1、. 泛素化修飾與人類疾病泛素-蛋白酶體途徑由泛素(ubiquitin，Ub)、泛素活化酶(ubiquitin-activating enzyme，E1)、泛素結合酶(ubiquitin-conjugating enzymes，E2s)、泛素-蛋白連接酶(ubiquitin-protein ligases，E3s)、26S蛋白酶體和泛素解離酶(deubiquitinating enzymes，DUBs)等組成，其對靶蛋白的降解是一種級聯反響過程。泛素首先在El催化下，其C末端甘氨酸殘基與El的半胱氨酸殘基間形成高能硫酯鍵而獲得活性。El-泛素結合的中間體再將泛素轉移給E2，形成E2-泛素中間體。

2、最后靶蛋白的泛素化還需要另一個特異的泛素蛋白連接酶E3s。E3s可以直接或間接與底物結合，促使泛素從與E2s形成的硫酯中間產物轉移到靶蛋白賴氨酸殘基的氨基基團上，形成異肽鍵(isopeptide bond)。當第一個泛素分子連接到靶蛋白上后，另外一些泛素分子在E3s的催化下相繼與底物相連的泛素分子的第48位賴氨酸殘基相連，形成一條多聚泛素鏈，作為底物被蛋白酶體識別和降解的靶向性信號。完成泛素化的蛋白質構造被展平進入26S蛋白酶體，在20S催化中心中被降解，泛素分子可被DUBs從底物上水解下來，重復利用。一、泛素(Ub)泛素是1975年由Goldstein首先發現的一種在真核生物細胞高度保守的多

3、肽，單個泛素分子由76個氨基酸組成，分子量約8.5kD。在不同生物體間組成泛素的氨基酸序列差異很小，如酵母和人的泛素僅有3個氨基酸序列的差異。泛素分子嚴密折疊成球形，5股混合的片層形成一個腔樣構造，部對角線位置有1個螺旋，這個構造稱為泛素折疊。這個小蛋白含有一個明顯的疏水核心和大量的氫鍵，表現出特殊的穩定性，能夠防止在結合和靶向性降解循環中變性失活，從而保證泛素循環的運行。從泛素折疊中突出來的是具有一定變形性的C末端延伸局部，這個末端第76位含有一個必須的甘氨酸。泛素與其它蛋白都是通過C-末端第76位甘氨酸來連接的。二、泛素活化酶(E1)El是泛素與底物蛋白結合所需要的第一個酶，但是對靶蛋白的

4、特異性卻幾乎沒有影響。El是一種廣泛表達的多肽，大約1100個氨基酸，含有位置固定的保守的半胱氨酸殘基。El有2個亞型，是由同一個mRNA在不同的起始位點翻譯而成的，存在于細胞漿和細胞核中。酵母的El基因失活后是致命的，說明這個蛋白對于細胞的生存是至關重要的(Stephen等1996)。El可以水解ATP，與泛素的羧基末端形成高能硫酯鍵而激活泛素。在真核生物這個激活反響由兩步構成：起始形成泛素-腺苷酸中間物，接下來這個中間物與El半胱氨酸殘基發生反響形成E1-Ub硫酯鍵。通常一個泛素分子有一個單獨的E1。E1具有高度的催化效能，在低濃度的情況下就能夠激活泛素，滿足下游的級聯反響過程(Picka

5、rt2001)。三、泛素結合酶(E2s)級聯反響的第二步是泛素分子經過轉硫醇反響從E1半胱氨酸殘基轉移給E2s活化的半胱氨酸位點。E2s在哺乳動物中至少有25個基因，所有的E2s都含有一個保守的大約150個氨基酸的核心構造域，在構造域的中央是決定E2s活性的半胱氨酸殘基，位于蛋白外表淺的裂隙(Hamilton等2001)。E2s家族中的一小局部成員只含有這個核心構造，但是其它的大局部成員還有N-或C-末端的延伸，這種構造可能與E3s的識別、E2s自身的活性以及底物識別有關。E1和E3s通過一樣的基序與E2s連接，這說明在反響循環過程中，E2s必須在E1和E3s之間穿梭往返運行。因此為了保證在激

6、活的泛素與數量巨大的E3s之間得到平衡的分布，需要多個E2s異構體。E2sUb非共價結合的親和力非常低，說明其在轉移泛素分子到靶蛋白上起著重要的作用。四、泛素-蛋白連接酶(E3s)泛素化途徑最重要的特征就是底物的多樣性和選擇性，這一功能由E3s直接決定。目前主要有3種類型的E3s，即含有HECT(homologous to E6-associatedprotein carbo*yl terminus)構造域的E3s、含有環指狀(RING finger)構造域的E3s和含有U-bo*構造域的E3s2。在高等生物E3的總數從幾百到一千以上，新的E3亞家族仍不斷被發現。正是由于這些復雜多變的E3s家

