1、雙向電泳樣本制備 輝駿生物： 免費服務熱線：400-699-16631一、蛋白質提取原則：二、樣本裂解方式：三、2D蛋白裂解液組成及作用： 1：裂解液組成及作用 2：常見裂解液四、蛋白質提取步驟：五、蛋白質樣本制備實例： 1：動物組織樣本制備 2：植物組織樣本制備六、樣本制備試劑：雙向電泳樣品制備： 輝駿生物： 免費服務熱線：400-699-166321: 蛋白質制備主要目的： (1)：細胞，組織的破碎裂解 (2)：蛋白質溶解以及破壞蛋白質與蛋白質分子之間，蛋白質與 非蛋白質之間的共價與非共價相互作用2: 蛋白質制備主要遵循的原則： (1)：盡可能溶解全部蛋白質，打斷蛋白質之間的共價結合，使

2、蛋白質以分離的多肽形式存在。 (2)：避免蛋白質的修飾作用與蛋白質的降解作用。 (3)：避免脂類、核酸、鹽等物質的干擾作用。 (4): 去除高豐度蛋白對低分度蛋白的掩蓋作用。 (5): 防止樣品在聚焦時發生蛋白質的聚集和沉淀。 (6)：蛋白質樣品與第一向電泳的相容性。一、雙向電泳樣本制備原則 輝駿生物： 免費服務熱線：400-699-16633破碎的方法適用材料原理滲透裂解 血細胞組織培養細胞 將細胞懸浮在低滲透液中裂解細胞。凍融裂解 細菌細胞組織培養細胞 利用液氮將細胞迅速凍結后再融化。如果需要，可反復進行。去垢劑裂解 組織培養細胞 去污劑能溶解細胞的細胞膜從而破壞細胞。注：如果使用了諸如S

3、DS這樣的離子型去污劑，為了確保不干擾IEF，可將裂解的樣品在含有過量的非離子或兼性去污劑的溶液中稀釋或利用沉淀法, 除去SDS。酶裂解 植物組織細菌細胞真菌細胞 在等滲透液溶液中用酶處理細胞。如溶菌酶用于細菌細胞；纖維素酶和果膠酶用于植物細胞）。二、雙向電泳樣本裂解方式溫和裂解方式4破碎方法適用材料原理超聲波法：細胞懸浮液 通過超聲波發生器產生的超聲波剪切力將細胞破碎，但必須注意減少熱量的產生和泡沫的形成。高壓法： 帶細胞壁的微生物在高壓情況下通過小孔對細胞施加壓力產生的剪切力破碎細胞研磨法： 固體組織微生物利用研杵手工將它們破碎機械勻槳法： 固體組織 可用手動勻漿器或電動勻漿器能來破碎細胞

4、懸浮液或較柔軟的組織。滾珠粉碎法：細胞懸浮液微生物 旋轉玻璃球的摩擦作用能破壞細胞壁，并釋放細胞的內含物。二、雙向電泳樣本裂解方式劇烈裂解方式 輝駿生物： 免費服務熱線：400-699-16635 組成種類 作用 變性劑脲、硫脲、兩者的混合物 破壞氫鍵等次級鍵，使肽鏈鏈伸展，暴露疏水中心去垢劑 非離子去垢劑、兩性離子去垢劑、陰離子去垢劑破壞蛋白質分子間的疏水相互作用。 還原劑-巰基乙醇，二硫蘇糖醇（DTT）, TBP 斷裂蛋白質中的二硫鍵，以利于肽鏈的分離蛋白酶抑制劑PMSF,AEBSF,EDTA,多肽蛋白酶抑制劑，磷酸酶酶抑制劑抑制蛋白酶活性三、雙向電泳樣本制備裂解液組成及作用 輝駿生物：

5、免費服務熱線：400-699-166361、變性劑： (1) 作用：改變或破壞氫鍵等次級鍵的結構，使蛋白質的肽鏈伸展 開來，充分暴露疏水中心。 (2) 分類：脲，硫脲，或兩者的混合物可以增加蛋白質的溶解性，特 別是膜蛋白。必須避免將含有尿素的溶液加熱到30度以上， 因為這樣會使其水解為氰酸鹽，修飾蛋白質，改變蛋白質的 電荷。 三、雙向電泳樣本制備裂解液組成及作用 輝駿生物： 免費服務熱線：400-699-166372、去垢劑： (1) 作用：破壞蛋白質分子間的疏水相互作用。 (2) 種類： a: 非離子去垢劑：triton X-100, NP-40 b: 兩性離子去垢劑： CHAPS,CHAP

6、SO SB3-10(不溶于濃度高于5mol/L的脲中） ASB(具有比CHAPS更強的膜蛋白溶解力） c: 陰離子去垢劑：SDS（小于0.25%，同時確保其他去垢劑與SDS的比例至少為8：1） 三、雙向電泳樣本制備裂解液組成及作用 輝駿生物： 免費服務熱線：400-699-166383、還原劑： (1) 作用：斷裂蛋白質中的二硫鍵，以利于肽鏈的分離。 (2) 分類: -巰基乙醇，二硫蘇糖醇（DTT）,二硫赤蘚糖（DTE） a: 其中DTT帶有電荷，在等點聚焦時，常常會遷移到PH范圍 以外，從而使某些蛋白質的二硫鍵重新配對，使溶解度降低而重新沉淀下來。使用濃度范圍10100 mmol/L. b:

