1、第11章 環(huán)境微生物檢測.11.1 空氣中微生物的檢測與控制11.1.1 空氣中微生物的檢測方法 (1)撞擊法 撞擊法是采用撞擊式空氣微生物采樣器，經(jīng)過抽氣動(dòng)力作用，使空氣經(jīng)過狹縫或小孔而產(chǎn)生高速氣流，使懸浮在空氣中的帶菌輪子撞擊到轉(zhuǎn)動(dòng)的營養(yǎng)瓊脂培育基平皿上。經(jīng)37、48h培育，計(jì)算出每立方米空氣中所含的細(xì)菌菌落數(shù)。. (2) 自然沉降法 自然沉降法是靠重力的作用將空氣中攜帶微生物的懸浮顆粒沉陷到直徑9cm的營養(yǎng)瓊脂培育基平皿上，經(jīng)37，48h培育后計(jì)生長的細(xì)菌菌落數(shù)。. 由于沉降法是被動(dòng)采樣，會(huì)呵斥很大的誤差。經(jīng)過前蘇聯(lián)奧梅梁斯基公式換算出。. 通常設(shè)置5個(gè)采樣點(diǎn)，即室內(nèi)墻角對角線交點(diǎn)為1個(gè)

2、采樣點(diǎn)，該交點(diǎn)與四墻角延續(xù)的中點(diǎn)為另外4個(gè)采樣點(diǎn)。采樣高度為1.21.5m。采樣點(diǎn)心遠(yuǎn)離墻壁1m以上，并避開空調(diào)、門窗等空氣流通處。檢測點(diǎn)數(shù)越多越準(zhǔn)確，以2030個(gè)測點(diǎn)數(shù)為宜，最少測點(diǎn)數(shù)為56。.(3)過濾法 過濾法是在負(fù)壓下抽濾空氣，使空氣經(jīng)過經(jīng)滅菌的微孔濾膜，空氣中細(xì)菌被截留在膜上，然后將膜轉(zhuǎn)移到培育基上，使濾膜與培育基完全貼緊，倒置于37恒溫箱培育24h。經(jīng)過計(jì)平板上的菌落數(shù)，測定空氣中細(xì)菌的數(shù)量。. 空氣中微生物總數(shù)目前用CFUm3，計(jì)量。即每立方米空氣落下的細(xì)菌數(shù)，普通以室內(nèi)空氣中細(xì)菌總數(shù)5001000 CFUm3以作為空氣污染目的。.11.1.2 空氣微生物污染的控制 控制空氣微生

3、物污染，必需減少空氣中微生物的來源，特別是微生物污染嚴(yán)重的醫(yī)院，肉類加工等行業(yè)廢水廢物的處置消毒任務(wù)；搞好室內(nèi)外環(huán)境衛(wèi)生。減少微生物繁殖；綠化造林也是凈化市氣、除塵、殺菌和吸收有害氣體的重要途徑；另外空氣消毒和空氣凈化器對凈化空氣也起一定的作用。.日本建議的評價(jià)空氣清潔程度的標(biāo)淮見表.11.2 水的微生物檢測及控制11.2.1 水質(zhì)的細(xì)菌學(xué)檢測 我國GB5749-85關(guān)于飲用水中的細(xì)菌規(guī)范與大腸菌群數(shù)量規(guī)范為1細(xì)菌總數(shù)100個(gè)/ml2大腸菌群 3 個(gè)/L.一、傷寒桿菌病癥：傷寒或副傷寒。表現(xiàn)：繼續(xù)發(fā)燒，牽涉到淋巴組織，脾臟腫大，軀干上出現(xiàn)紅斑，胃腸壁潰瘍產(chǎn)生腹瀉。 傷寒沙門氏菌.二、痢疾桿菌痢

4、疾桿菌可引起細(xì)菌性痢疾(與阿米巴痢疾不同)，病癥為急性腹瀉，通常大便中有血及粘液，某些病例中有發(fā)燒。.三、霍亂弧菌病癥：霍亂病癥：輕型病例中，只呵斥腹瀉。 在較嚴(yán)重或較典型的病例中，除腹瀉外，病癥還包括嘔吐、“米湯樣大便、腹疼和昏迷等。病程短，嚴(yán)重的經(jīng)常在病癥出現(xiàn)后12h內(nèi)死亡。電鏡照片運(yùn)用的是結(jié)晶紫單染色，假設(shè)革蘭氏染色那么為陰性紅色.四、寄生蟲真菌普統(tǒng)統(tǒng)過接觸傳染，不經(jīng)過水傳播，引起疾病的原生動(dòng)物和小型后生動(dòng)物也由水傳播，通常稱為寄生蟲。在目前發(fā)現(xiàn)的幾千種原生動(dòng)物中只需20種能引起人類疾病傳播方式：除了飲水不衛(wèi)生外，更多的是經(jīng)過食物以及昆蟲血液傳播如瘧疾是蚊子傳播，食用生肉感染肉類寄生蟲等

