1、1現(xiàn)代生物技術（生物工程）的概念現(xiàn)代生物技術（生物工程）的概念 建立在分子遺傳學、生物化學、微生物學以及化學工程、建立在分子遺傳學、生物化學、微生物學以及化學工程、計算技術等基礎上的現(xiàn)代生物技術，是計算技術等基礎上的現(xiàn)代生物技術，是20世紀后半葉蓬勃發(fā)世紀后半葉蓬勃發(fā)展起來的新技術領域，為人類保健、農(nóng)牧業(yè)、食品工業(yè)、環(huán)展起來的新技術領域，為人類保健、農(nóng)牧業(yè)、食品工業(yè)、環(huán)境保護等提供了強大的發(fā)展動力。境保護等提供了強大的發(fā)展動力。 現(xiàn)代生物技術的內(nèi)涵非常廣泛并不斷發(fā)展，目前主要有：現(xiàn)代生物技術的內(nèi)涵非常廣泛并不斷發(fā)展，目前主要有：基因工程基因工程 細胞工程細胞工程 蛋白質(zhì)工程蛋白質(zhì)工程 酶工程酶

2、工程 糖工程糖工程 環(huán)境生環(huán)境生物工程物工程 轉基因動物轉基因動物 克隆動物克隆動物 基因治療基因治療 生物制藥生物制藥 生物生物信息學信息學 高級生物傳感器高級生物傳感器 2一、重組DNA技術的建立 1972年美國斯坦福大學的年美國斯坦福大學的Berg獲得了獲得了SV40和和DNA重組重組的的DNA分子分子 1973年美國斯坦福大學的年美國斯坦福大學的Cohen 等人，將大腸桿菌等人，將大腸桿菌R6-5質(zhì)粒質(zhì)粒DNA（含卡那霉素抗性基因）和大腸桿菌（含卡那霉素抗性基因）和大腸桿菌pSC101質(zhì)粒質(zhì)粒DNA（含四環(huán)素素抗性基因）重組后轉化大腸桿菌，產(chǎn)生同（含四環(huán)素素抗性基因）重組后轉化大腸桿菌

3、，產(chǎn)生同時表現(xiàn)出兩種抗性的細菌。時表現(xiàn)出兩種抗性的細菌。 Cohen與與Boyer等合作，將非洲爪蟾編碼核糖體的基因等合作，將非洲爪蟾編碼核糖體的基因同同pSC101質(zhì)粒構成重組質(zhì)粒構成重組DNA分子，并導入大腸桿菌，證實分子，并導入大腸桿菌，證實動物基因進入了細菌細胞，并在細菌細胞中增殖和轉錄產(chǎn)生動物基因進入了細菌細胞，并在細菌細胞中增殖和轉錄產(chǎn)生相應的相應的mRNA。3 Berg P、Cohen和和Boyer等人的工作是世界上第一次實現(xiàn)等人的工作是世界上第一次實現(xiàn)DNA體外重組，建立了第一個基因克隆系統(tǒng)（質(zhì)粒體外重組，建立了第一個基因克隆系統(tǒng)（質(zhì)粒大腸桿菌），大腸桿菌），導致了一個全新的生

4、物技術學科和產(chǎn)業(yè)導致了一個全新的生物技術學科和產(chǎn)業(yè)基因工程的誕生。基因工程的誕生。 基因工程的誕生打破了物種的界限，實現(xiàn)了物種間的基因交基因工程的誕生打破了物種的界限，實現(xiàn)了物種間的基因交流，在實驗室里對生物直接進行改造，為生命科學的研究開辟流，在實驗室里對生物直接進行改造，為生命科學的研究開辟了新的領域、注入了新的方法，為提高人類的生活質(zhì)量和健康了新的領域、注入了新的方法，為提高人類的生活質(zhì)量和健康水平開辟了新的途徑，在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥等領域有巨大的應水平開辟了新的途徑，在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥等領域有巨大的應用前景用前景4 基因工程的概念基因工程的概念 基因工程是一種基因工程是一種DNA重組技術

