1、精選優質文檔-傾情為你奉上精選優質文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業專心-專注-專業精選優質文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業 研究生學位論文開題報告學 號：姓 名：馬麗娟導師姓名：黃永清研究方向： .口腔頜面外科論文題目：MAFB基因多態性在寧夏人群中與非綜合征型唇腭裂的相關性研究院（系）：口腔醫學院入學時間：2011年 9月 5日開題時間： 2012年12月18日 二 一二 年 十二 月 十八 日一、立論依據（包括研究意義、國內外研究現狀分析，并附主要參考文獻及出處）1、選題背景 唇腭裂是人類最常見的一種出生缺陷,其發病率在1/5001/1000之間, 不同種族和地域發病率有很大差異1,

2、其中美洲印第安人與亞洲人的發病率最高，約1/500 2，高加索人居中，約1/10 00 ，非洲人最低，約1/2 50 0 ，我國發病率為1.82/10003,在我國出生缺陷的發生率中占第一位或第二位, 在寧夏2007年嬰兒出生缺陷的發生率中占第一位4，發病率為2.19/1000。 唇腭裂患者不僅存在外形上的缺陷，其飲食、語言等功能也伴有不同程度的障礙，常常造成性格缺陷，影響正常的社會交往，降低生活質量，又因其治療程序復雜、周期漫長、花費大，給家庭和社會帶來沉重負擔，嚴重影響了出生人口素質，因此尋找該病的病因, 進而找到有效的預防手段顯得非常重要。 根據全身是否伴發其他畸形,唇腭裂可以分為非綜合

3、征型唇裂伴或不伴腭裂 ( non-syndromic cleft lip with or without cleft palate, NSCL/P)和綜合征型唇腭裂。大約有20%的唇腭裂與已經發現的400多種綜合征有關,這些綜合征基本符合孟德爾單基因病遺傳模式。大量研究表明NSCL/P 病因是多因素的，可能由某些遺傳易感因子和環境危險因子暴露所引起5-7。Ardinger 等8 報道了第1個唇腭裂關聯基因TGF-，至今已有20 余年。隨著人類單倍型圖譜的完成，單核苷酸多態性( sin2gle nucleotide polymorphism, SNP), 即單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態

4、性, 因其數量眾多和易檢測性,成為新的第三代遺傳標記。SNPs被認為是最重要的人類基因組變異形式,人類基因組中至少存在1千萬個SNPs，平均每300個核苷酸內就有一個SNP,是造成正常表型個體間差異的主要原因9。 很多涉及NSCL/P 遺傳學病因的候選基因分子流行病學研究重復性很差，表明NSCL/P 是一種具有復雜遺傳異質性病因的疾病。所以，在相對單一遺傳學背景的人群中去驗證GWAS 研究結果，對于鑒定該人群特有的NSCL/P 易感基因十分必要,目前基因的篩選、定位以及研究分析方法仍然是NSCL/P病因學的研究難點和熱點 。 2.國內外研究現狀 人類對基因組變異的認識也在逐步深入。1986年,

5、人類基因組的第一個完整的限制性片段長度多態 (restriction fragment length polymorphism, RFLP)圖譜繪制完成,這是人類的第一張分子遺傳圖譜,標志著人類疾病發生機制的遺傳學研究進入了一個新的階段。而后, 微衛星位點(short tandem repeat, STR)代替了RFLP。此時, 基于家系連鎖分析的疾病遺傳學機制研究占據了統治地位。1996年, Risch和Merikangas指出, 通過對一般人群進行病例-對照研究,即關聯分析,對捕獲變異基因具有更高的效力，因而提出了構建人類基因所有變異圖譜的全球計劃,人類單倍型圖譜計劃得以啟動 目前各種遺傳

6、連鎖和關聯研究，包括全基因組關聯分析（genomewideassociation study， GWAS）報道了越來越多的候選基因和染色體區域，如IRF6、FOXE1、BCL3、MYH9、SUMO1、MSX1 和染色體1p22、8q24、10q25、17q22、20q12 等10-14。 2010年Terri H Beaty 等15在多個人群（包括歐洲，亞洲和中國人群）的多中心合作的1965個核心家系樣本的GWAS（Illumina HumanHap550 BeadChip）研究也證實了IRF6基因和8q24.21區段與NSCL/P致病有很強相關性。同時還得出了MAFB和ABCA4兩個基因與N