7、 采用非離子還原劑三丁基膦TBP可以大大增加蛋白質的溶解性，并利于蛋白從第一向轉移到第二向。但是TBP在水溶液中的不穩定性和不溶性，使其在第一向IEF中維持蛋白質還原狀態是相對無效的。因此在IEF時建議最好使用巰基還原劑。三、雙向電泳樣本制備裂解液組成及作用 輝駿生物： 免費服務熱線：400-699-16639種類作用PMSF不可逆地抑制絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶EDTA，EGTA 可逆的蛋白酶抑制劑（如亮抑蛋白酶肽，胃蛋白酶抑制劑）多肽蛋白酶抑制劑 逆的蛋白酶抑制劑（如亮抑蛋白酶肽，胃蛋白酶抑制劑）磷酸酶抑制劑抑制磷酸酶活性Benzamidine抑制絲氨酸蛋白酶。4、蛋白酶抑制劑的種類及作用：三

8、、雙向電泳樣本制備裂解液組成及作用 輝駿生物： 免費服務熱線：400-699-166310 1、 提取前準備： （1）: 提取總蛋白，亞細胞蛋白； （2）: 裂解細胞的方式選擇； （3）: 裂解液的選擇。 2、 加入裂解液，冰上放置一段時間。 3、 離心去沉淀，收集上清蛋白。 4、 用于二維電泳時，考慮是否有必要除去干擾物質，如核酸， 脂類，鹽等。三、雙向電泳樣本制備簡要實驗步驟 輝駿生物： 免費服務熱線：400-699-166311五、雙向電泳樣本制備實例動物樣本 （1）將組織切細后置于研缽中，迅速加入液氮進行研磨，直至組織變成粉末，均勻而沒有明顯顆粒即可。 （2）在研缽中加入800LB（使

9、用前加入1 PMSF），充分溶解（收集）粉末后轉移至1.5mLEP管中，4，12000r/min，離心20min，收集上清液。 （3）超聲處理，破碎核酸。每個EP管超聲3次，每次58下，然后進行離心，4，12000r/min，離心20min，收集上清液。 （4）將上清液分裝成3管，每管約250L，每管再加入1mL丙酮-20沉淀過夜。沉淀完的蛋白質于4，12000r/min，離心20min，倒去上清液后，平放于干凈的紙巾上自然干燥，即可得到處理后的蛋白質團塊，-80保存備用。 (5)在干燥后的蛋白質團塊中加入相應量的RB（具體加入量視蛋白團塊大小而定），用槍頭將蛋白質團塊戳小后反復吹打直至蛋白質

10、完全溶解。對于太過干燥的蛋白質團塊（呈透明狀），可用50L移液器調至10L刻度處，吸上一點RB封住槍頭，然后反復的將蛋白質團塊戳小，再用超聲儀處理，直至看不到明顯的蛋白質團塊為止。4，12000r/min，離心20min，吸出上清液，轉移至新的EP管中。 12五、雙向電泳樣本制備實例植物樣本 （1）植物樣本置于研缽中，迅速加入液氮進行研磨，直至組織變成粉末，均勻而沒有明顯顆粒即可，在研缽中加入一小勺PVPP（用于吸附植物組織破碎后釋放出的酚類物質），用藥勺將粉末轉移至50mL離心管中。 （2）在50mL離心管中加入8mL提取液混勻，再加入8mLTris飽和酚，充分振蕩后放置于冰上，每隔5min

11、振蕩一次，總共6次，45000r/min，離30min，此時溶液會分層，下層為水相，上層為酚相，吸出上層液體，轉移到15mL離心管中。 （3）加入與酚相同體積的提取液，充分振蕩后放置于冰上，每隔5min振蕩一次，總共6次，4，5000r/min，離心30min，吸出上層酚相，轉移至新的15mL離心管中。重復一次苯酚抽提。 （4）加入最后得到的酚的5倍體積的醋酸銨甲醇溶液對蛋白進行沉淀，充分振蕩后置于冰上保溫每隔5min振蕩一次，總共6次，于-20沉淀過夜。 （5）對沉淀過夜的蛋白質4，5000r/min，離心30min，倒掉上清液，加入5mL甲醇對蛋白進行洗滌，反復吹打均勻后，4，5000r/

12、min，離心30min。重復一次。13五、雙向電泳樣本制備實例：（6）加入4mL丙酮對蛋白進行洗滌，反復吹打均勻后，4，5000r/min，離心30min。重復一次操作。加入3mL丙酮，吹打均勻后將蛋白質平均分到3支1.5mLEP管中，4，12000r/min，離心20min。倒去上清液后，平放于干凈的紙巾上自然干燥，即可得到處理后的蛋白質團塊，-80保存備用。 (7)在干燥后的蛋白質團塊中加入相應量的RB（具體加入量視蛋白團塊大小而定），用槍頭將蛋白質團塊戳小后反復吹打直至蛋白質完全溶解。對于太過干燥的蛋白質團塊（呈透明狀），可用50L移液器調至10L刻度處，吸上一點RB封住槍頭，然后反復的將蛋白質團塊戳小，再用超聲儀處理，直至看不到明顯的蛋白質團塊為止。4，12000r/min，離心20min，吸出上清液，轉移至新的EP管中。 輝駿生物： 免費服務熱線：400-699-166314六、雙向電泳樣本制備試劑Alklysis buffer(LB)ReagentFinal concentrationTris20mMThiourea (FW 76.12)2MUrea (FW 60.06)7MCHAPs (FW 64.89)2%(W/V)Phenol extraction buff