1、DNAmRNA蛋白質轉錄反轉錄 翻譯 核酸的分子雜交 基因構造異常基 因 表 達 異 常PCR DNA測序 Nothern-blot 實時熒光定量PCR 反轉錄PCR 蛋白質芯片 ELISA 蛋白組織化學染色 Western-blot 基因芯片 基因診斷的技術和方法遺傳性疾病分子診斷 嚴永敏 根底醫學與醫學技術學院遺傳性疾病診斷戰略 1. 點突變的診斷 方法有等位基因特異性寡核苷酸雜交ASO、PCRELISA、等位基因特異性擴增ASA、PCRRFLP、基因芯片技術進展診斷； 對于一些基因背景未知的點突變，可以采用單鏈構象多態性SSCP、變性梯度凝膠電泳DEEG、異源雙鏈分析HA、DNA序列測定

2、、蛋白截短測試等方法。 一、限制性內切酶法RE法 導致某一限制酶識別位點移位的大片段缺失或插入， 導致某一限制酶識別位點喪失或獲得的點突變， 均可引起相應限制性片段的長度和數量發生變化。 分析限制性酶切圖，即可診斷出此類突變。Mst酶切位點(GCTNAGG)53正常基因53突變基因1.15kb1.35kb鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析+0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析二、ASO探針雜交受檢者基因組DNA或含突變位點的PCR擴增產物與標志的ASO 探針雜交主要適用于檢測知點突變ASO1ASO2NormalHeteroHomo

3、PCR-SSCP 2.片段性突變的檢測 片段性突變是指DNA分子中較大范圍的堿基發生突變，如堿基的缺失、插入、擴增和重組。對于少數核苷酸缺失或插入，可以采用檢測點突變的方法，而對于大的片段突變，那么運用Southern印跡技術和多重PCR技術。 杜氏和貝氏肌營養不良癥的基因診斷 多重PCR檢測患者缺失凝膠電泳圖9對引物P1 除外顯子1 外其他均缺失； P2 外顯子819 有小的缺失；P3 外顯子44-50 缺失； P4 外顯子4552 有小的缺失；B1 空白對照；C1、C2 正常對照。遺傳性疾病診斷戰略 DNA多態DNA Polymorphism： 群體中每個個體DNA區域中等位基因或片段存在

4、兩種或兩種以上的方式，對基因功能沒有影響，稱DNA多態。 它經過孟德爾方式遺傳。常用做遺傳分析中的標志。 將與致病基因連鎖的某種多態性標志作為遺傳標志，在同一個家系成員中探查能否存在致病基因的方法即為基因連鎖分析法。 基因連鎖分析常用的遺傳性多態性標志有3類：1RFLP： 稱限制性片段長度多態性，為第一代多態性標志；2反復序列多態性VNTR： 如短串聯反復序列STR，為第二代多態性標志；3單核苷酸多態性SNP DNA序列的單個核苷酸的差別，為第三代多態性標志。1 Southern blot-RFLP診斷(PKU)間接基因診斷 PAH基因兩側有Msp1酶切位點,用該酶消化可產生23kb、19kb

5、 兩種等位片段，以PAH cDNA為探針與PKU家系成員外周血DNA雜交。患者為19kb片段的純合子,闡明患者缺陷的PAH 基因與19kb片段連鎖其父、母親缺陷的PAH基因與19kb片段連鎖， 其23kb片段與正常PAH基因連鎖。II2為23kb 和19kb片段的雜合子，為表型正常的致病基因攜帶者。間接基因診斷數目變異串聯反復variable number tandem repeats, VNTR反復序列以各自的中心序列反復單元，首尾相連多次反復，稱為串聯反復序列，其反復次數在人群中存在變異，構成多態即 VNTR。散在分布于染色體上。反復單位625bp長，稱為小衛星DNA。反復單位26bp長，