7、SCL/P致病有很強相關性。MAFB基因又稱為KRML基因，位于20q12，編碼亮氨酸拉鏈轉錄因子，此因子不僅在紅細胞系的生成調節過程中扮演者重要的作用，還作為引起巨噬細胞活化因子表達骨髓瘤細胞的癌基因16.17。動物實驗同樣表明MAFB 基因可能參與鼠的顱面外胚層發育。Beaty 等18 的原位雜交實驗檢測到MAFB 基因的mRNA 和蛋白質信號在孕13.5 14.5 d 胚鼠顎板上皮細胞強表達，推測其可能參與了顎板融合過程。假設某些個體存在由SNP 介導的MAFB 基因單倍不足，則可能導致顎板融合障礙，進而導致NSCL/P 發生。GWAS掃描發現在MAFB整個基因內或其附近的237個SNP

8、中有6個SNP（rs，rs，rs，rs，rs，rs）達到了統計學意義（ p5*10.8）。rs在MAFB基因的下游區，外顯子測序發現了一個錯義突變H131Q,其影響了蛋白結構功能15 Yuan 等19 在拉丁美洲人群重復源GWAS 研究中也證實了另外2 個與rs 存在強連鎖的位點rs 和rs，與NSCL/P 存在陽性關聯。2011年5月何運輔研究發現華南漢族人群中MAFB SNPs rs 、rs1 78 20943 和rs 以及IRF6 SNP rs 與NSCL/P的發病有顯著關聯。這些研究結果均表明MAFB 基因是一個可靠的NSCL/P候選基因。 ：我國的人口基數大，唇腭裂患者數量也多，這既

9、是一個有利于研究的條件，也是一個需要解決的問題。隨著現在微觀領域技術的不斷進步，NSCL/P的基因研究已經取得了一定的成果，目前的易感基因一個個被證實，并且新的易感基因也在不斷被發現，所以在國內外許多機構、學者都致力于這方面的研究，由于唇腭裂病因的復雜性、遺傳模式的不確定性、不同地區甚至不同表型NSCL/P的候選基因座差異性，使研究結果重復性差，出現較多分歧，有的甚至出現背離。這仍是一個亟待解決的問題本研究旨在了解中國寧夏地區回漢族人群中MAFB（rs.rs.rs.rs）與NSCL/P的相關性，探討在寧夏地區回漢族人群中NSCL/P 發病的可能作用，同時也為寧夏地區人群基因數據庫積累資料，不斷

10、完善和發展其在唇腭裂發病機制，為臨床基因診斷提供理論依據，以及為唇腭裂的產前診斷和預防提供科學依據，對有唇腭裂病人的家庭提供有效遺傳咨詢，最終達到降低唇腭裂發生率的目的。 參考文獻 1.Harville ,E.W.,Wilcox ,A.J.,Lie ,R.T.,etal.,Epidemiology of cleft pa late alone and cleft palate with accompanying defects .Eur JE pidemiol ,2007 .22 (6):p.38 9-95 2.Cooper,M.E.,Ratay J.S.and Marazita M.L.,A

11、sianral-facialcleftbir th prevalence.Cleft Palate Craniofac J,2006.43(5):p.580-9.3黃洪章.唇腭裂病因學研究的新進展.口腔頜面外科雜志, 2007, 17 (3) : 201 - 204.4 Zhou Hou-De LiXiao-Ling Li Gui-Yuan. The reasearch development of Single nucleotide polymorphism. Foreign Med Sci Pathophysial Clin Med ，2003，23(5):4444475 Vieira A

12、R. Unraveling human cleft lip and palate research. J Dent Res,2008, 87(2): 119-125.6 Murray CJ. Gene/environment causes of cleft lip and/or palate. ClinGenet, 2002, 61(4): 248-256.7 Dixon MJ, Marazita ML, Beaty TH, et al. Cleft lip and palate: understandinggenetic and environmental infl uences. Nat

13、Rev Genet, 2011,12(3): 167-178.（可續頁） 8 Ardinger HH, Buetow KH, Bell GI, et al. Association of genetic variation of the transforming growth factor-alpha gene with cleft lip and palate. Am J Hum Genet, 1989, 45(3): 348-353.9.Lander ES, Linton LM, Birren B, et al.Initial sequencing and analysis of the