5、.11.2.2 水質(zhì)指示微生物大腸菌群 大腸菌群是人腸道中正常的寄生菌，是一群需氧和兼性厭氧的，能在37，24h內(nèi)使乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭陰性無芽孢桿菌，又稱總大腸菌群。 大腸菌群作為水體被糞便污染的目的，也是飲水、食品等的細(xì)菌學(xué)常規(guī)檢驗(yàn)?zāi)康闹唬ǔＳ谩按竽c菌群指數(shù)和“大腸菌群值表示。. 這些寄生菌通常與人體構(gòu)成互利共生關(guān)系，當(dāng)人體免疫力下降時(shí)，他們那么有能夠成為引起腸炎的致病菌，他們中的個(gè)別變種還會(huì)變?yōu)闃O具毒性的病菌。 如大腸埃希氏菌可引起幼兒腹瀉，引起美國和日本傳染病流行的O-157也是大腸埃希氏菌的變種菌株。.中國水質(zhì)規(guī)范中規(guī)定的大腸菌群數(shù)(個(gè)L) 飲用水 3 游泳池水 100 地表水

6、 第一級 500 第二級 10000 第三級 50000.11.2.2.1 大腸菌群檢測的目的和原理(一) 生理習(xí)性與腸道病原菌類似，即在外界的生存 時(shí)間根本一致；代表性(二) 在糞便中的數(shù)量較多；比病原菌多，不會(huì)漏 檢(三)檢驗(yàn)技術(shù)較簡單;操作方便.11.2.2.2 大腸菌群的檢測方法 常用的大腸菌群的檢測方法有多管發(fā)酵法與膜濾法。1多管發(fā)酵法即最大能夠數(shù)法， MPN 發(fā)酵法是大腸菌群測定的國家規(guī)范方法。分為三步。A初發(fā)酵目的：水中大腸菌群存在與否的初步判別。.A.初發(fā)酵方法為將水樣置于糖類液體培育基中，在一定溫度下，經(jīng)一定時(shí)間培育后，察看有無酸和氣體產(chǎn)生，即有無發(fā)酵，而初步確定有無大腸菌群

7、存在。如采用含有葡萄糖或甘露醇的培育基，那么包括副大腸桿菌；如不思索副大腸桿菌，那么用乳糖培育基。由于水中除大腸菌群外，還能夠存在其它發(fā)酵糖類物質(zhì)的細(xì)菌，所以培育后如發(fā)現(xiàn)氣體和酸并不一定能一定水中含有大腸菌群，還需根據(jù)這類細(xì)菌的其它特性進(jìn)展下兩階段的檢驗(yàn)。.實(shí)驗(yàn)中的培育基中參與了酸堿指示劑紫色的溴甲酚紫，產(chǎn)酸時(shí)指示劑變黃，同時(shí)培育基中口朝下放置了裝滿同樣培育基的小試管，產(chǎn)氣時(shí)小試管中會(huì)封鎖一段氣體，被作為培育中能否產(chǎn)氣的根據(jù)。.目的：鑒定產(chǎn)酸產(chǎn)氣菌的染色特征、好氧與否、芽孢特征。根據(jù)：大腸菌群在固體培育基上可以在空氣生長，革蘭氏染色呈陰性和不生芽孢的特性B.平板分別.復(fù)發(fā)酵在此階段，先將上一實(shí)

8、驗(yàn)產(chǎn)酸的菌種移植于品紅亞硫酸鈉培育基(遠(yuǎn)藤氏培育基)或伊紅美藍(lán)培育基外表劃線接種是為了分別出單菌落，防治菌落不純干擾結(jié)果，這一步氧氣可以阻止厭氧芽抱桿菌的生長，而上述培育基所含染料物質(zhì)也有抑制許多其它細(xì)菌生長的作用。.C.復(fù)發(fā)酵目的：驗(yàn)證將可疑的菌落再移植于糖類培育基中，察看其能否發(fā)酵，能否產(chǎn)酸產(chǎn)氣，最后一定有無大腸菌群存在。 對于自來水廠出水，初步發(fā)酵實(shí)驗(yàn)普通都在10個(gè)小發(fā)酵管和2個(gè)大發(fā)酵管(或發(fā)酵瓶)內(nèi)進(jìn)展，復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)?zāi)敲丛谛“l(fā)酵管內(nèi)進(jìn)展。根據(jù)一定有大腸菌群存在的初步發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵管或瓶的數(shù)目及實(shí)驗(yàn)所用的水樣量，即可利用數(shù)理統(tǒng)計(jì)原理，查表得出結(jié)果。.2膜濾法 運(yùn)用的濾膜是孔徑為0.450.

