1、第九講 新的酶抑制劑篩選研究策略胡海峰主要內(nèi)容酶的特性一些重要類別酶抑制劑的研究進(jìn)展1 具有抗艾滋病作用的酶抑制劑2 具有抗腫瘤作用的酶抑制劑3 具有調(diào)節(jié)血脂、降血壓作用的酶抑制劑酶抑制劑的篩選策略I 酶的特性酶由生物細(xì)胞產(chǎn)生的、具有催化化學(xué)反響功能的生物催化劑；生物催化劑：蛋白質(zhì)組成的生物催化劑酶和核糖核酸組成生物催化劑核酶；已經(jīng)發(fā)現(xiàn)核鑒定的酶有2000多種，其中200種酶獲得結(jié)晶，命名方法是在底物名稱后加ase；酶的六大類別：氧化復(fù)原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶、連接酶等。酶的高效催化特性、高度專一特性、可調(diào)控特性及失活變性等限速酶酶的活性較低，催化限速反響的酶，又稱關(guān)鍵酶；特點(diǎn)：催

2、化的反響速度慢、反響一般不可逆、一般處于起始部位或分叉點(diǎn)和可以是一個(gè)或多個(gè)；限速酶的抑制劑效果最理想。酶抑制劑Enzyme inhibitors)能夠抑制酶活性的化合物被稱為酶抑制劑，主要被應(yīng)用于酶活性的調(diào)節(jié)；酶活性的調(diào)節(jié)是一切生物都存在的最原始、最根本的調(diào)節(jié)方式；細(xì)胞水平調(diào)節(jié)酶活性主要改變酶原有活性和酶量；酶活力的調(diào)控方式多種多樣，如抑制作用、誘導(dǎo)作用、酶原激活、共價(jià)修飾、激素調(diào)控等。別構(gòu)調(diào)節(jié)、 用的調(diào)節(jié)是一切生物都存在的最原始，最根本的調(diào)節(jié)方式別構(gòu)調(diào)節(jié)、 別構(gòu)調(diào)節(jié)、 別構(gòu)調(diào)節(jié)、 別構(gòu)調(diào)節(jié)、 別構(gòu)調(diào)節(jié)、 Binding of an enzyme to its substrate and in

3、hibitor Alway possible Not possible with uncompetitive inhibitors Not possible with competitive inhibitors Not possible with competitive or uncompetitive inhibitors Inhibited enzymeInhibitorProduct #ReninPepstatin AP5318Renin, humanD-His-Pro-Phe-His-Leu-y-(CH2NH)-Leu-Val-TyrH6137Reverse Transcriptas

4、e, AMVNalidixic acidN8878Rho-Associated protein kinaseY-27632 dihydrochloride 99 % (HPLC) solidY0503Rho-KinaseHydroxyfasudil solid 98 % (HPLC)H4413Rho-KinaseY-27632 dihydrochloride 99 % (HPLC) solidY0503Ribonuclease ADiethyl pyrocarbonateD5758Ribonuclease ARibonuclease Inhibitor from human placentaR

5、4380Ribonuclease ARibonuclease Inhibitor from human placentaR7253APP-SecretaseAsn670, Sta671, Val672-Amyloid b/A4 Precursor Protein 770 Fragment 662-675 trifluoroacetate saltA1847-SecretaseGlu-Val-Asn-(2R,4S,5S)-5-amino-4-hydroxy-2,7-dimethyloctanoyl-Ala-Glu-Phe trifluoroacetate saltG8291-Secretaseb

6、-Secretase InhibitorS4562 Secretase(2R,4R,5S)-2-Benzyl-5-(Boc-amino)-4-hydroxy-6-phenylhexanoyl-Leu-Phe-NH2 trifluoroacetate saltB5306 Secretaseg-Secretase InhibitorS2188Spermidine synthaseCysteamine hydrochlorideM6500Spermine synthaseCysteamine hydrochlorideM6500Sphingomyelinase (neutral)GW4869 sol