14、human genome. Nature, 2001, 409(6822): 860921. 10 Zucchero TM, Cooper ME, Maher BS, et al. Interferon regulatory factor6 (IRF6) gene variants and the risk of isolated cleft lip or palate. NEngl J Med, 2004, 351(8): 769-780.11 Birnbaum S, Ludwig KU, Reutter H, et al. Key susceptibility locus fornonsy

15、ndromic cleft lip with or without cleft palate on chromosome 8q24. Nat Genet, 2009, 41(4): 473-477.12 Mangold E, Ludwig KU, Birnbaum S, et al. Genome-wide association study identifi es two susceptibility loci for nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate. Nat Genet, 2010, 42(1): 24-26.13 A

16、lkuraya FS, Saadi I, Lund JJ, et al. SUMO1 haploinsuffi ciency leads tocleft lip and palate. Science, 2006, 313(5794): 1751.14 Mangold E, Ludwig KU, Nthen MM. Breakthroughs in the genetics oforofacial clefting. Trends Mol Med, 2011, 17(12): 725-733.15 Beaty TH, Murray JC, Marazita ML, et al. A genom

17、e-wide association study of cleft lip with and without cleft palate identifies risk variants near MAFB and ABCA4. Nat Genet. 2010,42(6): 525529.16Gemelli C, Montanari M, Tenedini E, Zanocco Marani T, Vignudelli T, SienaM, Zini R, Salati S, Tagliaco E,Manfredini R, Grande A, Ferrari S. Virally mediat

18、ed MafB transduction induces the monocyte commitment of human CD34 hematopoietic stem/progenitor cells. Cell Death Differ 2006. 13:16861696.19. Van Stralen E, van de Wetering M, Agnelli L, Neri A, Clevers HC, Bast BJ. Identication of primaryMAFB target genes inmultiplemyeloma. Exp Hematol 2009. 37:7

19、886.17 Van Stralen E, van de Wetering M, Agnelli L, Neri A, Clevers HC, Bast BJ. Identication of primaryMAFB target genes inmultiplemyeloma. Exp Hematol 2009. 37:7886.18 Beaty TH, Murray JC, Marazita ML, et al. A genome-wide associationstudy of cleft lip with and without cleft palate identifi es ris

20、k variantsnear MAFB and ABCA4. Nat Genet, 2010, 42(6): 525-529. 19 Yuan Q, Blanton SH, Hecht JT. Association of ABCA4 and MAFB withnon-syndromic cleft lip with or without cleft palate. Am J Med GenetA, 2011, 155A(6): 1469-1471.二、研究方案1、研究目標、研究內容和擬解決的關鍵問題一）、研究內容：(1)標本收集收集300個寧夏地區非綜合征型唇腭裂(NSCLP)核心家系【包括

21、大家系和3人核心家系（雙親和患者）】以及300名匹配的正常對照組。按知情同意的原則，填寫知情同意書，簽字。并詳細填寫唇腭裂遺傳流行病學研究問卷及臨床檢查表。標本來自寧夏醫科大學附屬醫院以及寧夏各地方的協作醫院。(2)進行SNPs位點篩選。(3)對已經確定的候選基因SNPs位點進行基因分型，應用病例對照和傳遞不平衡檢驗（transmitted disquilibrium test,TDT）的方法，研究確定的SNPs位點等位基因和單倍型與NSCL/P的相關性。二）、研究目標：通過應用病例對照研究和傳遞不平衡檢驗（TDT），比較候選基因SNPs位點等位基因頻率的顯著性差異，以進一步證實和精確定位與寧

22、夏地區NSCL/P有相關性的SNPs位點，并計算有意義SNPs位點對寧夏地區人群NSCL/P發病的貢獻率，發現寧夏地區回漢族人群中這些位點與NSCL/P的相關性，同時也為寧夏地區人群基因數據庫積累資料，不斷完善和發展其在唇腭裂發病機制，為臨床基因診斷提供理論依據。三）、擬解決的關鍵問題：（1）樣本的收集【包括大家系和3人核心家系】及問卷表填寫的認真和完善是本研究的根本保證。（2）候選基因有意義SNPs位點的篩選以及基因分型方法的選擇和結果的可靠性。（3）TaqMan SNP基因分型技術的學習及掌握。（4）用于遺傳統計學分析的軟件及其正確的應用。2、擬采取的研究方法、技術路線、實驗方案及可行性分

