1、熒熒 光光 光光 度度 計計環境科學與工程研究中心環境科學與工程研究中心n掌握分子熒光產生的過程及其影響因素掌握分子熒光產生的過程及其影響因素n熟悉熒光光度計的基本構件及操作程序熟悉熒光光度計的基本構件及操作程序n了解熒光分析法的特點與應用了解熒光分析法的特點與應用【實驗目的】【實驗目的】【實驗原理】【實驗原理】一、分子熒光產生過程一、分子熒光產生過程二、激發光譜與熒光光譜二、激發光譜與熒光光譜三、熒光的產生與分子結構關系三、熒光的產生與分子結構關系四、影響熒光強度的因素四、影響熒光強度的因素1. 1. 分子能級與躍遷分子能級與躍遷 分子能級比原子能級復雜； 在每個電子能級上，都存在振動、轉動

2、能級； 基態(S0)激發態(S1、S2、激發態振動能級)：吸收特定 頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位； 激發態基態：多種途徑和方式(見能級圖)；速度最快、激發態壽命最短的途徑占優勢； 第一、第二、電子激發單重態 S1 、S2 ； 第一、第二、電子激發三重態 T1 、 T2 ；一、分子熒光的產生過程一、分子熒光的產生過程2.2.電子激發態的多重度電子激發態的多重度 電子激發態的多重度：電子激發態的多重度：M=2S+1 S S為電子自旋量子數的代數和為電子自旋量子數的代數和(0(0或或1)1)； 平行自旋比成對自旋穩定平行自旋比成對自旋穩定( (洪特規則洪特規則) )，三重態能級比相應，三重態能級

3、比相應單重態能級低；單重態能級低； 大多數有機分子的基態處于單重態；大多數有機分子的基態處于單重態； S0T1 禁阻躍遷；禁阻躍遷；通過其他途徑進入通過其他途徑進入(見能級圖見能級圖)；進入的幾；進入的幾率小；率小； VRASnICVRFPTmISC1ICV RV RS0S1T1（S S0 0：單線基態；：單線基態；S S1 1：最低激發單線態；：最低激發單線態；T T1 1：最低激發三線態；：最低激發三線態；A A： 吸收；吸收；F F： 熒光；熒光；P P：磷光；：磷光；v v：振動馳豫；：振動馳豫；ISCISC：系間竄躍）：系間竄躍） 熒光、磷光光物理過程示意圖熒光、磷光光物理過程示意圖

4、3.3.激發態激發態基態的能量傳遞途徑基態的能量傳遞途徑 電子處于激發態是不穩定狀態，返回基態時，通過輻射躍遷電子處于激發態是不穩定狀態，返回基態時，通過輻射躍遷(發光發光)和和無輻射躍遷等方式失去能量無輻射躍遷等方式失去能量。傳遞途徑傳遞途徑輻射躍遷輻射躍遷熒光熒光延遲熒光延遲熒光磷光磷光內轉移內轉移外轉移外轉移系間跨越系間跨越振動弛豫振動弛豫無輻射躍遷無輻射躍遷 激發態停留時間短、返回速度快的途徑，發生的幾率大，激發態停留時間短、返回速度快的途徑，發生的幾率大，發光強度相發光強度相對大。對大。熒光：熒光：1010-7-710 10 -9-9 s, s,第一激發單重態的最低振動能級第一激發單

5、重態的最低振動能級基態；基態；磷光：磷光：1010-4-410s10s；第一激發三重態的最低振動能級；第一激發三重態的最低振動能級基態；基態；二、激發光譜與熒光光譜二、激發光譜與熒光光譜 熒光：熒光：光致發光光致發光，照射光波長如何選擇？，照射光波長如何選擇？1.1.熒光熒光( (磷光磷光) )的激發光譜曲線的激發光譜曲線 固定測量波長固定測量波長( (選最大發射波長選最大發射波長),),化合物發射的熒光強度化合物發射的熒光強度與照射光波長的關系曲線與照射光波長的關系曲線 （圖中曲線（圖中曲線I I ） 。 激發光譜曲線的最高處，處于激發態的分子最多，熒光激發光譜曲線的最高處，處于激發態的分子

