1、微生物保藏及根本操作技術中國工業微生物菌種保藏管理中心 CICC姚粟.微生物菌種保藏菌種是進展微生物學研討和運用的根本資料，是開展生物工程的重要根底條件之一，是國家的重要生物資源。菌種保藏管理要求各保藏中心必需具有保藏菌種的詳細歷史及有關實驗資料。并對其所擔任保藏的菌種均應采取妥善、可靠的方法保藏，防止菌種的污染或死亡。 .微生物菌種保藏制定專門菌種保藏管理制度；同一株菌種采用兩種以上保藏方法保管；對只能采用一種保藏方法的菌株備份存放于兩個以上的保藏設備中； 對菌種的入庫和出庫記錄入檔，實行雙人擔任制管理； 設專人擔任管理菌種保藏設備正常運轉，定期檢修維護。 .微生物菌種保藏微生物菌種保藏方法

2、根本原理是在挑選優良純培育物并使其處于休眠形狀根底上，人為地發明一個有利于休眠的環境，使其長期保管后仍能堅持菌種原有的優良特性。根本措施是低溫、真空、枯燥。.常用菌種保藏方法定期移植法液體石蠟法真空冷凍枯燥法-80低溫凍結法液氮超低溫凍結法.定期移植法亦稱傳代培育保藏法，指將菌種接種于適宜的斜面培育基上，最適條件下培育，完成培育于46進展保管并間隔一定時間3-6個月進展移植培育的一種短期菌種保藏方法。操作步驟： 斜面制備 接種 培育 保藏. 接 種.定期移植法操作簡單，運用方便；對設備和人員要求不高；可隨時運用，便于察看菌種；任務勞動強度大，屬短期保藏，保藏本錢高；菌種傳代頻繁，易退化、污染。

3、.液體石蠟法指將菌種接種在適宜的斜面培育基上，最適條件下培育好后注入滅菌的液體石蠟，使其覆蓋整個斜面，再直立放置于低溫46枯燥處進展保管的一種菌種保藏方法。. 操作步驟：液體石蠟預處置斜面培育物制備灌 注 石 蠟保 藏.液體石蠟法操作簡單，運用比較方便；對設備要求不高，對人員操作程度有一定要求；菌種易退化、污染。.真空冷凍枯燥法指將保藏的菌種細胞或孢子懸浮于維護劑中，經預凍后在真空條件下使水分升華，再經真空封存后保管的一種長期菌種保管方法。.安瓿管的預備清洗選用中性玻璃材質的安瓿管；2%鹽酸浸泡810h，自來水沖洗至中性，蒸餾水沖洗23次；置于烘箱中烘干。棉塞打棉塞，160定型2h；標簽激光打

4、印標簽，標明菌株編號和保藏日期，大小約1020mm。噴碼于安瓿管外，160固定20min。滅菌 121 ，30min.維護劑的預備維護劑：12%脫脂牛奶蒸餾水溶液，25ml/管；滅菌鍋加熱至沸騰，將牛奶管放入鍋中，113滅菌20min；翻開放氣閥緩慢排出蒸汽，取出滅菌后脫脂牛奶試管，迅速放入涼水中冷卻；30培育2天，無菌檢查合格后備用。 .凍干樣品制備制備斜面培育物；將維護劑用無菌吸管注入到斜面培育物上，用吸管刮取斜面上的菌體，使菌體均勻地懸浮在維護劑內。用長毛細滴管將菌懸液分裝到安瓿管內，0.10.2ml/管，操作時要把帶有菌懸液的長毛細滴管直接插入安瓿管的底部，勿使菌液沾在管壁上。.真空枯

5、燥 在開動真空泵后應使真空度在15min內到達66.5Pa，隨后逐漸到達26.613.3Pa，在此條件下，樣品將堅持凍結形狀，其中水分那么不斷升華，枯燥才干順利地進展。終止枯燥時間應根據以下情況判別：安瓿管內凍干物呈酥塊狀或松散片狀真空度接近空載時的最高值樣品溫度與管外溫度接近選用12支對看管，其水份與菌懸液同量，當其水分完全蒸發時視為枯燥結束.預凍制備菌懸液、經分裝到進展預凍之間的時間不宜超越1h；分裝完成后將安瓿管立刻放入3540冰箱預凍1h，使菌液完全凍結；可采用分段式預凍，先將分裝好的安瓿管置20凍30分鐘，再放入80冰箱凍30min；采用離心式凍干安裝時勿需預凍。.熔封 將安瓿管的中

6、上部用火焰燒軟，拉成細頸；將安瓿管裝到多歧管上，用火焰在細頸處熔封；拉管時留意火焰不要離菌體太近。.真空度檢測 用高頻電火花檢查各安瓿管的真空情況，如管內呈現灰藍光，闡明真空度符合要求。.真空冷凍枯燥法保藏、運輸方便；保藏時間長(5 10年)；對設備要求高(真空冷凍枯燥機、多歧管)，對人員操作程度要求高；冷凍枯燥過程對菌體有損傷，需恢復培育。.-80冰箱凍結法將菌種懸浮于維護劑中，在80冰箱中凍結保管的一種長期菌種保藏方法。預備冷凍管預備維護劑 10%-15%甘油預備菌懸液細胞、孢子或芽孢懸液制備冷凍管取菌懸液和維護劑至冷凍管保藏 -80，25年.-80冰箱凍結法運用方便；保藏時間較長；對設備