23、析（1）標本的采集：按知情同意的原則，填寫知情同意書，簽字。詳細填寫唇腭裂遺傳流行病學研究問卷及臨床檢查表。采集外周靜脈血5ml,加EDTA抗凝劑，20C保存備用。臨床鑒別綜合征型唇腭裂（SCL/P）和非綜合征型唇腭裂（NSCL/P）病例。并進行常規項目的統計、分析，如：NSCL/P類型、性別、年齡，民族及母親懷孕起始三個月吸煙（分為主動和被動吸煙）、飲酒，維生素補充及使用藥物史等流行病學資料。病例組納入標準 患兒為先天性非綜合征型唇腭裂。 患兒不伴有其他系統器官的先天性畸形。 患兒家庭無其他遺傳病家族史。 患兒雙親精神正常，能接受調查者。 患兒雙親須是患兒生物學父母。 患兒父母家庭至少三代為

24、寧夏籍貫。 對照組納入標準健康兒童不伴有系統器官的先天性畸形和疾病。 健康兒童家庭無遺傳病家族史。 健康兒童雙親精神正常，能接受調查者。 健康兒童雙親須是患兒生物學父母。 。 健康兒童父母家庭至少三代為寧夏籍貫。（2）樣本基因組DNA的提取：DNA試劑盒提取法（原理為苯酚抽提法）。抽提好的DNA樣本用紫外吸收法測定DNA的純度和濃度，瓊脂糖凝膠電泳技術加以確認，并將樣品稀釋至20ng/l， -20C冰箱儲存備用。（3）應用Primer 5.0軟件對候選SNPs位點的引物、內切酶的設計。（4）應用TaqMan SNP基因分型技術進行基因分型。（5）挑選10%的分型結果直接測序，驗證基因型的正確率

25、。（6）統計學方法Hard一Weinberg Equilibrium (H一W平衡分析)：指在一個隨機婚配的群體中，各基因頻率和等位基因頻率將保持不變。如p和q分別代表一對等位基因頻率，由這兩個等位基因構成的基因頻率將符合二項分布。候選基因各位點分析前提是基因分型數據必須符合Hardy-Weinber平衡，不符合的將剔除于后分析CASE-CONTROL Comparison（病例對照比較）：根據基因型分別計算病例組和對照組間等位基因頻率，采用卡方檢驗。Transmission-Disequilibrium Testing：（傳遞不平衡檢驗）主要針對的是家系樣本的分析，可以用來檢查家系分型的錯誤

26、，相當于UNPHASED中的pdtphase模塊。該軟件的優點是可以計算特別小數目的家系，可以靈活設定遺傳的模式種類。HaPlotyPe Association （單倍型分析）：單倍型是同一條染色體上緊密相連的兩個或兩個以上多態位點的狀態組合。以單倍型為基礎的分析可以提供更多的信息量。每個等位基因或者突變與一個特殊的歷史進化有關，這樣將有一個獨特的染色體背景或者單倍型。與單個位點分型比較，單倍型分析更有力度。Linkage Disequilibrium calculation,LD(連鎖不平衡檢驗)技術路線圖標本的收集基因組DNA的抽取目標序列的常規PCT擴增直接測序驗證分型TaqManSNP

27、基因分型病例-對照研究 TDT LD 單倍型及歸因危險度的分析檢驗NSCL/P與SNPs的相關性3本課題的創新之處 首次將本課題所選的4個位點rs.rs.rs.rs（1q20），在寧夏地區回漢人群中進行大樣本三人核心家系的NSCL/P相關研究，國內有關NSCL/P的發病與以上四個位點多態性的相關性并未有清楚的研究。4、研究計劃及預測進展（1）第一階段 2012年5月2012年12月：收集寧夏地區回漢族病例組NSCL/P核心家系【包括大家系和3人核心家系（患者和雙親）】以及同期匹配的正常對照組標本；并認真填寫唇腭裂遺傳流行病學研究問卷及臨床檢查表。同時盡快成批抽提基因組DNA，詳細登記編號，-20儲存備用 。進行SNPs位點篩選，在導師幫助下獲得最新國外相關文獻資料，包括網絡資源的利用，最終確定rs.rs.rs.rs（1q20）多態位點。 對已經確定的