5、重組技術,在分子水平上進在分子水平上進行遺傳操作，按設計的藍圖，從供體中提取或人工合成行遺傳操作，按設計的藍圖，從供體中提取或人工合成目的基因，令其與載體構建成重組目的基因，令其與載體構建成重組DNA，再轉移到受體，再轉移到受體細胞，目的基因在細胞中表達獲得新的遺傳性狀細胞，目的基因在細胞中表達獲得新的遺傳性狀 基因工程的操作程序：獲取目的基因基因工程的操作程序：獲取目的基因目的基目的基因與載體構建重組因與載體構建重組DNA分子分子重組重組DNA分子轉移至受分子轉移至受體細胞體細胞轉化細胞的擴增、鑒定和篩選轉化細胞的擴增、鑒定和篩選5一、限制性內(nèi)切酶一、限制性內(nèi)切酶 （一）分類與命名（一）分類

6、與命名 酶有幾千種，分為酶有幾千種，分為6大類：氧化還原酶、轉移酶、大類：氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂合酶、異構酶、連接酶。水解酶、裂合酶、異構酶、連接酶。 基因工程中常用作用于核酸的酶，包括水解酶、基因工程中常用作用于核酸的酶，包括水解酶、修飾酶、聚合酶等修飾酶、聚合酶等 水解酶分為內(nèi)切酶和外切酶水解酶分為內(nèi)切酶和外切酶 內(nèi)切酶在核酸鏈內(nèi)部切割，生成寡核苷酸；外切內(nèi)切酶在核酸鏈內(nèi)部切割，生成寡核苷酸；外切酶從核酸鏈的末端開始，漸進式地水解核酸鏈，逐漸酶從核酸鏈的末端開始，漸進式地水解核酸鏈，逐漸釋放單核苷酸。釋放單核苷酸。6l能識別雙鏈能識別雙鏈DNA分子中一段特異的核苷酸序列，分子中一段

7、特異的核苷酸序列，在這一段序列內(nèi)將雙鏈在這一段序列內(nèi)將雙鏈DNA分子切斷。分子切斷。l功能：降解外來功能：降解外來DNA分子，以限制分子，以限制(restriction )或阻止病毒侵染或阻止病毒侵染l是細菌細胞為防御異源遺傳物質(zhì)進入的一種有是細菌細胞為防御異源遺傳物質(zhì)進入的一種有效方式。效方式。7l第第類限制性酶：每隔一段類限制性酶：每隔一段DNA序列隨機切割雙鏈序列隨機切割雙鏈DNA分子，沒有序列特異性分子，沒有序列特異性l第第類限制性酶：能識別一段特異的類限制性酶：能識別一段特異的DNA序列，準確序列，準確地酶切雙鏈地酶切雙鏈DNA的特異序列的特異序列識別的序列是對稱的，即在一條鏈中從識

8、別的序列是對稱的，即在一條鏈中從5到到3方向方向的序列，與其互補鏈從的序列，與其互補鏈從5到到3方向的序列完全相同。方向的序列完全相同。這種從兩個方向閱讀而序列相同的序列稱為這種從兩個方向閱讀而序列相同的序列稱為回紋對回紋對稱序列稱序列(palindrome)（EcoR）另一類酶，如另一類酶，如Sma，它們酶切，它們酶切DNA雙鏈后，產(chǎn)生雙鏈后，產(chǎn)生的的DNA片段具有平齊末端片段具有平齊末端(blunt ends) 891011屬名種名菌株類型發(fā)現(xiàn)的順序?qū)倜N名菌株類型發(fā)現(xiàn)的順序12 重組重組DNADNA分子分子 匹配末端的連接匹配末端的連接 同一種酶切割不同同一種酶切割不同DNADNA分子產(chǎn)

9、生相同的突出末端；或不同酶切割不同分子產(chǎn)生相同的突出末端；或不同酶切割不同DNADNA分子產(chǎn)生相同的突出末端，可在連接酶作分子產(chǎn)生相同的突出末端，可在連接酶作用下連接為重組用下連接為重組DNADNA分子。分子。 平端連接平端連接 可直接連接，但效率較低。可直接連接，但效率較低。 不匹配黏端的連接不匹配黏端的連接 先補平先補平(Klenow(Klenow) )或或修平修平(S1)(S1)后再連接。后再連接。 繪制物理圖譜（限制性內(nèi)切酶圖譜）繪制物理圖譜（限制性內(nèi)切酶圖譜）13 二、二、DNADNA聚合酶聚合酶 （一）（一）DNADNA聚合酶的類型聚合酶的類型 依賴依賴DNA的的DNA聚合酶聚合酶

