，最后放大到生產罐。綜合考慮各種因素，產量、純度、成本等后，確定一個適宜的生產配方。3、理論計算與定量配制微生物生長和生產可用下列表達式表示：碳源和能源氮源其他營養物質細胞產

29、物CO2H2O熱量單位細胞生物量所需最小的營養物質 單位產量的最小底物濃度 碳源和氮源進行轉化率計算和分析初步計算：參考微生物的化學和元素組成。轉化率：單位質量原料生產的產物量或細胞量。理論轉化率：根據代謝途徑的物料衡算實際轉化率：發酵過程中實際測量數值計算。目標：使實際轉化率靠近理論轉化率。無法從生化反應原理來推斷和計算出最佳培養基配方：根據生理學和生物化學理論參照前人所用的經驗培養基結合菌的特殊生物學和產品特征要求進行大量細致和周密的試驗研究小結培養基組成與作用：C、N、無機鹽、水、生長因子、前體與促進劑、消泡劑。培養基制備與質量控制：固體、種子、發酵培養基。生產用培養基制備：原則、思路、

30、優化。思考題（1）培養基組成成分有哪些，有何作用？（2）固體培養基、種子培養基、發酵培養基的組成特點及其如何銜接？（3）如何研制生產用培養基？2.5 滅菌工藝滅菌方法與原理培養基滅菌工藝空氣除菌工藝幾個概念雜菌：除生產菌以外的任何微生物。污染：感染雜菌的培養或發酵體系。消毒：殺滅或清除病原微生物，達到無害化程度，殺滅率99.9%以上。殺菌：殺滅或清除一切微生物，達到無活微生物存在的過程，殺滅率99.9999%以上。滅菌：微生物殺滅率99.999999%以上。2.5.1 滅菌方法與原理化學滅菌物理滅菌1、化學滅菌用化學物質殺滅微生物的滅菌操作。化學滅菌劑：氧化劑類等，鹵化物類，有機化合物等。機理

31、：蛋白質變性，酶失活，破壞細胞膜透性，細胞死亡。應用：皮膚表面、器具、實驗室和工廠的無菌區域的臺面、地面、墻壁及空間的滅菌。2、物理滅菌各種物理條件如高溫、輻射、超聲波及過濾等進行滅菌。紫外線等射線：局部空間。干熱滅菌：實驗室器皿。蒸汽滅菌：培養基。效果好，操作方便，廣泛使用。2.5.2 培養基滅菌微生物高溫死亡動力學與滅菌的關系微生物受熱死亡過程的一級動力學反應：dX/dt= kdX微生物濃度與滅菌時間成正比，濃度越高，滅菌時間越長。滅菌時間與比死亡速率之間的關系kd與微生物種類、生理狀態、滅菌溫度有關以殺死芽孢的溫度和時間為指標。確保徹底滅菌，實際操作中增加50的保險系數。2、培養基滅菌的

32、操作方式(1)分批滅菌操作，間歇滅菌,實罐滅菌：配制好培養基輸入發酵罐內，直接蒸汽加熱，達到滅菌要求的溫度和壓力后維持一段時間，再冷卻至發酵要求的溫度。特點：不需其他的附屬設備，操作簡便，手動。缺點：加熱和冷卻時間較長。營養成分損失較多，罐利用率低。適合小批量生產規模。分批操作的滅菌過程加熱升溫：維持滅菌溫度：15-30min，121；0.09-0.10 MPa冷卻降溫：每段對滅菌的貢獻于取決時間長短。分批滅菌的操作過程蒸汽預熱：冷卻管、夾套通入蒸汽。 70。入罐升溫：取樣管、放料管、空氣管、通入蒸汽。維持保溫：120，罐壓0.1MPa，排氣。調節進汽和排氣量，維持30min。冷卻降溫：依次關