7、要求高(-80冰箱)；運輸不方便。.液氮超低溫凍結法指懸浮于維護劑中的菌種經程控降溫后，移置于196的液氮或150左右的液氮氣相中保管的一種長期菌種保藏方法。.操作步驟冷凍管預備維護劑制備保藏培育物預備預凍 將程序降溫系統預冷到4，將制備好的冷凍管放入其中，以1/min降溫速率降至-35； 運用程序降溫盒。保藏 將預凍后的冷凍管轉移至液氮氣相(-150)或液相(-196)。同“80冰箱凍結法 .液氮超低溫凍結法保藏時間長；保藏效果好，菌種不易退化；對設備要求高(程控降溫儀、液氮罐)，對人員操作程度要求高；保藏本錢高。.不同保藏方法的比較.菌種保藏技術進展程序降溫控制技術凍結速度對菌種細胞的影響

8、冷凍速度慢：細胞內水分外滲多，細胞脫水，體積收縮。冷度速度快：細胞內水分沒有足夠時間外滲，細胞內結冰。冷凍速度非常快：細胞內冰晶非常小或稱玻璃化形狀。.原位低溫保藏技術 有些菌種不可培育，也無法采用規范的冷凍枯燥技術保藏，如一些致病菌、無法培育的菌種或者與其他微生物共生的菌種如菌根真菌等。這些菌種可采用原位低溫保藏技術，這一技術曾經被運用在一些銹菌種的保藏過程中。Teliospores : Puccinia spp。Source: doacs.state.fl.us/pi/enpp/pathology/images/dayl.菌種保藏技術進展.包埋固定化技術 是在藻酸鈣顆粒或其他基質中進展的。

9、含有藻酸鈉的菌懸浮液參與氯化鈣后會構成藻酸鈣固定化細胞，細胞一旦固定化，便可采取傳統的凍干保藏方法進展保藏。這種固定化技術曾經被運用在真菌中，并延伸至線蟲和藻類。Mycelium radiating from an alginate bead on an agar plate. M.Ryan / Mycologist 15: 66-69菌種保藏技術進展.玻璃化技術 就是用極快的冷卻速率，使細胞及其所處的溶液來不及構成冰晶，一下子以“非晶體的方式固化下來，可以阻止冰晶體對細胞的破壞作用。 對于1微米直徑的純真水滴，只需當冷卻速率高達107/秒時才干實現“玻璃化。 菌種保藏技術進展.規范菌株要求藥

10、品微生物檢驗用的實驗菌應來自認可的國內或國外菌種收藏機構的規范菌株，或運用與規范菌株一切相關特性等效的商業派生菌株。312021版中國藥典.國內認可的菌種收藏機構1979年7月，全國第一屆菌種保藏管理睬議正式成立中國菌種保藏管理委員會CCCCM，委員會下設7個全國性菌種保藏管理中心及機構所在地：普通微生物菌種保藏管理中心CCGMC, 中國科學院微生物研討所農業微生物菌種保藏管理中心ACCC,中國農科院區劃所工業微生物菌種保藏管理中心CICC，中國食品發酵工業研討院醫學微生物菌種保藏管理中心CMCC，中國藥品生物制品鑒定所抗菌素菌種保藏管理中心CACC，中國醫科院醫用生物技術研討所獸醫微生物菌種

11、保藏管理中心CVCC，農業部獸醫藥品監察所林業微生物菌種保藏管理中心CFCC，中國林業科學院 .國認外可的菌種收藏機構世界菌種保藏結合會WFCC (World Federation Of Culture Collection)全球注冊的菌種保藏機構583家ATCCNRRLDSMZNCTCCMICBSNBRC(IFO)JCM.菌株代數 美國藥典USP中規定：“將微生物接種至一新穎培育基上/內，每萌生一次即稱為一代，并規定“菌種的傳代次數自原始菌種凍干粉起不得超越5代。 United States Pharmacopoeia (USP) provides that: to microbial in

12、oculation to a fresh medium on / in each germination time is referred to as a generation, and provides that strains of the passages (from the original strain from freeze-dried powder) must not exceed 5 generation. “ 我國的GMP認證中也如此要求，并且中國藥典2005年版藥典也已做出“菌種的傳代次數自原始菌種凍干粉起不得超越5代這個明確的規定。 Chinas GMP certific

13、ation is asking, and the Chinese Pharmacopoeia 2005 edition of Pharmacopoeia also had a strain of the passages (from the original strain from freeze-dried powder) should not exceed 5 on behalf of The clearly defined.Enrichment (G1)Separation of single-olony(G2)Working strain (W3)Working strain (W4)Working strain (W5).規范菌株提供方式AccuracyEasy of Use(preparation)HighLowComplicatedEasyQu