10、、DNA聚合酶聚合酶大片大片段（段（Klenow）、）、T4 DNA聚合酶、聚合酶、T7 DNA聚合酶、修飾的聚合酶、修飾的T7 DNA聚合酶、聚合酶、Taq DNA聚合酶。聚合酶。 不依賴不依賴DNA的的末端轉移酶末端轉移酶 依賴依賴RNA的的反轉錄酶反轉錄酶1415 三、三、DNADNA連接酶連接酶 該酶的用途是將帶匹配黏端的雙鏈該酶的用途是將帶匹配黏端的雙鏈DNA或平或平端雙鏈端雙鏈DNA片段的片段的5- P 與另一也帶相應缺口的與另一也帶相應缺口的DNA片段的片段的3 - OH 連接起來連接起來 四、甲基化酶、核酸酶等（從略四、甲基化酶、核酸酶等（從略）16 載體是指將外源載體是指將外

11、源DNA片段運送進宿主細胞進行擴增或表片段運送進宿主細胞進行擴增或表達的運載工具達的運載工具 克隆載體克隆載體克隆了外源克隆了外源DNA后，轉入宿主細胞中進行后，轉入宿主細胞中進行繁殖，使克隆的繁殖，使克隆的DNA片段數(shù)量大大增加片段數(shù)量大大增加 表達載體表達載體將外源基因或?qū)⑼庠椿蚧駾NA片段在宿主細胞中表達片段在宿主細胞中表達蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 插入型載體插入型載體將外源基因或?qū)⑼庠椿蚧駾NA插入其中插入其中 置換型載體置換型載體切除載體部分切除載體部分DNA，代之以外源基因或，代之以外源基因或DNA。17 能在宿主細胞中大量復制，得到大量的重組能在宿主細胞中大量復制，得到大量的重組DNA分

12、子分子 載體上的內(nèi)切酶位點對于一種酶來說只能有一載體上的內(nèi)切酶位點對于一種酶來說只能有一個（置換型載體上被置換片段的兩側各有一個個（置換型載體上被置換片段的兩側各有一個內(nèi)切酶位點）內(nèi)切酶位點） 克隆載體要有復制起點，表達載體要有啟動子克隆載體要有復制起點，表達載體要有啟動子 載體上要有報告基因或選擇標記基因載體上要有報告基因或選擇標記基因 在不影響載體復制和表達的在不影響載體復制和表達的DNA序列上有內(nèi)切序列上有內(nèi)切酶酶切位點酶酶切位點18 一、質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒載體 質(zhì)粒質(zhì)粒是一種存在于細菌細胞質(zhì)中，獨立于細是一種存在于細菌細胞質(zhì)中，獨立于細菌菌染色體而自然存在的，在細菌體內(nèi)染色體而自然存在的

13、，在細菌體內(nèi)能進行自我能進行自我復制、易分離和導入的復制、易分離和導入的DNA環(huán)環(huán)狀雙鏈狀雙鏈分子分子 質(zhì)粒大小相差很大（從小于質(zhì)粒大小相差很大（從小于1Kb到大于到大于500Kb），都有一個復制起點。），都有一個復制起點。 親緣關系密切的兩種質(zhì)粒不能在同一宿主細親緣關系密切的兩種質(zhì)粒不能在同一宿主細胞中穩(wěn)定地共存，稱為質(zhì)粒的不親和性。胞中穩(wěn)定地共存，稱為質(zhì)粒的不親和性。 只能在特定宿主細胞中復制的稱為窄宿主范只能在特定宿主細胞中復制的稱為窄宿主范圍質(zhì)粒；可以在多種宿主細胞中復制的稱為廣宿圍質(zhì)粒；可以在多種宿主細胞中復制的稱為廣宿主范圍質(zhì)粒。主范圍質(zhì)粒。19 嚴謹型質(zhì)粒嚴謹型質(zhì)粒每個細胞中有每

