1、微生物學檢驗微生物學檢驗微生物學檢驗微生物學檢驗國家衛生和計劃生育委員會規劃教材國家衛生和計劃生育委員會規劃教材 第六章 細菌對抗菌藥物敏感性與耐藥性本 章 內 容第一節 臨床常用抗菌藥物1第二節 抗菌藥物敏感試驗2第三節 分枝桿菌的藥物敏感試驗3第四節 細菌的耐藥性檢查4學習目標學習目標： 1掌握 抗菌藥物敏感試驗常用方法，紙片擴散法（K-B法）的操作方法、結果判斷及實驗質量影響因素2熟悉 耐藥表型檢測；-內酰胺酶檢測方法；超廣譜-內酰胺酶（ESBLs）檢測方法3了解 臨床常用抗菌藥物種類；藥敏試驗中藥物選擇原則本章重點：紙片擴散法（K-B法）的操作方法及結果判斷 藥敏試驗的臨床意義第一節

2、臨床常用抗菌藥物一、抗菌藥物分類1.-內酰胺類：抑制轉糖基酶、轉肽酶、D-羧肽酶、內肽酶，從而細菌細胞壁合成。2.氨基糖苷類：抑制mRNA的轉錄和蛋白質的合成。 3.喹諾酮類：作用于DNA旋轉酶，干擾細菌DNA復制、修復和重組。4.大環內酯類：結合細菌核糖體50S大亞基，抑制細菌蛋白質合成和肽鏈延伸。5.糖肽類：阻斷肽聚糖合成，阻阻礙細胞壁合成。第一節 臨床常用抗菌藥物一、抗菌藥物分類6.磺胺類：競爭性與二氫葉酸合成酶結合，使核酸合成抑制。7.四環素類：結合細菌30S核糖體亞基，抑制蛋白質合成。8.氯霉素類：作用細菌70S核糖體的50S亞基，抑制蛋白合成。9.林可酰胺類：結合細菌核糖體50S大

3、亞基，抑制蛋白質合。10.其他抗菌藥物：硝基膚喃類、硝基咪唑類、鏈陽霉素類、噁唑烷酮類等。二、常規藥敏試驗藥物選擇原則我國主要遵循美國臨床實驗室標準化委員會（CLSI）制定的抗菌藥物選擇原則。第一節 臨床常用抗菌藥物返回章內容返回章內容U組：僅用于治療泌尿道感染的藥物。C組：在A、B組藥物過敏或耐藥時選用；B組：只在A組藥物耐藥、過敏、無效時選擇性報告;A組：包括對特定菌群的常規試驗并常規報告的藥物；第二節 抗菌藥物敏感試驗一、概述測定抗菌藥物在體外對病原微生物有無抑菌或殺菌作用的方法稱為抗菌藥物敏感試驗（AST）抗菌藥物敏感試驗方法紙片擴散法稀釋法E-test法 菌株被推薦劑量治療感染部位可

4、達到的抗菌藥物濃度抑制藥物在生理濃集部位有臨床效果，還代表敏感與耐藥之間緩沖區 菌株不能被常規劑量抗菌藥物可到達的濃度所抑制敏感（S）耐藥（R）中介（I）抗菌藥物敏感試驗結果第二節 抗菌藥物敏感試驗二、紙片擴散法含有定量抗菌藥物紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上，紙片中所含藥物吸收瓊脂中水分溶解后向紙片周圍區域擴散，形成遞減的梯度濃度。紙片周圍抑菌濃度范圍內測試菌的生長被抑制，形成透明抑菌圈。抑菌圈大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的最低抑菌濃度（MIC）呈負相關關系。第二節 抗菌藥物敏感試驗二、紙片擴散法1.水解酪蛋白（MH）培養基，pH7.27.4，做成瓊脂厚度4mm，直徑

5、90mm的平板2.挑取孵育1624小時已分純菌落，置于生理鹽水管中，振蕩混勻后校正濃度至0.5麥氏標準第二節 抗菌藥物敏感試驗二、紙片擴散法3.用無菌棉拭子蘸取菌液，在試管內壁旋轉擠去多余菌液4.在MH瓊脂表面均勻涂布接種3次，每次旋轉平板60度，最后沿平板內緣涂抹1周5.平板在室溫下干燥35min，用無菌鑷子或紙片分配器將含藥紙片緊貼于瓊脂表面，各紙片中心距離應大于24mm，紙片距平板內緣大于15mm第二節 抗菌藥物敏感試驗二、紙片擴散法6.平板置352孵育箱，1618小時后判讀結果。苛養菌應在含5%CO2環境中培養2024小時7.用游標卡尺或直尺量取抑菌圈直徑。按照CLSI標準判讀，報告敏

6、感、中介、耐藥第二節 抗菌藥物敏感試驗紙片擴散法圖解抑菌圈細菌生長藥敏紙片細菌菌落抗生素濃度 耐藥敏感第二節 抗菌藥物敏感試驗三、稀釋法以一定濃度的抗菌藥物與培養基進行一系列不同倍數稀釋，經培養后觀察被試菌株的最低抑菌濃度，根據CLSI提供的MIC解釋標準判斷細菌對抗菌藥物的敏感程度。稀釋法中使用肉湯培養基為肉湯稀釋法，使用瓊脂培養基為瓊脂稀釋法第二節 抗菌藥物敏感試驗三、稀釋法1. 肉湯稀釋法濃度 4 8 16 32 64 128 256 g/ml 混 清抗菌藥物素倍比稀釋，接種菌105CFU/ml ， 孵育溫度35，1620h，判讀結果。第二節 抗菌藥物敏感試驗三、稀釋法2.瓊脂稀釋法 濃