7、id 91 % (HPLC)D1692Sphingosine acyltransferaseFumonisin B2 from Fusarium moniliformeF3771Sphingosine N-acyltransteraseFumonisin B1 from Fusarium moniliformeF1147Squalene epoxidaseNB-598 solid 97 %N4536Squalene SynthaseYM-53601 solid 98 % (HPLC)Y0128Src KinaseSU 6656 99 % (HPLC) powderS別構(gòu)調(diào)節(jié)、 別構(gòu)調(diào)節(jié)、 II

8、 一些主要類別酶抑制劑的研究I 作為抗生素II作為生理疾病治療藥物III作為生化研究試劑艾滋病與酶抑制劑治療艾滋病的藥物主要有三類，包括進(jìn)入抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑。到2004年9月，共有26種藥物和配方被美國FDA批準(zhǔn)用于艾滋病感染者的臨床治療。雖然這些藥物尚不能徹底治愈艾滋病，但它們對(duì)抑制人體內(nèi)的艾滋病病毒、延長患者的生命有很好的療效。進(jìn)入抑制劑和整合酶抑制劑是目前國際上抗艾新藥物研究最前沿和最熱門的方向。美國FDA已經(jīng)于2003年批準(zhǔn)了世界上第一個(gè)HIV進(jìn)入抑制劑T20，同時(shí)國際上處于臨床II期試驗(yàn)的HIV進(jìn)入抑制劑高達(dá)6種，預(yù)期將分別在2007、2021和2021年獲準(zhǔn)用于

9、臨床治療。只有美國和日本藥業(yè)公司開發(fā)的兩種化學(xué)物質(zhì)作為整合酶抑制劑進(jìn)入臨床I期研究。HIV與酶自身能產(chǎn)生三種酶逆轉(zhuǎn)錄酶、蛋白酶和整合酶，以幫助突破人體內(nèi)的免疫防線，復(fù)制、感染、生存下來，并破壞人體的免疫功能。 現(xiàn)有治療艾滋病的藥物，主要都是針對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶的抑制劑，由于這些藥品的長期使用，近年檢測(cè)到的抗藥性越來越多。因此，各國科學(xué)家目前都試圖研制整合酶的抑制劑。 美國默克藥物公司的研究人員近日研制出一種新型整合酶抑制劑，并且在猴子實(shí)驗(yàn)中取得了明顯效果。1. ATTACHMENT Getting in2. REVERSE TRANSCRIPTION From viral RNA to DNA

10、3. INTEGRATION, TRANSCRIPTION a. Viral DNA joins host DNAb. Making multiple viral RNAs4. TRANSLATION Producing viral proteins5. VIRAL PROTEASE Cleaving viral proteins6. ASSEMBLY & BUDDING Getting out Human Immunodeficiency Virus (HIV) HIV 蛋白酶HIV 蛋白酶抑制劑HIV 整合酶抑制劑HIV 整合酶是逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制的必需酶，它催化病毒DNA 與宿主染色體DNA

11、 的整合，而且在人類細(xì)胞中沒有類似物，因此成為治療艾滋病的富有吸引力和合理的靶標(biāo)。最近十年，一大批HIV 整合酶抑制劑被鑒定出來，其中一些化合物顯示選擇性的抑制HIV 整合酶和阻斷病毒復(fù)制的活性，而最有影響的兩類抑制劑是含鄰苯二酚的多羥基芳環(huán)化合物和最近報(bào)道的芳基二酮酸類化合物。HIV1整合酶的功能區(qū)內(nèi)酰胺酶抑制劑作為抗耐藥菌的有效輔助藥物抗腫瘤與酶抑制劑研究抗腫瘤藥物的作用機(jī)制包括：1 癌基因和抑癌基因。2 生長因子及其受體。3 蛋白激酶及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。4 Ras基因及法尼基蛋白轉(zhuǎn)移酶。5 端粒及端粒酶。6 DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶和微管蛋白。法尼基蛋白轉(zhuǎn)移酶(FTase)及其抑制劑(FTI)Ras