14、個細胞中有1-2個拷貝，具有個拷貝，具有自身傳遞能力，分子量大。自身傳遞能力，分子量大。 松弛型質(zhì)粒松弛型質(zhì)粒每個細胞中有每個細胞中有10-100個拷貝，個拷貝，不具有自身傳遞能力，分子量小。基因工程常用不具有自身傳遞能力，分子量小。基因工程常用此類質(zhì)粒。此類質(zhì)粒。 常用的質(zhì)粒有：常用的質(zhì)粒有：pBR322、Psc101、ColE1、Psc134等。等。 質(zhì)粒載體一般能克隆質(zhì)粒載體一般能克隆10Kb左右的左右的DNA片段。片段。20 利用利用PCRPCR克隆目的基因克隆目的基因 反向反向PCR（inverse PCR,I-PCR）克隆基因組）克隆基因組DNA片段片段 I-PCR是根據(jù)已知序列擴

15、增其旁側序列的方法。所用是根據(jù)已知序列擴增其旁側序列的方法。所用的引物與正常的的引物與正常的PCR引物方向相反引物方向相反 反轉錄反轉錄PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)合合成成cDNA RT-PCR是以是以mRNA為模板，在逆轉錄酶作用下合為模板，在逆轉錄酶作用下合成成cDNA，再復制成雙鏈，再復制成雙鏈DNA21 二、基因組文庫的構建與基因克隆二、基因組文庫的構建與基因克隆 基因組文庫的概念基因組文庫的概念 需要將某種生物全部基因組的遺傳信息，需要將某種生物全部基因組的遺傳信息，儲儲存在可存在可以長期保存的、穩(wěn)定的重組體中，以便需要時即可應用。以長期

16、保存的、穩(wěn)定的重組體中，以便需要時即可應用。這種保存基因組信息的材料，稱為基因文庫。這種保存基因組信息的材料，稱為基因文庫。 當需要某一目的基因時，就可在基因組文庫尋找，一當需要某一目的基因時，就可在基因組文庫尋找，一般采用核酸探針的方法，從文庫中般采用核酸探針的方法，從文庫中“釣出釣出”某基因。某基因。22 基因組文庫的構建基因組文庫的構建 1DNA片段的制備片段的制備 分離純化基因組分離純化基因組DNA 用限制酶完全酶切或部分酶切用限制酶完全酶切或部分酶切2DNA片段與載體的連接片段與載體的連接 選擇合適的載選擇合適的載體體 3體外包裝和基因組文庫的擴增體外包裝和基因組文庫的擴增 包裝入噬

17、包裝入噬菌體進行感染，或轉化使質(zhì)粒菌體進行感染，或轉化使質(zhì)粒DNA進入細胞進入細胞 4重組重組DNA的篩選和鑒定的篩選和鑒定 23 三、基因的人工合成三、基因的人工合成 如果已知某基因的核苷酸序列，或者通過基因產(chǎn)物的如果已知某基因的核苷酸序列，或者通過基因產(chǎn)物的氨基酸序列推導出基因的核苷酸序列，就可將單核苷酸或氨基酸序列推導出基因的核苷酸序列，就可將單核苷酸或寡核苷酸一個一個縮合起來，成為一個基因的核苷酸序列。寡核苷酸一個一個縮合起來，成為一個基因的核苷酸序列。連接的兩個分子各有一端被封閉。連接的兩個分子各有一端被封閉。 先合成分別屬于雙鏈序列的先合成分別屬于雙鏈序列的8-12堿基的片段，兩個

18、片堿基的片段，兩個片段的對應部分配對后留有粘性末端，第三個片段再連接上段的對應部分配對后留有粘性末端，第三個片段再連接上去，不斷延伸直至全部合成去，不斷延伸直至全部合成24 第五節(jié)第五節(jié) DNA體外重組和基因轉移體外重組和基因轉移 一、載體與基因的連接一、載體與基因的連接 常用的連接方式有：粘性末端連接法、平頭末端連接常用的連接方式有：粘性末端連接法、平頭末端連接法、人工接頭連接法、同聚物加尾連接法。法、人工接頭連接法、同聚物加尾連接法。 （一）粘性末端連接法（一）粘性末端連接法 相同限制酶切位點連接法相同限制酶切位點連接法同一的限制酶切割不同同一的限制酶切割不同DNA會產(chǎn)生相同的粘性末端，會