33、閉排氣、進汽閥。罐壓低于空氣壓力后，通入無菌空氣，夾套通入冷卻水降溫。（2）連續滅菌操作高溫短時滅菌操作，連消：培養基在發酵罐外經過一套滅菌設備連續的加熱滅菌，冷卻后送入已滅菌的發酵罐內的工藝過程。加熱升溫、維持滅菌溫度和冷卻降溫三個階段由不同的設備執行：加熱器，保溫設備，冷卻器。（2）連續滅菌操作流程圖培養基與高壓蒸汽直接混勻，達到滅菌溫度（130-140）（2）連續滅菌操作過程配料：配料罐，配制培養基。預熱罐：定容和預加熱。70-90。加熱器：培養基與蒸汽混合，快速升到130-140。維持罐：維持滅菌時間,5-7分鐘。冷卻管：培養基經過冷卻水管冷卻。40-50。輸入滅菌的發酵罐中。連續滅菌

34、的特點1）高溫快速滅菌工藝，營養成分破壞的少；2）熱能利用合理，易于自動化控制；3）不適合粘度大或固形物含量高的培養基滅菌；4）增加了連續滅菌設備及操作環節，增加染菌幾率。5）對壓力要求高，一般為0.45-0.8 MPa。2.5.3 空氣除菌操作工藝1發酵對空氣的要求好氧微生物需要氧氣供應，通入空氣。連續一定流量的壓縮無菌空氣。空氣流量：一般0.1-2.0。壓強：0.2-0.4 MPa。空氣質量：相對濕度小于70；比培養溫度高10-30；潔凈度100級，或失敗率103。2、工業制備大量空氣的方法加熱滅菌：利用空氣壓縮時所產生的熱量除菌，無菌化程度不高的發酵過程。靜電除菌：通過高壓電流場，帶電粒

35、子被吸附。介質過濾：捕集粒子及各種微生物。發酵工業采用。3、空氣除菌原理空氣中附著在塵埃上的微生物大小為0.5-5um。離心場作用：顆粒及其微生物沉降直接被截留：顆粒慣性碰撞，相互集聚成大顆粒。氣流速度越大，慣性越大，截留效果越好。靜電引力：有一定作用。4、空氣過濾介質膜過濾介質：孔徑小于被截留微生物體積硝酸纖維酯、聚四氟乙烯、聚砜、尼龍膜，四氟乙烯、纖維素樹脂微孔濾膜。0.1-0.5um深層過濾介質：空隙大于被截留微生物體積。纖維狀或顆粒狀：棉花(50um)、玻璃纖維、活性炭過濾紙：超細玻璃纖維紙(1-1.5um)金屬燒結管：單根或幾十根甚至上百根金屬微孔濾管安裝在過濾器內。5、空氣滅菌工藝

36、過程小結滅菌方法與原理：化學、物理培養基滅菌：間歇式，連續操作空氣除菌：過濾除菌工藝思考題（1）與滅菌相關的幾個概念有何不同？（2）比較分析培養基的間歇和連續滅菌工藝的優缺點及操作要點。（3）空氣過濾滅菌的工藝過程及其主要關鍵點是是什么？2.6發酵培養技術選擇合適的培養基；提供適宜的環境條微生物發酵工藝過程的三個工段：種子制備接種發酵培養2.6.1 種子制備種子的制備：種子的逐級擴大培養過程。獲得一定數量和質量的純種過程。1孢子制備種子活化：將保存菌種接種在固體培養基上，在適宜條件下培養，恢復其固有生物特性。放線菌孢子：采用瓊脂斜面培養基。霉菌孢子：大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農產品為培

37、養基。細菌：采用碳源有限而氮源豐富的配方。2生產種子制備搖瓶種子制備：母瓶、子瓶。種子罐種子制備：一級、二級、三級種子。種子罐級數：制備種子需逐級擴大培養的次數確定種子級數的因素:菌種生長特性及菌體繁殖速度：生長快，少發酵罐的容積：越大，多產物的品種及生產規模：越大，多所選用工藝條件：有利于生長的工藝，少發酵類型的定義一級發酵：將孢子或菌絲接入直接發酵罐二級發酵：經過一級種子罐，再到發酵罐；谷氨酸生產三級發酵：二級種子擴大培養，經過二次種子罐，再接入發酵罐。青霉素生產四級發酵：三級種子擴大培養，經過三級種子罐，再到發酵罐。鏈霉素生產菌接種方式單種法：一只種子罐接種一只發酵罐。雙種法：兩只種子罐

