1、 1，3丙二醇是目前國際上公認的六大石化新產品之一，其主要功能是作為合成聚酯、聚醚和聚亞氨酯的單體。1，3一丙二醇的生產方法有化學合成法和微生物轉化法，但從自然界中篩選的微生物厭氧發酵甘油生產l，3一丙二醇還存在產物生產周期長和轉化率低等問題，目前僅有化學合成法應用于工業生產。因此，利用基因工程技術構建高產菌株備被認為是今后的發展(fzhn)方向。1，3丙二醇簡介(jin ji)第1頁/共28頁第一頁，共29頁。1，3-丙二醇性質(xngzh)物理性質：1，3丙二醇(1，3-propanediol，l，3-PD)是一種無色無味透明的液體，易溶于水、乙醇、醚類和甲酰胺，微溶于氯仿和苯【3j，相對

2、密度為1053 gcm3，熔點27，沸點211，自燃(z rn)溫度為400。化學性質：高溫下與羧酸縮合成酯，與異氰酸鹽及酸性氯化物生成聚氨酯。1。3一丙二醇最重要的性質就是與二酸反應生成聚酯和聚氨酯。第2頁/共28頁第二頁，共29頁。1 1，3-3-丙二醇用途(yngt)(yngt) 可直接用于防凍劑，是多種增塑劑、洗滌劑、防腐劑和乳化劑的合成原料；也廣泛應用于食品、化妝品和制藥等行業14j。 1，3丙二醇最主要的用途是合成新型聚酯PTT的原料。PTT纖維克服了PET纖從而引起纖維材料界的矚目，可用于生產地毯、短絲及長絲(chn s)產品，產薄膜、非織造布和單絲，用作熱塑性工程塑料第3頁/共

3、28頁第三頁，共29頁。1，3-丙二醇基因工程菌構建的預期(yq)目標本研究首先利用PCR方法從大腸桿菌中克隆116 kb的1，3丙二醇氧化還原酶同工酶的編碼基因yqhD280kb來源于克雷伯氏桿菌甘油脫水酶的編碼基因dhaB構建了重組菌 i JM109(pEtacdhaBtac-yqhD) 構建重組載體(zit)pUCtacdhaT，并在大腸桿菌JMl09共表達重組質粒pEtacdhaBtac-yqhD和pUCtac-dhaT，研究為提高1，3丙二醇產量提供了新途徑。 第4頁/共28頁第四頁，共29頁。1，3-丙二醇基因工程(jyn gngchng)菌構建的路線(1)串聯表達來源于克雷伯氏菌

4、(Klebsiella)編碼油脫水酶的基因dhaB以及來源于大腸桿菌(編碼1，3一丙二醇氧化還原酶同工酶的基因yqhD，構建(u jin) 重組菌E coliJMl09(pEtacdhaBtac-yqhD);考察其轉化甘油的能力。(2)利用PCR擴增來源于克雷伯氏茵的1，3一丙二醇氧化還原酶dhaT，構建(u jin)重組載體pUCtac一砌口T，并在大腸桿菌JMl09共表達重組質粒pEtacdhaBtac-yqhD和pUCtac-dhaT。(3)在搖瓶水平，對已構建(u jin)的產1，3丙二醇重組菌EcoliJMl09 發酵條件的初步研第5頁/共28頁第五頁，共29頁。 1，3丙二醇生物合

5、成途徑 l，3一丙二醇是一種典型的甘油發酵產物,并未發現其可由其他有機底物厭氧轉化而來。甘油作為唯一碳源和能源，它可以沿著(yn zhe)氧化和還原途徑發生歧化反應，氧化途徑中產物與糖類發酵產物一致，并產牛供細胞牛長所必需的ATP，在某些產物形成的同時釋放還原力NADH；還原途徑則消耗氧化途徑中多余的還原力，生成1，3一丙二醇 。 第6頁/共28頁第六頁，共29頁。一、大腸桿菌JMl09的構建(u jin)及其表達第7頁/共28頁第七頁，共29頁。 1，菌株、質粒及基因片斷： 大腸桿菌JMl09，質粒pUCl9，pEtac由本實保藏；yqhD和dhaB基因分別從大腸 桿菌和克雷伯氏菌中克隆得到

6、(d do)。 2，主要試劑： 質粒小量抽提試劑盒、膠回收試劑盒化試劑盒 ；工具酶、抗生素 ；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、 材料(cilio)第8頁/共28頁第八頁，共29頁。（一）、質粒DNA的提取(1)接重組大腸桿菌一環于LB培養(piyng)基中，振蕩培養(piyng)過夜。(2)取15mL菌液于Eppendorf管中，6000rmin離心5 min。(3)棄去上清，加入溶液I 100“L重懸菌體。(4)加入溶液II 150“L，輕柔混勻。(5)加入溶液III 150此，倒轉混勻，8000 rmin，離心10min。(6)將420L結合緩沖液加入離心吸附柱中，然后將步驟5中的上清加入離心吸