19、產(chǎn)生相同的粘性末端，在連接酶的作用下，不同在連接酶的作用下，不同DNA相同的粘性末端形成磷酸二相同的粘性末端形成磷酸二酯鍵而連接起來酯鍵而連接起來25 （二）（二） 外源基因向真核細胞轉入外源基因向真核細胞轉入 1 1借助于載體的基因轉移借助于載體的基因轉移 主要是以重組的動物病毒和逆轉錄病毒直接感染受體主要是以重組的動物病毒和逆轉錄病毒直接感染受體細胞，把外源細胞，把外源DNA引入引入 逆轉錄病毒的特點：逆轉錄病毒的特點： 病毒基因組為單鏈病毒基因組為單鏈RNA，感染期間為雙鏈，感染期間為雙鏈DNA DNA能整合進細胞并復制能整合進細胞并復制 DNA在動物通過生殖細胞傳遞到下一代；在動物通過

20、生殖細胞傳遞到下一代； 帶有對復制有重要意義的基因：帶有對復制有重要意義的基因：gag（結構蛋白）、（結構蛋白）、pol（DNA聚合酶）、聚合酶）、env（被膜糖蛋白）（被膜糖蛋白）26 2 2不需載體的基因轉移不需載體的基因轉移 磷酸鈣沉淀法磷酸鈣沉淀法 細胞具有攝取磷酸鈣沉淀的雙鏈細胞具有攝取磷酸鈣沉淀的雙鏈DNA的能力的能力 將待轉移的將待轉移的DNA加入氯化鈣和磷酸鹽，生成加入氯化鈣和磷酸鹽，生成DNA-磷磷酸鈣沉淀，加入培養(yǎng)液中酸鈣沉淀，加入培養(yǎng)液中 由于細胞的吞噬作用，由于細胞的吞噬作用，DNA-磷酸鈣沉淀物進入細胞，磷酸鈣沉淀物進入細胞，DNA釋出后先進入細胞質(zhì)、再進入細胞核，整

21、合到受體細釋出后先進入細胞質(zhì)、再進入細胞核，整合到受體細胞的染色體上胞的染色體上27 脂質(zhì)體介導法脂質(zhì)體介導法 脂質(zhì)體是磷脂在水中形成的一種由脂類雙分子層圍成的囊狀結構脂質(zhì)體是磷脂在水中形成的一種由脂類雙分子層圍成的囊狀結構 形成囊狀結構可將形成囊狀結構可將DNA包在其中包在其中 帶有外源帶有外源DNA的脂質(zhì)體通過細胞的內(nèi)吞作用進入受體細胞，的脂質(zhì)體通過細胞的內(nèi)吞作用進入受體細胞，達到基因轉移的目的達到基因轉移的目的 血影細胞介導法血影細胞介導法 血影細胞：哺乳動物細胞溶血，使血紅蛋白大量逸出，最后成血影細胞：哺乳動物細胞溶血，使血紅蛋白大量逸出，最后成為僅有被細胞膜包被的細胞核結構為僅有被細

22、胞膜包被的細胞核結構 血紅蛋白大量逸出時，外源血紅蛋白大量逸出時，外源DNA也容易進入。讓血影細胞與受也容易進入。讓血影細胞與受體細胞在適當條件下發(fā)生細胞融合，從而使外源體細胞在適當條件下發(fā)生細胞融合，從而使外源DNA導入受體導入受體細胞細胞 電轉移法電轉移法 受體細胞與外源受體細胞與外源DNA按一定比例混合后，放入電脈沖槽中，按一定比例混合后，放入電脈沖槽中，經(jīng)用脈沖電壓刺激，外源經(jīng)用脈沖電壓刺激，外源DNA即可進入細胞（或受精卵）即可進入細胞（或受精卵）28 第六節(jié)第六節(jié) 重組體的鑒定與篩選重組體的鑒定與篩選一、遺傳檢測法一、遺傳檢測法 （一）抗體篩選法（一）抗體篩選法 利用載體上的抗性基