12、癌基因點(diǎn)突變經(jīng)常發(fā)生在許多人體實(shí)體腫瘤中，如30%-40%的甲狀腺癌、超過50%的結(jié)腸癌和超過90%的胰腺癌，這說明了Ras在細(xì)胞信號(hào)傳遞和人體腫瘤發(fā)病過程中的重要性。胞漿中的Ras蛋白沒有轉(zhuǎn)化細(xì)胞的活性,需最終定位在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)面，才能被活化。這一過程需要FTase對(duì)Ras蛋白進(jìn)行修飾，即切掉Ras蛋白尾端的4個(gè)氨基酸組成的CAAX結(jié)構(gòu)，加上15個(gè)氨基酸組成的法尼基基團(tuán)。由此人們想到抑制FTase，就可抑制Ras蛋白的活化，從而抑制腫瘤的生長。目前臨床上已出現(xiàn)了一些FTI。FTI可作為放射增敏劑、血管生成抑制劑，并與其他抗癌藥物有協(xié)同作用。低毒副作用是FTI的一大優(yōu)點(diǎn)。FTI的篩選方法無細(xì)胞水

13、平的篩選即直接用純化的法呢基轉(zhuǎn)移酶FTase酶在人工反響體系中測(cè)定化合物對(duì)FTase活性的抑制作用。FTase一般從牛或大鼠的腦組織中提取，報(bào)道的純化方法雖然各不相同，但大體上按下面的程序進(jìn)行:組織搗碎破細(xì)胞別離胞漿30%50%硫酸銨分級(jí)沉淀DEAE離子交換層析親和層析(以ras蛋白末端的六肽作為配基)，在親和層析之前或之后還可進(jìn)行凝膠過濾，總純化倍數(shù)可達(dá)2000倍以上。 拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase, topo)是參與DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)調(diào)整和轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、修復(fù)的重要工具酶，由活性Tyr殘基向DNA發(fā)動(dòng)親核攻擊，導(dǎo)致DNA單股或雙股斷裂。Topo蛋白的含量、活性、功能改變是

14、卵巢癌耐藥發(fā)生的重要機(jī)制之一，作用相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路的上游。Topo、抑制劑如TPT、VP-16等在復(fù)發(fā)卵巢癌的有效率大致為13%25%，現(xiàn)已成為二線用藥的首選。鹽酸拓?fù)涮婵担瑸橥負(fù)洚悩?gòu)酶I的抑制劑，可與拓?fù)洚悩?gòu)酶I-DNA復(fù)合物結(jié)合并阻止這些單股斷鏈的重新連接，其細(xì)胞毒作用是在DNA的合成中，是S期細(xì)胞周期特異性藥物。基質(zhì)金屬蛋白酶基質(zhì)金屬蛋白酶是一組重要的細(xì)胞外基質(zhì)降解酶，它通過對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)中不同成份的降解，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用。基質(zhì)金屬蛋白酶是一個(gè)大家族，目前已別離鑒別出20個(gè)成員，編號(hào)分別為MMP120。它們是一組鋅離子依賴性肽鏈內(nèi)切酶，大小各異，底物不盡相同，能裂解維系蛋白結(jié)構(gòu)

15、的肽鏈，主要參與結(jié)締組織的降解。各種MMP間具有一定的底物特異性，但不是絕對(duì)的。同一種MMP可降解多種細(xì)胞外基質(zhì)成份，而某一種細(xì)胞外基質(zhì)成分又可被多種MMP降解，但不同酶的降解效率可不同。 MMP-2MMP-2與人類腫瘤的侵襲有關(guān)，活化的MMP-2定位于細(xì)胞穿透基質(zhì)的突出部位，估計(jì)其有“鉆頭的作用。通過轉(zhuǎn)染MMP-2的激活因子-膜結(jié)合型MMPs，能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞穿過基底膜基質(zhì)的功能。MMP-2與腫瘤的血管侵襲密切相關(guān)，認(rèn)為MMP-2前體的激活是胃癌細(xì)胞擴(kuò)散的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 MMP抑制劑MMP在惡性組織中明顯的正調(diào)節(jié)作用和降解所有細(xì)胞外基質(zhì)組分的能力，被認(rèn)為是有苗頭的癌治療靶的。現(xiàn)在有5個(gè)MMP抑制劑