6、最多，熒光強度最大；強度最大；2.2.熒光光譜熒光光譜( (或磷光光譜或磷光光譜) ) 固定激發光波長固定激發光波長( (選選最大激發波長最大激發波長),), 化合物化合物發射的熒光發射的熒光( (或磷光強度或磷光強度) )與發射光波長關系曲線與發射光波長關系曲線( (圖中曲線圖中曲線II或或III) )。3.3.激發光譜與發射光譜的關系激發光譜與發射光譜的關系 a.Stokesa.Stokes位移位移 激發光譜與發射光譜之間的波長差值。發射光譜的波長比激發光譜與發射光譜之間的波長差值。發射光譜的波長比激發光譜的長，激發光譜的長，振動弛豫消耗了能量。振動弛豫消耗了能量。 b b. .發射光譜的

7、形狀與激發波長無關發射光譜的形狀與激發波長無關 電子躍遷到不同激發態能級，吸收不同波長的能量電子躍遷到不同激發態能級，吸收不同波長的能量，產生產生不同吸收帶，不同吸收帶，但均回到第一激發但均回到第一激發單重態單重態的最低振動能級再躍的最低振動能級再躍遷回到基態，產生波長一定的熒光。遷回到基態，產生波長一定的熒光。 c c. . 鏡像規則鏡像規則 通常熒光發射光譜與它的吸收光譜（與激發光譜形狀一通常熒光發射光譜與它的吸收光譜（與激發光譜形狀一樣）成鏡像對稱關系。樣）成鏡像對稱關系。 鏡像規則的解釋 基態上的各振動能級分布基態上的各振動能級分布與第一激發態上的各振動能級與第一激發態上的各振動能級分

8、布類似；分布類似； 基態上的基態上的零振動能級與零振動能級與第一激發態的第一激發態的二振動能級之二振動能級之間的躍遷幾率間的躍遷幾率最大，相反躍最大，相反躍遷也然。遷也然。 200250300350400450500熒光激發光譜熒光激發光譜熒光發射光譜熒光發射光譜nm蒽的激發光譜和熒光光譜蒽的激發光譜和熒光光譜三、熒光的產生與分子結構的關系三、熒光的產生與分子結構的關系 1.1.分子產生熒光必須具備的條件分子產生熒光必須具備的條件（1）具有合適的結構。）具有合適的結構。（2）具有一定的熒光量子產率。）具有一定的熒光量子產率。 熒光量子產率（熒光量子產率（ ）：）：吸收的光量子數發射的光量子數

9、熒光量子產率與激發態能量釋放各過程的速率常數有關熒光量子產率與激發態能量釋放各過程的速率常數有關，如外轉換過程速度快，不出現熒光發射。，如外轉換過程速度快，不出現熒光發射。2.2.化合物的結構與熒光化合物的結構與熒光（1）躍遷類型：）躍遷類型： * 的熒光效率高，系間跨越過程的速的熒光效率高，系間跨越過程的速率常數小，有利于熒光的產生；率常數小，有利于熒光的產生；（2）共軛效應：提高共軛度有利于增加熒光效率并產生紅移）共軛效應：提高共軛度有利于增加熒光效率并產生紅移（3）剛性平面結構：可降低分子振動，減少與溶劑的相互作）剛性平面結構：可降低分子振動，減少與溶劑的相互作用，故具有很強的熒光。如熒

10、光素和酚酞有相似結構，熒光用，故具有很強的熒光。如熒光素和酚酞有相似結構，熒光素有很強的熒光，酚酞卻沒有。素有很強的熒光，酚酞卻沒有。（4）取代基效應：芳環）取代基效應：芳環上有供電基，使熒光增上有供電基，使熒光增強。強。四、影響熒光強度的因素四、影響熒光強度的因素 影響熒光強度的影響熒光強度的外部因素外部因素1.1.溶劑的影響溶劑的影響 除一般溶劑效應外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成除一般溶劑效應外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光發生變化；都將使化合物的熒光發生變化；2.2.溫度的影響溫度的影響 熒光強度對溫度變化敏感，溫度增加，外轉換去活的幾熒光強度對溫度變化敏感，溫度