23、因?qū)﹃栃钥寺∽鞒醪降暮Y選。如利用載體上的抗性基因?qū)﹃栃钥寺∽鞒醪降暮Y選。如pUC19質(zhì)粒中有質(zhì)粒中有Ampr 基因，為宿主細胞提供氨芐青霉素抗性。基因，為宿主細胞提供氨芐青霉素抗性。 將轉化后的細胞涂布在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)將轉化后的細胞涂布在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 大部分受體細胞沒有外源大部分受體細胞沒有外源DNA導入，其本身又沒有導入，其本身又沒有Ampr 基因，所以在培養(yǎng)基中不能生長。基因，所以在培養(yǎng)基中不能生長。 在含有外源在含有外源DNA的受體細胞中，只有含有質(zhì)粒自連或者質(zhì)的受體細胞中，只有含有質(zhì)粒自連或者質(zhì)粒與目的粒與目的DNA形成重組子的受體細胞由于含形成重組子的受體細

24、胞由于含Ampr 基因，能在基因，能在培養(yǎng)基中生長。培養(yǎng)基中生長。 29 （二）插入失活選擇法（二）插入失活選擇法 當外源當外源DNA插入到載體的某一基因中間時，該基因就插入到載體的某一基因中間時，該基因就不能表達，這種現(xiàn)象稱為插入失活。不能表達，這種現(xiàn)象稱為插入失活。 例如，例如，pBR322有四環(huán)素抗性基因有四環(huán)素抗性基因（Tetr）和氨芐青霉素）和氨芐青霉素抗性基因抗性基因（Ampr），在），在Tetr基因內(nèi)基因內(nèi)有有BamH和和Sal兩種兩種限制酶位點，如果在這兩個位點中有外源限制酶位點，如果在這兩個位點中有外源DNA插入，都會插入，都會導致導致Tetr基因失活。基因失活。 將轉化后的

25、細胞分別培養(yǎng)在含氨芐青霉素和四環(huán)素的培將轉化后的細胞分別培養(yǎng)在含氨芐青霉素和四環(huán)素的培養(yǎng)基中，便可檢出轉化子細胞養(yǎng)基中，便可檢出轉化子細胞。3031 三、核酸分子鑒定法三、核酸分子鑒定法 Southern blot(Southern印跡試驗印跡試驗) 原理原理利用硝酸纖維薄膜（或濾紙、尼龍膜）具有利用硝酸纖維薄膜（或濾紙、尼龍膜）具有吸附吸附DNA的功能，先作的功能，先作DNA凝膠電泳，并將凝膠電泳的凝膠電泳，并將凝膠電泳的DNA區(qū)帶吸附到膜上，然后在膜上進行同位素標記探針與區(qū)帶吸附到膜上，然后在膜上進行同位素標記探針與被測樣品只間的雜交，在通過放射自顯影對雜交結果進行被測樣品只間的雜交，在通

26、過放射自顯影對雜交結果進行檢測。檢測。32 四、序列分析法四、序列分析法 測序分手工測序和自動測序。測序分手工測序和自動測序。 手工測序有雙脫氧測序法和化學測序法，前者手工測序有雙脫氧測序法和化學測序法，前者廣泛使用。廣泛使用。 自動測序可用全自動化的自動測序可用全自動化的DNA序列測序儀準序列測序儀準確快速測定確快速測定DNA序列。序列。33 DNA DNA自動測序自動測序 DNA自動測序儀根據(jù)自動測序儀根據(jù)Sanger的酶促反應原理，用的酶促反應原理，用4種熒光染料標記引物，這種熒光染料標記引物，這4種熒光在受到激光照射時會發(fā)種熒光在受到激光照射時會發(fā)出可以辯別的不同顏色。出可以辯別的不同