16、在開發(fā)的后期階段。它們是marimastat、prinomastat、BMS-275291、AE 941-neovastat和COL 3metastat。這類抑制劑有可能成為廣譜抗腫瘤治療劑，已有3種化合物進(jìn)入臨床試驗(yàn)。其中之一是Bryostatins，它是一種天然產(chǎn)物，為大環(huán)內(nèi)酯化合物，由海洋生物苔蘚蟲別離獲得。人工合成的化合物為仿膠原蛋白含羥胺結(jié)構(gòu)的小分子化合物，已進(jìn)入臨床試驗(yàn)的有BB-94和BB-2516，前者水溶性較差，后者水溶性良好，可供口服使用。端粒及端粒酶抑制劑 端粒酶在絕大多數(shù)惡性腫瘤中特異性表達(dá)，抗腫瘤藥物篩選以端粒酶為靶點(diǎn)，通過抑制癌細(xì)胞端粒酶活性或直接抑制端粒延長、穩(wěn)定，

17、而使細(xì)胞無法連續(xù)增殖，繼而進(jìn)入衰老途徑，直至死亡。同時(shí)端粒、端粒酶在腫瘤細(xì)胞與正常體組織之間的差異又可以減少端粒、端粒酶抑制劑對(duì)機(jī)體的毒副作用。端粒酶是一種核糖核酸蛋白質(zhì)復(fù)合物。其RNA組分為端粒合成提供模板。端粒酶中的蛋白質(zhì)那么起催化反響合成的作用。目前別離的人端粒酶蛋白質(zhì)有兩種，TPl含2627個(gè)氨基酸，可能介導(dǎo)端粒酶與端粒之間的相互作用；另一種是hEST2p，它可能是人端粒酶的催化亞基，對(duì)端粒酶活性的表達(dá)、調(diào)節(jié)具有重要意義。 端粒酶抑制劑針對(duì)端粒酶的逆轉(zhuǎn)錄酶性質(zhì)抑制端粒酶活性端粒酶實(shí)際上是一種特殊的專一逆轉(zhuǎn)錄酶，篩選其抑制劑如：AZT，ddG這些逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑針對(duì)端粒酶促反響底物抑制端粒

18、酶活性端粒酶作為一種末端轉(zhuǎn)移酶，它把脫氧核苷酸加到端粒的末端上從而延長端粒，說明7-脫氮-dGTP和7-脫氮-dATP會(huì)抑制端粒酶活性針對(duì)端粒酶的DNA錨著區(qū)抑制端粒酶活性端粒酶以錨著區(qū)與作為引物的端粒DNA的5端結(jié)合，繼而延伸端粒。通過破壞端粒酶的DNA錨著區(qū)可抑制端粒酶進(jìn)行端粒合成，使腫瘤細(xì)胞端粒縮短而死亡。酪氨酸激酶抑制劑采用基因芯片技術(shù)分析3種胰腺癌細(xì)胞系的潛在化療靶點(diǎn)，共篩選847種基因，涵蓋細(xì)胞因子信號(hào)、信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄各個(gè)環(huán)節(jié)，其中酪氨酸激酶是3種細(xì)胞的共同增殖靶點(diǎn)。3種胰腺癌細(xì)胞系共同表達(dá)18種基因，其中6種參與酪氨酸磷酸化信號(hào)傳導(dǎo)通路，其中表達(dá)最高的為酪氨酸激酶EphB3受體基