7、度 16 32 64 128 256 g/ml 制備含對倍抗生素濃度梯度的平板，制備菌懸液，點種菌，104/每點，孵育35，1620h ，判讀結果第二節 抗菌藥物敏感試驗四、E-test法E-test法（epsilometer test）結合了擴散法和稀釋法的原理和特點，對抗菌藥物直接測量MIC。E試條為寬5mm、長50mm的無孔試劑載體，一面固定有濃度呈連續指數增長的抗菌藥物，另一面有所含藥物濃度的刻度 細菌生長區E test 塑料條橢圓形細菌生長抑制區256128 8016判讀抑菌濃度（MIC ug/ml)第二節 抗菌藥物敏感試驗四、 E-test法1.菌液制備及接種均同紙片擴散法2.于9

8、0mm平板上可放E試驗試條1 2條，140mm平板最多可放6條3. 孵育、溫度及時間同紙片擴散法4.讀取橢圓形抑菌環與E試條的交界點值即為MIC第二節 抗菌藥物敏感試驗五、質量控制1.影響紙片擴散法的因素(1) 培養基厚度(2) 細菌濃度(3) 抗菌藥物含量、擴散性(4) 溫度，預孵育時間(5) 判定標準(6) 質控標準菌株第二節 抗菌藥物敏感試驗五、質量控制2.質量控制的要求（1）質控菌：標準菌株來源國家微生物菌種保藏中心。標準菌株應每周在MH瓊脂上傳代一次，4保存（2）質控方法：在同一條件下，將新鮮傳代質控菌株用與常規實驗相同的測定藥物進行相同的操作方法后，測定質控菌株的抑菌環，以便對照監

9、測（3）抑菌圈質控范圍：標準菌株的抑菌圈應落在規定范圍內，范圍為95%的可信限返回章內容返回章內容第二節 抗菌藥物敏感試驗一、結核分枝桿菌體外藥敏試驗指征 首次從患者標本分離的分枝桿菌需做藥敏試驗，有助于臨床合理用藥和監測其藥物敏感性。經過三個月正規抗結核治療，標本中分枝桿菌分離培養仍為陽性的患者或重癥患者，以及來自高耐藥結核分枝桿菌流行區的患者，均須做體外藥敏試驗。 第三節 分枝桿菌的藥物敏感試驗二、 體外藥敏試驗絕對濃度法1.藥物溶液配制 藥物先制成高濃度藥液，再按比例稀釋成低濃度藥液.含藥培養基 每100ml改良羅氏培養基加入1ml配制、稀釋好的抗結核藥液，無菌分裝7ml/管，85凝固。

10、.菌懸液 培養物以0.5%吐溫-80生理鹽水稀釋，與標準麥氏比濁管No.1比濁.接種 1mg/ml菌懸液10倍稀釋至102mg/ml，無菌吸取菌液0.1ml分別接種于含藥培養基和對照培養基斜面。37培養，四周觀察結果 第三節 分枝桿菌的藥物敏感試驗二、 體外藥敏試驗絕對濃度法.結果報告 按下列方式報告對照培養基及含藥培養基菌落情況：返回章內容返回章內容 第三節 分枝桿菌的藥物敏感試驗一、細菌耐藥性與耐藥機制 1.產生一種或多種水解酶、鈍化酶和修飾酶2.抗菌藥物作用靶位改變，包括青霉素結合蛋白位點、DNA解旋酶、DNA拓撲異構酶的改變等3.抗菌藥物滲透障礙，包括細菌生物被膜形成和通道蛋白丟失4.

11、藥物的主動轉運系統亢進上述四種耐藥機制中，第一、二種耐藥機制具有專一性，第三、四種耐藥機制不具有專一性。 第四節 細菌的耐藥性檢查二、耐藥表型檢測 1.-內酰胺酶檢測（1）-內酰胺酶是一類水解青霉素、頭孢菌素類抗生素的滅活酶；該酶位于革蘭陽性球菌菌體外，革蘭陰性桿菌間質中。（2）檢測方法有微生物培養法、碘淀粉法、頭孢硝噻吩紙片法。其中頭孢硝噻吩紙片法因為簡單、方便、快速，應用于臨床檢測。 第四節 細菌的耐藥性檢查二、耐藥表型檢測 2超廣譜-內酰胺酶檢測 l ESBL指由質粒介導的能水解青霉素類、頭孢菌素類和單環內酰胺類氨曲南的一類酶。l ESBLs不能水解頭霉素類和碳青霉烯類藥物，能被克拉維酸

12、、舒巴坦和他唑巴坦等內酰胺酶抑制劑所抑制。 第四節 細菌的耐藥性檢查二、耐藥表型檢測 2.超廣譜-內酰胺酶檢測（1）紙片擴散法 表型初篩試驗出現以下一種情況即可懷疑菌株產生ESBL（篩選陽性）：頭孢泊肟17mm頭孢他啶22mm頭孢噻肟27mm頭孢曲松25mm氨曲南 27mm 第四節 細菌的耐藥性檢查二、耐藥表型檢測 2.超廣譜-內酰胺酶檢測（紙片擴散法）（1）紙片擴散法表型確證試驗頭孢他啶和頭孢他啶/克拉維酸、頭孢噻肟和頭孢噻肟/克拉維酸。任一復合藥物組的抑菌圈直徑與相應單藥抑菌圈直徑相差5mm時，即可判斷該菌產ESBL 第四節 細菌的耐藥性檢查二、耐藥表型檢測 2.超廣譜-內酰胺酶檢測（）肉湯稀釋法表型初篩試驗出現以下一種情況即可懷疑該菌株產生ES