27、顏色。34l獲取外源目的基因獲取外源目的基因l外源目的基因?qū)肷臣毎蚺咛ジ杉毎庠茨康幕驅(qū)肷臣毎蚺咛ジ杉毎鹟選擇攜帶目的基因的細胞，選擇體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動選擇攜帶目的基因的細胞，選擇體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動物物l轉基因胚胎的發(fā)育及鑒定轉基因胚胎的發(fā)育及鑒定l篩選所得的轉基因動物篩選所得的轉基因動物35l經(jīng)典的技術路線經(jīng)典的技術路線 目的基因目的基因 顯微注射 已交配的已交配的 取出 移植 受體動物受體動物 妊娠供體動物供體動物 受精卵受精卵 輸卵管輸卵管 轉基因動物轉基因動物 缺點：注入目的基因的命中率低，目的基因的整合率低，缺點：注入目的基因的命中率低，目的基因的整合率低，受精卵移

28、植的受孕率低受精卵移植的受孕率低。36l 整合胚胎移植的技術路線整合胚胎移植的技術路線 轉基因動物轉基因動物 受體動物子宮受體動物子宮 目的基因目的基因 非手術 胚胎移植 體外受精 體外培養(yǎng) 多細胞胚胎多細胞胚胎 檢測 整合外源基因整合外源基因卵子卵子 受精卵受精卵 或囊胚或囊胚 的胚胎的胚胎精子精子優(yōu)點：受精卵的成活率高達90以上，外源基因整合率高，提高受孕率。37l核移植（克隆）的技術路線核移植（克隆）的技術路線 目的基因目的基因 轉基因動物轉基因動物 導入 動物胎兒成纖維細胞動物胎兒成纖維細胞 妊娠 取核 動物動物 去核 重組的重組的 體外培養(yǎng) 囊胚期囊胚期 胚胎移植 卵細胞卵細胞 受精

29、卵受精卵 胚胎胚胎 受體動物子宮受體動物子宮 l特點：體細胞核移植；核移植前導入目的基因。38l整合卵受精的技術路線整合卵受精的技術路線： 目的基因目的基因 轉基因動物轉基因動物 導入 逆轉錄病毒逆轉錄病毒 妊娠 精子精子 感染 體外受精 胚胎移植 卵母細胞卵母細胞 成熟卵細胞成熟卵細胞 囊胚囊胚 受體動物子宮受體動物子宮 特點：卵母細胞導入目的基因后再與精子受精特點：卵母細胞導入目的基因后再與精子受精。39l 目的基因的制備目的基因的制備目的基因的獲得目的基因的獲得 逆轉錄合成法逆轉錄合成法 化學合成法化學合成法 PCR擴增法擴增法目的基因的擴增目的基因的擴增 通過載體在宿主中克隆通過載體在

30、宿主中克隆 通過通過PCR擴增目的基因擴增目的基因l 轉基因動物的方法轉基因動物的方法 顯微注射法顯微注射法 生殖細胞載體法生殖細胞載體法 胚胎干細胞法胚胎干細胞法 病毒載體法病毒載體法 4041424344l改良動物經(jīng)濟性狀的嘗試改良動物經(jīng)濟性狀的嘗試試圖通過轉移單個基因改良動物經(jīng)濟性狀的研究，至今仍試圖通過轉移單個基因改良動物經(jīng)濟性狀的研究，至今仍未見成功的報道，尚需對性狀表現(xiàn)的生化代謝途徑，有關未見成功的報道，尚需對性狀表現(xiàn)的生化代謝途徑，有關基因的相互作用以及基因定位整合，基因定量表達、組織基因的相互作用以及基因定位整合，基因定量表達、組織特異性表達等進行深入的研究。特異性表達等進行深

31、入的研究。l乳腺生物反應器的研究乳腺生物反應器的研究1987年，年，Gordon首次報道小鼠乳腺中表達首次報道小鼠乳腺中表達tPA蛋白。至今蛋白。至今國際上轉基因羊、轉基因牛等的成功報道實例已有國際上轉基因羊、轉基因牛等的成功報道實例已有10多種，多種，生產(chǎn)出抗胰蛋白酶、乳鐵蛋白、人凝血蛋白因子生產(chǎn)出抗胰蛋白酶、乳鐵蛋白、人凝血蛋白因子、蛋白、蛋白質(zhì)質(zhì)C等藥用蛋白。國外經(jīng)濟學家預期，等藥用蛋白。國外經(jīng)濟學家預期，10年后，轉基因動年后，轉基因動物生產(chǎn)的藥物銷售額超過物生產(chǎn)的藥物銷售額超過250億美元。億美元。45l基因藥物生產(chǎn)第一階段是細菌基因工程，第二階段是動物細基因藥物生產(chǎn)第一階段是細菌基