19、因。Farivar博士等認(rèn)為，酪氨酸激酶抑制劑是新型的胰腺癌化療靶點(diǎn)，基于除莠霉素和金雀異黃素的激酶抑制劑可望用于胰腺癌的化療。具有調(diào)節(jié)血脂、降血壓作用酶抑制劑膽固醇合成及吸收抑制劑ACE抑制劑膽固醇合成抑制劑高脂血癥是一種常見的心血管疾病，系人體脂質(zhì)代謝失調(diào)所致，其與許多疾病尤其是動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病有關(guān)。血清中膽固醇水平過高是引起動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病的主要原因。人體膽固醇來源于食物和體內(nèi)生化合成，后者占全部膽固醇來源的7080，而其中50以上在肝臟合成。因此抑制體內(nèi)過多的膽固醇合成是防治心血管病的一種有效途徑。膽固醇合成從乙酰輔酶A開始，大約經(jīng)過20多個(gè)步驟最終合成膽固醇。膽固醇合成和吸收

20、抑制劑HMG-CoA復(fù)原酶抑制劑在膽固醇合成途徑中，已經(jīng)查明羥甲基戊二酰輔酶AHMG-CoA復(fù)原酶是控制合成速度的關(guān)鍵酶。因此抑制該酶的活性，就能有效地減少或阻斷體內(nèi)膽固醇的合成，而到達(dá)防治高血脂病的目的。針對(duì)HMG-CoA復(fù)原酶而設(shè)計(jì)的定向篩選方法，從真菌中獲得了一系列HMG-CoA復(fù)原酶抑制劑如Lovastatin、Compactin等。 HMG-CoA HMG-CoA復(fù)原酶抑制劑酸型通式名稱產(chǎn)生菌發(fā)現(xiàn)年份ML-236B,A,CPenicillum citrinum1976compactinaPenicillum brevicompactum1976monacolin KbMonascus

21、 ruber1979mevinolinAspergillus terreus1980dihydrocompactinPenicillum citrinum1981dihydromevinolinAspergillus terreus1981monacolin JMonascus ruber1985monacolin LMonascus ruber1985dihydromonacolin LMonascus ruber1985monacolin XMonascus ruber1985monacolin MMonascus ruber1986a：又稱ML-236B；b：又稱Mevinolin，即洛

22、伐他汀。HMG-CoA復(fù)原酶抑制劑其他非關(guān)鍵酶抑制劑 乙酰輔酶A硫解酶有特異的抑制作用：L-660631 HMG-CoA合成酶抑制劑 ：1233A鯊烯合成酶為抑制劑：squalestatin和zaragozic acid的類似化合物群 脂酰輔酶A : 膽固醇脂酰轉(zhuǎn)移酶ACAT是催化膽固醇3位羥基，由長鏈脂酰CoA將脂酰基導(dǎo)入后，生成膽固醇酯的酶；從20世紀(jì)80年代后期，開始從微生物代謝產(chǎn)物中篩選ACAT抑制劑，其研究主要集中在日本，產(chǎn)生菌有青霉、煙曲霉、粘帚霉、鐮孢霉等，以pyripyropenes的活性最強(qiáng) 。名稱產(chǎn)生菌發(fā)現(xiàn)年份purpactins A，B，CPenicillium purp

23、urogenum1991glisoprenins A，BGliocladium sp.1992beauvericinFusarium sp.1992acaterinPseudomonas sp.1992helminthosporolPseudomonas sp.1993AS-183Scedosporium sp.1993pyripyropenes ARAspergillus fumigatus1993terependoles ALAlbophoma yamanashiensis1994AS-186a，b，c，d，gPenicillium aspeosporum1994isochromophil