7、附柱中混勻，第9頁/共28頁第九頁，共29頁。6000 rmin離心30s。倒掉廢液收集管中的廢液。（7)加入750此漂洗液于離心吸附柱中，靜置1 min后，6000rmin離心30s。倒掉廢液收集管中的廢液。重復一次。倒掉廢液后。再次于6000 rmin離心2min，盡量除去漂洗緩沖液。 (8)小心取出離心吸附柱，將其套入一個干凈(gnjng)的15 mLEppendorf離心管中，加入適量洗脫緩沖液，常規50此，室溫放置25min后，6000 rmin離心2min。 (9)取5“L酶切后電泳鑒定。第10頁/共28頁第十頁，共29頁。(二)、大腸桿菌感受態細胞的制備(1)接種EcoliJM1

8、09于LB培養基中振蕩培養過夜。(2)取05mL培養液于50mLLB培養基中37振蕩培養至OD值O304。(3)菌液三角瓶放入冰水中，輕輕搖晃，使菌液迅速冷卻(lngqu)約10分鐘。(4)分裝菌液到Eppendorf管(15mL)中，Eppendorf管迅速放入冰水中靜置15min。(5)8000rmin離心5min，然后靜置2min，冰水中迅速棄上清，加入預冷的CaCl2400uL， 第11頁/共28頁第十一頁，共29頁。 輕輕吹吸懸浮菌體，冰水中放置30min。（6)重復步驟(5)兩次。 (7)8000rmin離心5min，然后靜置2min，冰水中迅速棄上清，加入預冷的CaCl280uL

9、。也可加40 uL50的甘油保存(bocn)代用。第12頁/共28頁第十二頁，共29頁。（三）、轉化(zhunhu)大腸桿菌(1)取出感受態細胞，在冰水中融化。(2)加入待轉化的DNA，用吸頭輕柔混合，不可用漩渦混合儀。(3)冰水浴40min。(4)42熱激90s。(5)加入1mL LB培養基，37震蕩培養12 h。(6)涂布含有相應(xingyng)抗生素的LB平板。第13頁/共28頁第十三頁，共29頁。（四）、大腸桿菌(d chn n jn)JMl09基因工程菌的構建 首先將來源于大腸桿菌的基因片段yqhD連入載體pEtac上，得到(d do)重組質粒pEtac-yqhD，經酶切，得到(d

10、 do)片段tac-yqhD連入載體pUCl9，得到(d do)重組質粒pUCtac-yqhD，將來源于克雷伯氏菌的基因片段dhaB連入載體pUCtac-yqhD，以得到(d do)的重組質粒pUCdhaBtac-yqhD。將重組表達載體酶切連接到pEtac上，得到(d do)雙啟動子重組表達大腸桿菌JM 109(pEtacdhaB-tac-yqhD)。第14頁/共28頁第十四頁，共29頁。（五）、酶活力(hul)測定 1、甘油脫水酶活力(hul)的測定2、1，3一丙二醇氧化還原酶同工酶的酶 活力(hul)測定第15頁/共28頁第十五頁，共29頁。（六）、1，3丙二醇含量(hnling)的測定

11、 發酵液中l，3：丙二醇及甘油的含量采用氣相色譜測定 ，國產高分子微GDX401(110目)為固定相。柱溫：250，進樣溫度：240，檢測溫度t 240，氮氣作為載氣，使用氫火焰(huyn)檢測器，進樣5“L，1，3丙二醇的保留時間為27 min左右，用外標法計算發酵液中1，3一丙二醇的含量。第16頁/共28頁第十六頁，共29頁。二、重組質粒pUCtac-dhaT的構建(u jin)及其與pEtacdhaBtac-yqhD在大腸桿菌JMl09中共表達第17頁/共28頁第十七頁，共29頁。實驗材料 菌種：E coliJMl09(pEtac-dhaBtac-yqhD)為本研究“第二章構建保存的；質

12、粒pUCl9，pEtac由本實驗室保藏：dhaT基因從克雷伯氏菌中 試劑和工具酶：質粒小量抽提試劑盒、膠回收(hushu)試劑盒、質粒純化試劑盒 工具酶、抗生素 公司、華美生物 ；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、 3PCR引物 根據克雷伯氏菌公布的序列， 。 第18頁/共28頁第十八頁，共29頁。 引物： 3PCR引物 根據(gnj)克雷伯氏菌公布的序列，設計片段pEtacdhaTPCR所需引物：Ps：5-ACCGCAATTGATGAGCTATCGTATGTTTG一3：P6：5-ACC CAGAATGCCTGGCG3。引物兩端均弓l,KmfeI、HindlII酶切位點。第19頁/共28頁第十九頁，共