32、因工程，第二階段是動物細胞基因工程，第三階段是轉基因動物胞基因工程，第三階段是轉基因動物乳腺生物反應器。具乳腺生物反應器。具有以下特點：有以下特點：乳腺是自我封閉系統(tǒng)，乳腺表達的蛋白質(zhì)不回流到血液循乳腺是自我封閉系統(tǒng)，乳腺表達的蛋白質(zhì)不回流到血液循環(huán)系統(tǒng)，避免外源基因表達的蛋白質(zhì)對動物本身的影響；環(huán)系統(tǒng)，避免外源基因表達的蛋白質(zhì)對動物本身的影響；乳腺組織是一種有效的蛋白質(zhì)合成器。一頭奶牛一年可生乳腺組織是一種有效的蛋白質(zhì)合成器。一頭奶牛一年可生產(chǎn)乳蛋白產(chǎn)乳蛋白250300Kg，一只綿羊或山羊一年可生產(chǎn)乳蛋白，一只綿羊或山羊一年可生產(chǎn)乳蛋白2530Kg。如果有百分之一的乳蛋白代換成醫(yī)用蛋白，產(chǎn)量

33、。如果有百分之一的乳蛋白代換成醫(yī)用蛋白，產(chǎn)量十分可觀。十分可觀。乳腺分泌的基因產(chǎn)物不但產(chǎn)量高，而且易提純。表達的蛋乳腺分泌的基因產(chǎn)物不但產(chǎn)量高，而且易提純。表達的蛋白經(jīng)過充分的修飾加工，具有穩(wěn)定的生物活性。生物活性接白經(jīng)過充分的修飾加工，具有穩(wěn)定的生物活性。生物活性接近天然產(chǎn)品。近天然產(chǎn)品。在動物乳腺表達的外源基因可以遺傳，可用常規(guī)技術繁殖在動物乳腺表達的外源基因可以遺傳，可用常規(guī)技術繁殖生產(chǎn)群體。生產(chǎn)群體。46l 轉基因動物的低效性轉基因動物的低效性l 轉入基因引起完整基因突變轉入基因引起完整基因突變l 轉入基因表達混亂轉入基因表達混亂l 病毒轉基因?qū)λ拗鞯挠绊懖《巨D基因?qū)λ拗鞯挠绊憀 轉基

34、因動物模型與預期不符轉基因動物模型與預期不符l 乳腺反應器的完善乳腺反應器的完善l 轉基因動物及產(chǎn)品的認可轉基因動物及產(chǎn)品的認可47l人類遺傳疾病有人類遺傳疾病有5000多種，基本上不可能用常規(guī)的方法治多種，基本上不可能用常規(guī)的方法治療。個別病例只能對癥療法，減輕癥狀，但不能治愈。基療。個別病例只能對癥療法，減輕癥狀，但不能治愈。基因治療可能是唯一的方法。因治療可能是唯一的方法。l基因治療（基因治療（gene therapy）是向靶細胞導入外源基因，以糾）是向靶細胞導入外源基因，以糾正或補償基因的缺陷，達到治療遺傳病的目的。正或補償基因的缺陷，達到治療遺傳病的目的。l1990年，美國國家衛(wèi)生院（年，美國國家衛(wèi)生院（NIH）重組）重組DNA咨詢委員會咨詢委員會（RAC）批準治療腺苷脫氨酶（）批準治療腺苷脫氨酶（ADA）的臨床治療方案，）的臨床治療方案，2個病例癥狀有改善。個病例癥狀有改善。l1991年上海復旦大學與第二軍醫(yī)大學合作用基因療法治療年上海復旦大學與第二軍醫(yī)大學合作用基因療法治療血友病血友病B的臨床試驗，患者癥狀有所改善的臨床試驗，患者癥狀有所改善48 1. 基因調(diào)控治療 從基因水平調(diào)控缺陷基因的表