9、65m的微孔濾膜；轉(zhuǎn)移至伊紅美蘭平板上。.11.2.3 水微生物污染的控制 控制水體微生物的污染首先必需從源頭做起，即控制排放廢水，尤其是醫(yī)院廢水等微生物的含量,防止大量有害微生物進(jìn)入水體； 其次，消除微生物茲生的環(huán)境。凈化水體，對地表水、游泳池水要進(jìn)展定期檢測，必要時(shí)參與消毒劑以殺滅微生物。.11.3 發(fā)光細(xì)菌的微毒檢測 發(fā)光細(xì)菌法是20世紀(jì)70年代后期提出的一種微生物檢測環(huán)境水質(zhì)毒性的新方法。發(fā)光細(xì)菌法簡便、快速、靈敏、精度高，凡有毒化合物、廢水、廢物的生物毒性均可測定。 發(fā)光細(xì)菌法已被中國國家環(huán)境維護(hù)總局規(guī)定為測定水環(huán)境急性毒性的國家規(guī)范。.11.3.1 發(fā)光細(xì)菌檢測的原理 細(xì)菌的發(fā)光過

10、積是菌體內(nèi)一種新陳代謝的生理過程。菌體含有熒光素、熒光酶、ATP等發(fā)光要素，在有氧條件下經(jīng)過細(xì)胞內(nèi)生化反響而產(chǎn)生微弱熒光。 毒物濃度與菌體發(fā)光強(qiáng)度呈線性負(fù)相關(guān)關(guān)系，發(fā)光細(xì)菌法就是利用靈敏的光電丈量系統(tǒng)測定毒物對細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度的抑制程度進(jìn)而反映環(huán)境中毒物毒性大小，用發(fā)光度表征毒物所在環(huán)境的急性毒件。.11.3.2 發(fā)光細(xì)菌法檢測的操作 目前國內(nèi)外發(fā)光細(xì)菌的測定常用的有兩種方法。 新穎發(fā)光細(xì)菌培育測定法 即將發(fā)光菌接種于液體培育基中，在適當(dāng)條件下(200.5)振蕩培育到對數(shù)生長期，配制含3NaCl鹽度的適當(dāng)濃度的菌懸液參與測試管中，再參與待測液，使之與菌液接觸，作用515min后，讀出并記錄對看管和

11、樣品管發(fā)光強(qiáng)度。此法操作較為簡便。. 冷凍枯燥發(fā)光細(xì)菌制劑測定法 即把培育到對數(shù)生長期的發(fā)光細(xì)菌，以冷凍枯燥法制成干粉劑，運(yùn)用時(shí)參與冷的2NaCl溶液復(fù)蘇，使其恢復(fù)到原來的生理形狀和發(fā)光程度，然后用于測定。這是國家規(guī)范方法，其優(yōu)點(diǎn)是可實(shí)行測定的質(zhì)量控制。凍干粉可長期保藏方便運(yùn)用，操作簡便，節(jié)約時(shí)間。.11.3.3 發(fā)光細(xì)菌法的運(yùn)用在水質(zhì)監(jiān)測中的運(yùn)用在工業(yè)廢水、固體廢物、廢氣的急性毒性檢測中的運(yùn)用 對重金屬急性毒性效應(yīng)的測定和評價(jià)對化學(xué)品的毒性評價(jià)和平安性評價(jià) .11.4 污染物致突變性檢測Ames實(shí)驗(yàn) 該實(shí)驗(yàn)是經(jīng)過測定有污染物存在時(shí)鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium)的

12、組氨酸營養(yǎng)缺陷型(his-)菌株發(fā)生回復(fù)突變的概率來判別污染物的致癌、致突變效應(yīng)。其陽性結(jié)果與致癌物吻合率高達(dá)83。 列為評價(jià)化學(xué)物質(zhì)平安性的首選力法。.11.4.1 Ames實(shí)驗(yàn)的原理和方法 鼠傷寒沙門菌的組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株，在不含組氨酸的培育基上不能生長。但當(dāng)遭到致突變物作用后，大量細(xì)胞在遺傳物質(zhì)的特定座位發(fā)生基因回復(fù)突變而成為野生型，能自行合成組氨酸，此時(shí)培育物中雖不含組氨酸。組氨酸缺陷型菌株亦能生長并構(gòu)成菌落。 Ames實(shí)驗(yàn)就是通道在培育物中參與待測物，根據(jù)不含組氨酸的培育基上組氨酸營養(yǎng)缺陷型茵株長出回復(fù)突變菌落數(shù)目的多少判別待測物的致突變性。.(1)實(shí)驗(yàn)菌株 采用鼠傷寒沙門菌變異株