24、onesPenicillium multicolor1996epicochlioquinone AStachbotrys bisbyi1996GERIBP002-AAspergillus fumigatus1996ACAT抑制劑的產(chǎn)生菌及發(fā)現(xiàn)年份 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑ACEI)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑ACEI通過切斷腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)阻斷血管緊張素的產(chǎn)生而擴(kuò)張血管降低血壓，是一類平安有效的降壓藥。第一代 以開博通capt為代表的第一代ACEI是一種特異性、競(jìng)爭(zhēng)性制劑;第二代 以依那普利為代表的一批不含巰基的前體藥物。在體內(nèi)分解為有活性的二元酸抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶，特點(diǎn)是起效慢，作用時(shí)

25、間長。第三代 應(yīng)用較多的是賴諾普利、福新普利，他們的特點(diǎn)是作用時(shí)間更長，水溶性強(qiáng)，對(duì)細(xì)胞的親和力大大超過第一、二代ACEI，而作用更優(yōu)，副作用更少、更輕。 ACEI的臨床應(yīng)用 高血壓 ACEI可用來治療各種類型的高血壓，可單獨(dú)使用，也可聯(lián)合使用，均可使半數(shù)以上的病人血壓恢復(fù)正常。充血性心力衰竭CHF ACEI適用于中重度CFH，與強(qiáng)心苷及其它正性肌力藥物、利尿劑等聯(lián)合用藥適用于頑固性心衰。心肌梗死 ACEI可用于急性心肌梗死的早期血栓溶解，減輕缺血，增加冠脈血流量，保護(hù)心肌，能有效地改善病癥。二尖瓣返流的治療 對(duì)這類病人用ACEI后心率及平均動(dòng)脈壓呈下降狀態(tài)。微生物來源的ACEI較多如一些化合

26、物結(jié)構(gòu)腎上腺素合成酶抑制劑 腎上腺素是交感神經(jīng)的傳導(dǎo)體，它由酪氨酸合成，其中作為速率控制的酶為酪氨酸羥化酶，而生物合成最后一步的酶為多巴胺-羥化酶及苯乙基胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶，其他還有兒茶酚-0-甲基轉(zhuǎn)移酶、組氨酸脫羧酶、色氨酸羥化酶、單胺氧化酶、多巴脫羧酶等。研究這些酶的抑制劑以到達(dá)抑制腎上腺素合成的目的，有可能用作為降血壓藥物。微生物來源的抑制劑包括抑制組氨酸脫羧酶及多巴胺脫羧酶作用的數(shù)個(gè)異黃酮類化合物，酪氨酸羥化酶和多巴胺-羥化酶抑制劑和兒茶酚-0-甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑。 III 酶抑制劑的篩選策略A variety of immobilized enzymes with combinatori

27、al libraries exceeding 250 compounds/enzyme are currently being screenedESIMSUse of PTP1B mutants for selective inhibitor screeningProtein-tyrosine phosphatase 1B (PTP 1B) has been implicated as a negative regulator of insulin action and as a potentially mediator in the pathogenesis of insulin-resis

28、tance and non-insulin dependent diabetes. Inhibiting this enzyme and preventing the insulin receptor downregulation has been suggested as a target for the treatment of type II diabetes. Virtual screen and High Throughput screenTechniqueCompoundsTestedHits withIC50 100 MHits withIC50 10 MHit RateHTS4

29、00,0008560.021%Docking3651272134.8%微生物來源膽固醇生物合成酶抑制劑篩選 SIPIRatmale)Livers2% cholestyramine8% added core oil 5 daysKilled at PM 11:00-12:00Homogerized tissuesSupernatantSupernatantSupernatant(Cytosolic fraction)Pellet(Microsomes)Homogerized Centrifuged at 700 xg 5 minCentrifuged at 1200 xg 30 minCentrifuged at10500 xg 60min(NH4)2SO4 precipitationDialysed at 4 for 6 hrPreparation 80 stored usedf for screenwashed in buffer膽固醇生物合成酶的制備篩選方法建立體外的膽固醇酶反響系統(tǒng)建立膽固醇檢測(cè)方法同位素標(biāo)記法， TLC方法篩選樣品制備： 微生物發(fā)酵液樣品、發(fā)酵液乙酸乙酯