38、接種一只發酵罐。倒種法：從發酵罐中取出一定量發酵液，接種到另一個發酵罐。2.6.2 培養技術1、固體表面培養技術原始，最早采用2、液體深層培養主要的發酵培養技術3、高密度培養（high cell density culture）概念：菌體濃度（干重）至少達到50g/L以上的一種理想培養，發酵工藝目標和方向。優點:縮小發酵體積增加表達量成本低，生產率高。2.6.3 發酵培養的操作方式1、分批式操作；間歇式操作；不連續操作2、流加式操作，補料分批式操作3、半連續式操作，反復分批式或換液培養4、連續式操作，衡態操作5、灌流式操作1、分批式操作概念：培養液一次性裝入發酵罐，一次性接種，經過一段時間培養

39、，一次性卸出全部培養物。特點：非衡態過程發酵體系的組成（基質、產物及細胞濃度）都隨發酵時間而變化。缺點：開始時基質濃度很高，到中后期，產物濃度很高，對發酵不利。輔助時間：清洗罐，裝料、滅菌，時間長。2、流加式操作概念：裝入大部分培養液，一次性接種，在培養過程中連續不斷補充新培養基，但不取出培養液。特點：流加能源和碳源物質及氨水等。克服了批式的缺點，使生長和生產保持適宜水平。缺點：整個發酵體積不斷增加3、半連續式操作概念：培養液一起裝入發酵罐，一次性接種。間歇取出部分發酵培養物（帶放），同時補充同等數量的新培養基；然后繼續培養，直至發酵結束。特點：發酵罐內的培養液總體積保持不變使生長和生產保持適

40、宜水平。缺點：喪失部分前體，喪失部分菌體，非生產菌突變4連續式操作概念：培養液一起裝入發酵罐，接種后培養過程中，不斷補充新培養基,同時取出包括培養液和菌體在內的發酵液，直至發酵結束。特點：恒定狀態的發酵，發酵罐內體積及其物系的組成將不隨時間而變。培養基連續穩定流加；產物連續穩定收獲；提高菌體密度；自動化。缺點：時間長，雜菌污染、突變機會增多。5、灌流（注）式操作概念：培養液一起裝入發酵罐，接種后培養過程中，不斷補充新培養基，取出部分條件培養基，菌體仍然滯留罐內。特點：除去有毒害的代謝物補充營養物質小結發酵培養的基本過程培養技術:概念與特點操作方式：區別，特點思考題（1）如何種子罐級數確定？（2

41、）深層培養、固定化培養、高密度培養有何特點？（3）各種操作方式的異同點，如何選擇應用？2.7 發酵培養工藝控制微生物發酵生產水平取決于:生產菌種性能與合適的環境條件發酵過程各種參數處于不斷變化狀態關鍵在于過程檢測與控制檢測儀器與主要參數就地探頭： pH，溶氧，溫度，液位在線儀器： 尾氣分析儀離線儀器： 基質、產物濃度生物學參數：菌體濃度，形態，雜菌物理參數： 溫度，壓力，攪拌，粘度化學參數： 基質濃度，pH，溶解氧，尾氣，補料消泡2.7.1 生物學檢測主要的參數與控制1.細胞形態 鏡檢：顯微鏡檢測，染色，光學、熒光，電鏡 應用： 是否污染，發酵過程狀態，菌種的真實性。2. 菌體濃度概念：菌濃：

42、單位體積發酵培養液內菌體細胞的含量，干重或鮮重，細胞數目表示。應用：決定適宜補料量、供氧量等，以得到最佳生產水平。臨界菌體濃度控制概念：攝氧速率與氧傳遞速率平衡時的菌體濃度菌體遺傳特性與發酵罐氧傳質特性的綜合反映。控制策略：中間補料、控制CO2和O2量。3.發酵污染雜菌的檢測與控種子污染培養基滅菌不徹底空氣帶菌設備及其附件滲漏2.7.2 物理參數的檢測與控制1.溫度的檢測與控制發酵溫度概念:發酵中的所維持溫度 在生長和生產的最適溫度范圍內測定：熱電阻等熱敏原件測定，溫度計上讀出。（1）發酵熱的構成與計算 發酵熱（fermentation heat）產生熱與散失熱之差產生熱：生物熱和攪拌熱散失熱