13、TA97，TA 98，TAl00，TAl02四種菌種，又添加了TA1535，TA1537，TA1538共七株。.(2)試劑 牛肉膏蛋白陳培育基 牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0gNacl 5.0g,水1000mL.pH7.27.4 S9mix 大鼠肝勻漿S9與NADP、G-6-P、KCl、Na2 HPO4、KH2PO4和水配成混合液。.(3)菌種鑒定 在實(shí)驗(yàn)之前都要進(jìn)展全面的生物學(xué)特性和敏感性鑒定，符合要求才干運(yùn)用。脂多糖屏障喪失 斷定能否是缺陷型R因子 判別菌體能否存在或失去了某種 抗藥性質(zhì)粒。紫外線損傷修復(fù)缺陷.自發(fā)回變回變特性診斷性實(shí)驗(yàn) 組氨酸營養(yǎng)缺陷型(4)操作方法 Ames實(shí)驗(yàn)的典型操

14、作方法有平板摻入實(shí)驗(yàn)和斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)兩種。.11.4.2 Ames實(shí)驗(yàn)的運(yùn)用檢測食品添加劑、化裝品等的致突變性，由此推測其致癌性。檢測水源水和飲用水的致突變性，探求較現(xiàn)行方法更加衛(wèi)生平安的消毒措施。檢測城市污水和工業(yè)廢水的致突變性，結(jié)合化學(xué)分析，追蹤污染源，為研討防治對策提供根據(jù)。 .檢測土壤、污泥、工業(yè)廢物堆肥、廢物灰燼的致突變性。以防止維系生命的土壤受致突變物污染后，再經(jīng)過農(nóng)作物危害人類。 檢測氣態(tài)污染物的致突變性，防止污染物經(jīng)出大氣，通道呼吸對人體發(fā)生潛在危害。研討化合物構(gòu)造與致突變性的關(guān)系。為合成對環(huán)境無潛在危害的新化合物提供型論根據(jù)。.檢測農(nóng)藥在微生物降解前后的致突變性，了解農(nóng)藥在施用后代

15、謝過程中對人類有無隱患。 挑選抗突變物，研討開發(fā)新的抗痛藥。抗誘變要素在抗癌作用上至關(guān)重要、隨著遺傳毒理學(xué)的開展，經(jīng)過挑選已發(fā)現(xiàn)天然食物如蔬菜類、茶葉、中草藥等都員有抗誘變作用。.11.5 生物傳感器11.5.1 生物傳感器的定義與分類 傳感器是能感受特定的被丈量的物質(zhì)并按照一定規(guī)律將其轉(zhuǎn)換成可用信號的器件或安裝。 生物傳感器是用固定化生物成分或生物體作為敏感元件的傳感器。.生物傳感器的分類主要有三種方式。根據(jù)生物傳感器中分子識(shí)別元件即敏感元件可分為五類：酶傳感器、微生物傳感器、細(xì)胞傳感器、組織傳感器和免疫傳感器。根據(jù)生物傳感器的換能器即信號轉(zhuǎn)換器分類有：生物電極傳感器、半導(dǎo)體生物傳感器、光生

16、物傳感器、熱生物傳感器、壓電晶體生物傳感器等。.以被測目的與分子識(shí)別元件的相互作用方式進(jìn)展分類有：生物親和型生物傳感器和代謝型或催化型生物傳感器。 三種分類方法之間相互交義，相互浸透。.11.5.2 生物傳感器根本構(gòu)造和任務(wù)原理 生物傳感器通常由敏感元件(生物分子)、轉(zhuǎn)換元件及相應(yīng)的機(jī)械構(gòu)造和電子線路所組成，它以生物分子所發(fā)生的物理或化學(xué)變化轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的電信號予以放大輸出，從而得到檢測結(jié)果。. 生物傳感器的任務(wù)原理主要有以下幾種： (1)將化學(xué)變化轉(zhuǎn)變成電信號 (2)將熱變化轉(zhuǎn)換成電信號 (3)將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?(4)直接產(chǎn)生電信號方式 . 11.5.3 生物傳感器在環(huán)境檢測中的運(yùn)用(1)BOD生物傳感器 運(yùn)用BOD傳感器完成樣品的測定，普通在1030min，比傳統(tǒng)法的測定時(shí)間大為縮短。(2)測定氨生物傳感器(3)亞硝酸鹽生物傳感器 (4)致突變物傳感器(5)急性毒性發(fā)光細(xì)菌生物傳感器.11.6 PCR技