7、族成員可以對不同的底物進展特異性的識別，才呈現出蛋白降解的高度選擇性。(一)含有HECT構造域的E3s HECT E3s的命名是因為其C-末端含有一段大約350個氨基酸的區域與E6-AP(E6-associated protein)的C-末端同源。HECT E3s催化轉硫醇反響將E2s中的泛素轉移給HECT構造域的保守的半胱氨酸殘基。E6AP-HECTUbcH7復合體的晶體構造顯示HECT構造域呈L形，活性位點位于L形的拐彎處(Huang等1999)。游離的HECT構造域與E2s有較強的相互作用，E2s結合位點位于L形基底部的末端。HECT構造域的缺失不影響底物的結合，高度可變的N末端構造域負

8、責對特異底物的識別和結合。(二)含有環指狀構造域的E3s 其特征是含有一個保守的組氨酸和半胱氨酸殘基復合體，在其中心有2個Zn+離子。RING E3s沒有直接催化蛋白泛素化的作用，其作為一個停靠位點將靶蛋白和E2s聚集在一起，然后介導泛素的轉移而不是與泛素形成硫酯鍵。含有環指狀構造域的E3s可被分成2種類型，一種是單個蛋白，其代表是作為P53的E3s的MDM2(mouse double minute 2)癌蛋白(Honda等2000)以及作為受體酪氨酸激酶如表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)和血小板衍生因子受體(platelet-de

9、rived growth factorreceptor)E3s的c-Cbl(Tsygankov等2001)。另一種是多蛋白組成的復合體，包括SCF(Skpl-CullinCdc53-F-bo*-Rb*1)、有絲分裂后期促進復合物(aftaphasepromoting ple*，APC)和VBC-Cul2復合體(the von-Hippel-Lindau-elongins B and C-Cul2ple*)。SCF E3s是至少有4種多肽組成的復合體。被命名為SCF是因為其中的三個核心亞基(Skpl、CullinCDC53和一個F-Bo*蛋白)。后來第四個亞基Rb*l(RING bo* 1 pr

10、otein)被發現，其含有一個RING H2-型構造域。在SCF E3s中的Rb*l能夠集合E2，Cullins蛋白作為Rb*l與蛋白之間的支架參與底物的選擇性。底物的識別由底物特異性的F-bo*蛋白所介導，F-bo*本身被SCF E3s復合體中的Skpl接頭因子所識別和聚集。Skpl與Cullins結合，因此將底物和泛素并列排開。F-bo*蛋白的特征是含有一個大約4O個氨基酸的基序，最初在細胞周期蛋白F中鑒定出來。人類含有大量的F-bo*蛋白，可以分成不同的亞類，在多數情況下F-bo*蛋白結合磷酸化的蛋白質。如SCF E3s通過引起p27和cdc25的快速降解來調節細胞周期3。APC的核心顆

11、粒至少含有13個亞基，最初發現在降解Cyclin的過程中起著重要作用。隨后研究發現，其具有控制在有絲分裂進展和完畢過程中起著至關重要的一些因子的半衰期的功能4。APC中的2個亞基APC2和APC11分別與SCF E3s復合體中的Cullinl和Rb*l相關，推測APC2可能具有連接其它亞基的作用，而APC11則具有結合Ub-E2s中間體的作用。von-Hippel Lindau(VHL)腫瘤抑制因子蛋白E3復合體與SCF型復合體有所不同，其核心區有Rb*l和Cul2A構造，然而Skp1被轉錄延伸因子B/C所代替。轉錄延伸因子B/C復合體能夠調節VHL與其它蛋白的相互作用，包括RNA聚合酶II延

12、長因子A和細胞因子信號轉導抑制分子(suppressors of cytokine signalling，SOCS)盒裝蛋白。這種復合體與靶蛋白特異結合的方式雖然簡單，但是效率卻很高(Kim等2003)。(三)含有U-bo*構造域的E3s U-bo* E3s是一個相對較小的E3s家族，在構造上與RING構造域相似(Ohi等2003)，因此有的人將U-bo* E3s與環指狀構造域的E3s歸為一類。在一些情況下多泛素鏈的形成還需要泛素鏈延長因子的輔助，人們將具有這類功能的酶命名為E4s。U-bo*家族成員具有E4s的特點。第一個被鑒定的E4s家族是泛素融合降解蛋白(ubiquitin fusion