13、29頁。實驗條件和方法 PCR反應體系及反應條件：PCR反應體系：在0 5 mL Eppendorf管中按順序加入以下試劑：10buffer 5 m，2 5mmolLdNTP4lLl，MgCl24IlI，上下游引物各1 IIl，模板DNA2 pl，腳酶1 itl，ddH20 32m，總體積50 pl。 13一丙二醇氧化還原酶dhaT的反應條件：94預變性5min：變性90 s，54退火(tu hu)l 5min，72延伸l 5rain，循環35次；72保溫10min。 第20頁/共28頁第二十頁，共29頁。 （1）大腸桿菌基因工程菌的構建將來源于克雷伯氏菌的基因片段dhaT連入載體(zit)p

14、Etae，以得到的重組質粒pEtac-dhaT。經酶切得到片段tac-dhaT連接到pUCl9上，以得到的重組質粒pUC-tac-dhaT。將基因工程菌pUC-tae-dhaT和基因工程pEtac-dhaB-tac-yqhD共轉化大腸桿菌KcoliJMl09。 （2） 1，3丙二醇氧化還原酶的酶活力測定測定1，3-丙二醇氧化還原酶的酶活。酶活測定根據250C條件下NAD+還原成NADH的速率來定量。酶活單位定義為1國際單位(1u)等于每分種還原1lJmol底物NAD+或生成1“raol產物NADH的酶量。第21頁/共28頁第二十一頁，共29頁。四、重組(zhn z)菌coliJMl09(pEt

15、acdhaBtac-yqhD，pUCtacdhaT)發酵培養基優化第22頁/共28頁第二十二頁，共29頁。 菌株：重組菌Ecoli JMl09(pEtacdhaB-tac-yqhD，pUCtacdhaT)為本論文三中構建。 培養基和培養條件 LB培養基(L)：蛋白胨10，酵母膏5，氯化鈉lO，瓊脂15(固體培養基)，固體和液體培養基在需要時加入氨芐青霉素至100tgmL、卡那霉素50pgmL。 種子培養基：采用(ciyng)LB培養基。 發酵培養基(gL)：甘油、酵母膏、KH2P04、MgS047H20和維生素B12 青霉素至100IxgmL、卡那霉素50rtgmL。材料(cilio)第23頁

16、/共28頁第二十三頁，共29頁。 搖瓶發酵：從新鮮的LB培養基斜面上挑取一環菌株接入50 mL搖瓶(裝液量為10mL)中，于旋轉式搖床中37、150 rmin培養18 h得到種子液。接種于250 mL搖瓶中，在150 rmin旋轉式搖床中，先于37。C培養至OD600為O7，再于37誘導發酵一定(ydng)時間。方法(fngf)第24頁/共28頁第二十四頁，共29頁。1、采用單因素實驗分別(fnbi)考察了不同濃度的甘油、酵母膏、KH2P04、VBl2及M孑+等因素對重組菌E coliJMl09(pEtacdhaBtac-yqhD，pUCtacdhaT)發酵結果的影響，確定了其發酵培養基的基本

17、組成為：甘油20gL、VBl2001gL、KH2P0475edL、M92+067gL和酵母膏5L，在此培養基中l，3一丙二醇的產量達到225L。 小結(xioji)第25頁/共28頁第二十五頁，共29頁。2、通過正交實驗分析法進一步優化了重組(zhn z)菌EcoliJMl09(pEtac-dhaBtac-yqhD，pUCtac-dhaT)的發酵培養基，其適宜組成為：甘油20 gL、VBl2 O01 gL、KH2P045 gL、M92+067 edL和酵母膏5L。最適發酵條件為：裝液量10、接種量10、轉速150rmin、接種后4d,時左右加入IPTG、IPTG終濃度為lmmolL。應用此培養

18、基l，3丙二醇的產量為24329L，第26頁/共28頁第二十六頁，共29頁。3、在通過正交實驗優化后的培養基中，重組菌EcoliJMl09(pEtaedhaBtac-yqhD)與E coliJMl09(pEtacdhaBtac-yqhD，pUCtacdhaT)經誘導前后1，3丙二醇的產量分別為03L、1943 gL及O3L、2432 gL。發酵24小時后，重組菌EcoliJM109(pEtacdhaBtac-yqhDDpUCtacdhaT)L,Ecoli JM109(pEtacdhaB-tac-yqhD)l，3丙二醇產量提高了251。可見(kjin)，由甘油到1，3-PD的反應，限速步驟是3羥基丙醛到1，3。丙二醇的反應。本研究成功構建了在大腸桿菌中利用了兩種輔酶(NADH、NADPH)的共表達，減少3羥基丙醛的累積，提高了1，3-P