6、如TAn, (CGG)n等，稱為微衛星DNA，又稱短串聯反復序列(STR) 。VNTR兩側酶切位點固定，但兩酶切點之間的串聯反復拷貝數不同，酶切后產生不同長度的片段。DNA多態可以經過PCR擴增后電泳來檢出，稱擴增片段長度多態amplified fragment length polymorphism, Amp-FLPVNTR 酶切，電泳后的檢測結果大小PCR-VNTR檢測PCR-VNTR成年型多囊腎病的診斷例：成年型多囊腎病APKD，AD ，臨床表現為腰痛，蛋白尿，血尿，高血壓，腎盂性腎炎，腎結石。最終導致腎功能衰竭和尿毒癥。APKDGene定位16p13，但致病基因尚未克隆，基因產物的生化

7、性質和疾病發病機理也尚未闡明，但已證明APKD Gene與珠蛋白基因3端附近的一段小衛星DNA序列3HVR嚴密連鎖，因此，可以經過VNTR連鎖分析進展診斷。間接基因診斷 以3HVR為探針，與PvuII酶切后的家系有關成員的基因組DNA進展Southern Blot 基因組DNAPvuII酶切DNA片段變性轉膜探針變性雜交結果分析間接基因診斷 1 2 1 2 3 4 5 5.7kb 3.4kb 2.3kb 間接基因診斷結果分析 患者I1、II1和II2有3.4kb片段，闡明致病基因與3.4kb片段連鎖，并按孟德爾方式遺傳。II5不含3.4kb片段，產前診斷正常。間接基因診斷單核苷酸多態Singl

8、e Nucleiotide Polymorphism， SNPSNP：發生在基因組中的單個核苷酸的替代根據SNP在基因中的位置，分為： 基因編碼區SNP 基因周邊SNP 基因間SNP在人類基因組中每100300個核苷酸就有一個SNP 遺傳性疾病的主要分子機理是基因突變，因此是基因診斷的最正確順應癥。基因診斷在遺傳性疾病中的運用 血紅蛋白病 最早勝利進展產前基因診斷可分為兩大類： 異常血紅蛋白病abnormal hemoglobin syndrome 地中海貧血thalassemia一、 遺傳性疾病 1異常血紅蛋白病珠蛋白基因突變單鹼基替代、缺失或插入等 鐮狀細胞貧血： b-珠蛋白基因第6位密碼

9、子GAGGTG (E6V) 該突變使限制酶MstII位點消逝(CCTGAGGCCTGTGG) 診斷方法： 限制性酶切圖譜直接分析法 (基因組DNA或PCR產物) ASO 斑點印跡雜交分析法 (ASO = 等位基因特異性寡核苷酸探針)Mst酶切位點(GCTNAGG)53正常基因53突變基因1.15kb1.35kb鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析+0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析 b-珠蛋白基因點突變 GAG(Glu)-GTG(Val) bA probe ACTCCTGAGGAGAAGTCTGCC bS probe ACTCCT

10、GTGGAGAAGTCTGCCHeterobA probebS probeHomoNormal a-地中海貧血： 不同數量(1-4個)a-珠蛋白基因缺失或點突變等 a a 14kbBamHI BamHI aa/aa aa/- aa/a- a-/- -/- 10kb 14kb 10kb a 2地中海貧血 珠蛋白基因缺失或基因中某些鹼基替代 影響a-或b-珠蛋白鏈的合成速率 a-或b-地貧診斷方法：PCR、酶切圖譜法、PCR-ARMS、PCR-ASOb-地中海貧血 主要是b-珠蛋白基因點突變。 突變常不涉及限制酶識別位點 不能用限制性酶切圖譜進展直接分析。診斷方法： RFLP連鎖分析 間接檢測病變基因 ASO 斑點印跡雜交分析 直接檢測病變基因點突變 DNA芯片包括各種基因突變位點的一切探針 可快速、簡便地檢出一切知突變 甲型血友病血友病A 凝血因子VIIIF VIII缺乏所致， 發病的分子機制是F VIII基因突變，主要為點突變或少數鹼基 的缺失和插入以及第22內含子的大片段倒位。 乙型血友病血友病B 原因于凝血因子IX的缺乏 其分子機制是分布于整個基因各處的多種方式的突變。 診斷方法：PCR/ASO直接檢測法點突變 PCR/RFLP連