13、 degradation 2，UFD2)，其特征是C末端含有一個大約70個氨基酸的保守的U-bo*，在構造上與RING-finger E3s相關，能與含有13個泛素分子的底物結合，催化其它的泛素分子附加到底物上，形成含有多泛素鏈的底物。U-bo*家族的另一個成員是與熱休克蛋白70 C-末端相互作用蛋白(C terminus of Hsc70-interacting protein，CHIP)，在降解途徑中作為泛素鏈延長因子與另外的E3s協同作用，能夠結合伴侶分子識別的異常或錯誤折疊的蛋白質，導致他們被26S蛋白酶體所降解，是另一個含有U-bo*的具有E4功能的蛋白質。目前還不清楚是否含有U-b

14、o*構造域的蛋白質都具有E4s的活性。(四)E3s與靶蛋白多聚泛素鏈的形成靶蛋白的泛素鏈最少需要四個泛素分子的長度才能夠被蛋白酶體有效降解。關于靶蛋白的泛素鏈是如何形成的還不清楚，推測可能存在以下4種模型6：(1)有序增加模型(sequential addition mode1)也稱為標準模型，即E3通過不同的構造域(如RING E3s)與E2和底物結合，形成E2-E3-底物復合體，E3促使與E2連接的泛素分子直接轉移到底物的賴氨酸殘基，然后E2-E3-底物復合體中的E2再承受來自E1分子傳遞的新的泛素分子，在E3的作用下將泛素分子直接轉移到與底物相連的第一個泛素分子，接下來循環此過程，完成靶

15、蛋白泛素鏈的組裝；(2)指數模型(inde*ation mode1)是指在形成E2-E3-底物復合體后，E2上的第一個泛素分子首先與E3s的HECT構造域的半胱氨酸活化位點結合，然后依次在此位置形成一條泛素鏈，最后泛素鏈從E3上轉移到底物的賴氨酸殘基；(3)秋千模型(seesaw mode1)是指E3與2個E2和底物形成復合體后，泛素鏈的組裝發生在2個E2的活化位點上，即一個E2上的泛素分子轉移到另一個E2上后，新轉移過來的泛素位于最底層直接與E2連接的位置，而原來與E2直接連接的泛素則與新轉移過來的泛素相連，依此從后向前的方式形成一條泛素鏈，最后泛素鏈直接從E2轉移到底物上；(4)雜和模型(

16、hybrid mode1)是指E2-E3-底物復合體形成后，E2上的泛素分子首先轉移到E3上，在E3上形成一條泛素鏈，然后泛素鏈按照E3 El E2底物的傳遞順序連接到靶蛋白上。不同的E3s可能通過不同的機制組裝靶蛋白的多泛素鏈。五、泛素解離酶(DUBs)雖然泛素與細胞快速降解的蛋白連接在一起，但是其本身卻是長壽命蛋白，這是由于泛素蛋白偶連物在水解之前DUBs將泛素從底物上解離下來。DUBs屬于蛋白酶超家族，根據其催化機制，可以分為5類(天門冬氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶)，生物信息學研究顯示大約有79個有功能的DUBs7，其局部為半胱氨酸蛋白酶。DUBs能

17、夠識別最接近的泛素基序，特異性地在泛素和與其C末端最后一個殘基(Gly76)相連的分子之連續開(Amerik等2004)。半胱氨酸蛋白酶型DUBs根據泛素-蛋白酶構造域又可分為4個亞類：泛素特異性蛋白酶(USP)、碳末端水解酶(UCH)、卵巢腫瘤蛋白酶(OTU)和MJD蛋白酶。金屬蛋白酶型DUBs的泛素一蛋白酶構造域稱為JAMM(JAB1MPNMov34metalloenzyme)(Amerik等2004)。半胱氨酸蛋白酶的活性信賴于活性位點中的一個半胱氨酸的硫醇基團。這個半胱氨酸在鄰近組蛋白的輔助下去質子化，在一個天門冬氨酸殘基的作用下產生極性，這三個氨基酸殘基構成催化三聯體。在催化過程中，