43、：蒸發熱、顯熱和輻射熱。Q發酵Q生物Q攪伴Q蒸發Q顯Q輻射生物熱(biological heat) 概念： 菌體生長過程中直接釋放到體外的熱能。 影響因素： 培養基成分： 越豐富，生物熱越多。菌體濃度、呼吸強度： 越大，生物熱越多。不同生長階段： 生物熱也不同。 發酵熱平衡的主要依據：對數期的生物熱攪拌熱(agitation heat)概念：攪拌器引起的液體之間和液體 與設之間的摩擦所產生的熱量。影響因素：發酵罐：攪拌設備、攪拌方式培養基：發酵液黏度。計算：單位體積發酵液的消耗功率與熱功量（3600kJ/kWh）的乘積。散失熱蒸發熱：空氣進入發酵罐后，引起水分蒸 所需的熱能。顯熱：廢氣排出時帶

44、走的熱能。輻射熱：發酵液中部分熱能以輻射熱的形通過罐體輻射到大氣中。影響因素：溫度差異而造成的熱能損失。發酵溫度、通氣溫度和流量等（2）溫度的選擇原則選擇最適溫度并嚴格控制。不同菌種：不同溫度。兩段變溫發酵培養：生長階段，選擇適宜的菌體生長溫度，生產階段選擇最適宜的產物生產溫度。后期降溫控制：避免產物降解。（3）溫度的控制方式 一般不需要加熱，往往經常需要降溫冷卻 夾套層、蛇形管，熱交換；電熱縟冷卻水降溫：滯后，需要一定的經驗和技巧冷凍鹽水循環式降溫：迅速建立冷凍站：提高冷卻能力發酵溫度與冷卻偶聯2.壓力的檢測與控制概念：罐體內的壓力，由壓力表讀出。罐壓的影響：維持正壓，防止污染；CO2和O2

45、的溶解度不同生物對壓力耐受不同控制：進或出口閥門，進入或排出氣體或空氣流量維持工藝所需壓力：0.02-0.05 MPa3.攪拌的檢測與控制攪拌的影響：氣體的傳遞速度和發酵液的混合均勻程度攪拌指標：攪拌轉速和攪拌功率。攪拌控制策略：發酵中不同階段對氧需求進行調節。2.7.3 化學參數的檢測與控制基質濃度pH溶解氧尾氣1.基質濃度的檢測與控制基質濃度：發酵液中糖、氮、磷等發酵液中營養物質的濃度檢測：在線或離線。補料控制：經驗方法和動力學方法。補料時間、數量和方式：代謝類型。動力學方法：菌體比生長速率、糖比消耗速率、產物的比生產速率等參數控制。2. pH檢測與控制發酵中pH的變化是酸和堿綜合表現。酸

46、的來源：糖類原料中的酸性雜質；糖在高溫滅菌中氧化或反應生成酸；糖被代謝生成有機酸，分泌到培養液。堿的來源：水解酪蛋白和酵母粉等作為碳源利用。控制pH策略分階段控制：生長最適pH和產物最適pH。緩沖液控制：碳酸鈣和磷酸鹽緩沖液。補加酸或堿進行控制：補料方式控制:流加糖率來控制pH。3.溶解氧的檢測與控制概念：溶于培養液中的氧含量表示：絕對含量，飽和氧濃度的百分數。檢測：在線溶氧電極。控制策略：供應量和需要量二個方面考使之需氧不超過設備的供氧能力。供氧oxygen supply原理氧溶解過程：氧從空氣氣泡擴散到培養液氧溶解速率：dissolved oxygen rate氧傳遞速率：oxygen transfer rate, OTR耗氧oxygen consumption菌體吸收溶解氧的過程攝氧速率(Oxygen uptake rate，OUR)耗氧速率臨界氧濃度不影響呼吸或產物合成的最低溶解氧濃度。供氧必需大于或等于耗