18、半胱氨酸表現出親質子作用，攻擊靶蛋白與泛素之間易斷裂肽鍵的羰基端，結果將靶蛋白釋放出來，泛素與UDBs形成一個共價連接的中間體。中間體與水分子反響釋放出游離的酶和泛素。六、26S蛋白酶體26S蛋白酶體是降解泛素化底物的一個ATP依賴型蛋白水解復合體，由20S核心蛋白酶(core protease，CP)和19S調節顆粒(regulatory particle，RP)構成。CP是由4個七聚體蛋白組成的環層疊在一起形成的一個空心圓柱體樣構造(l-71-7l-71-7)，是26S蛋白酶體的水解核心。活性位點位于20S圓柱體空心構造中心的2個環上，含有胰蛋白酶、糜蛋白酶和谷氨酰樣肽水解活性，具有能夠使

19、大多數肽鍵斷裂的能力(Voges等 1999)。2個亞基的氨基末端封住蛋白水解腔隙的人口，對蛋白酶體CP的活性具有自身抑制作用，這樣只有進入蛋白酶體圓柱體部的蛋白才能夠被水解。RP由基底(Base)和蓋子(Lid)兩個亞單位組成，分別與CP兩端的環相結合。基底亞單位是由6個相關的AAAATPases RPT1-6(regulatory particle triple-Aprotein)和3個non-ATPase RPN(regulatory particlenon-ATPase)1、2和10組成的環狀構造，能夠活化20S核心顆粒(Glickman等1998)。蓋子亞單位含有其余的non-ATP

20、ase(RPN 3、5-9、11和12)，是泛素依賴性蛋白降解所必須的(Fu等2001)。靶蛋白進入蛋白酶體需要底物傳送蛋白的輔助，這些蛋白含有UBL或UB*(ubiquitin-like protein)和UBA(ubiquitin-associated)構造域，包括Rad23(radiation gene 23)、Dsk2(dominant suppressorof Kar2)、Ddil(DNA damage molecule-1)和Shp1p47。Rad23、Dsk2和Ddil的UBL構造域能夠直接與26S蛋白酶體相互作用，然而Shplp47的UB*構造域能夠與Cdc48p97相互作用，

21、通過Cdc48p97與蛋白酶體聯系在一起。目前多數的泛素化底物通過與RPN1S2結合進入蛋白酶體。另外，泛素化的靶蛋白能夠直接與RPN10S5a和ATPase 5(RPT5)S6/S6a結合。RPT5S6 S6a ATPase也能夠與VHL E3s中的VHL結合，因此底物與蛋白酶體的結合有許多直接和間接的機制。這些不同的機制為多種蛋白在蛋白酶體中提供了選擇性降解過。綜上所述，RP輔助識別和伸展適當的底物，裂解與UB連接的共價鍵，開放-環，然后伸展開的多肽直接進入CP的腔被斷裂成6-10個氨基酸長度的片斷，最后在胞漿中被水解成單個氨基酸。七、結語泛素-蛋白酶體途徑是細胞ATP依賴的蛋白質選擇性降

22、解的主要途徑，是真核細胞重要的蛋白質質控系統，參與細胞凋亡、MHC I類抗原的遞呈、細胞周期以及細胞信號轉導等多種生理過程，對維持細胞的穩態具有十分重要的意義9。該途徑在20世紀80年代初期首先被Avram Hershko、Aaron Ciechanover和Irwin Rose等幾位科學家所認識，三人以此項成果共享2004年諾貝爾化學獎。經過30年的研究，人們對泛素-蛋白酶體途徑的組成和在生物體的功能有了深刻的認識，但是這遠遠還不夠，還有許多問題未被說明，如E3s的組成及是如何被調節的多聚泛素鏈是如何聚集的細胞是如何操作讓不同長度的泛素鏈修飾不同的蛋白質？26S蛋白酶體RP各個亞基的功能是什

23、么？泛素-蛋白酶體途徑功能失常已經發現與多種疾病有重要的關系，已有研究顯示針對失常的關鍵環節設計藥物或基因的靶標，對疾病的治療起到了良好的效果10。相信隨著技術手段的進步，泛素蛋白酶體途徑會逐漸被提醒，從而豐富人們對人體生理狀態的了解和對疾病的認識。參考文獻1 Smalle J，Vierstra RDThe ubiquitin 26S proteasome proteolytic pathwayAnnu Rev Plant Biol，2004，55 ：555 5902 Robinson PA，Ardley HCUbiquitinprotein ligasesJ CellSci，2004，117：519151943 Zheng N，Schulman BA，Song L，et a1Structure of theCullRb*lSkplF bo*Skp2 SCF ubiquitin ligase ple*Nature，2002，416：7037094 Passmore LA，Booth CR，VenienBrya