11、增加，外轉換去活的幾率增加。率增加。3. 3. 溶液溶液pHpH 對酸堿化合物，溶液對酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴格控制；的影響較大，需要嚴格控制；4.4.內濾光作用和自吸現象內濾光作用和自吸現象內濾光作用：內濾光作用：溶液中含有能吸收激發光或熒光物質發射熒溶液中含有能吸收激發光或熒光物質發射熒光，如色胺酸中的重鉻酸鉀。光，如色胺酸中的重鉻酸鉀。自吸現象：自吸現象：化合物的熒光發射光譜的短波長端與其吸收光化合物的熒光發射光譜的短波長端與其吸收光譜的長波長端重疊，產生自吸收；如蒽化合物。譜的長波長端重疊，產生自吸收；如蒽化合物。5.5.溶液熒光的猝滅溶液熒光的猝滅 碰撞猝滅；碰撞猝滅；

12、 氧的熄滅作用等。氧的熄滅作用等。二、儀器結構流程二、儀器結構流程 熒光儀主要由熒光儀主要由四個部分四個部分組成：激發光源、樣品池、雙單組成：激發光源、樣品池、雙單色器系統、檢測器。色器系統、檢測器。 特殊點：特殊點：有兩個單色器，光源與檢測器通常成直角。 基本流程如圖：基本流程如圖：單色器：單色器：選擇激發光波長的選擇激發光波長的第一單色器和選擇發射光波第一單色器和選擇發射光波長的第二單色器；長的第二單色器；光源：光源：氙燈和高壓汞燈，染氙燈和高壓汞燈，染料激光器料激光器( (可見與紫外區可見與紫外區) )檢測器：檢測器：光電倍增管光電倍增管。儀器光路圖同步掃描技術同步掃描技術 根據激發和發

13、射單色器在掃描過程中彼此間所保持的關系，同步根據激發和發射單色器在掃描過程中彼此間所保持的關系，同步掃描可分為固定波長差掃描可分為固定波長差( () )和固定能量差及可變波長三種。和固定能量差及可變波長三種。 同步掃描技術可簡化光譜：同步掃描技術可簡化光譜：譜帶譜帶變窄，減少光譜重疊，提高分辨率；變窄，減少光譜重疊，提高分辨率； 如圖如圖。 合適的合適的可可減少光譜重疊：減少光譜重疊： 酪氨酪氨酸和色氨酸的熒光激發光譜相似，發射酸和色氨酸的熒光激發光譜相似，發射光譜嚴重重疊，但光譜嚴重重疊，但15nm60nm60nm時，時，只顯示只顯示色氨酸的特征光譜，實現分別測色氨酸的特征光譜，實現分別測定

14、。定。可獲得三維光譜圖的儀器可獲得三維光譜圖的儀器 可獲得激發光譜與發射光譜同時變化時的熒(磷)光光譜圖日立日立F-4500F-4500熒光儀熒光儀熒熒光光儀儀主主機機電電源源開開關關光源開關光源開關主機開關主機開關n開機順序：開機順序：q開機前首先確認主機兩個開關：開機前首先確認主機兩個開關：POWER/MAIN均處于關閉狀態均處于關閉狀態（搬向（搬向O處）。處）。q先接通電源開關（先接通電源開關（POWER），）， 5秒鐘后再按下氙燈點燈按鈕，當秒鐘后再按下氙燈點燈按鈕，當氙燈點燃后，再接通主開關（氙燈點燃后，再接通主開關（MAIN）。此時主開關上方綠色指示）。此時主開關上方綠色指示燈連續

15、閃動三下。燈連續閃動三下。q接通電腦及打印機電源，接通電腦及打印機電源，Win98開始建立，隨后開始建立，隨后F-4500操作界面自操作界面自動進入。動進入。q按界面提示選擇操作方式。按界面提示選擇操作方式。n關機順序：關機順序：q逆開機順序實施操作。逆開機順序實施操作。q當電源開關關閉后當電源開關關閉后5秒鐘，再次接通秒鐘，再次接通10分鐘。（目的是僅讓風扇工分鐘。（目的是僅讓風扇工作，使燈室散熱）最后關閉電源開關。作，使燈室散熱）最后關閉電源開關。日立日立F-4500F-4500熒光分光光度計簡易操作方法熒光分光光度計簡易操作方法三、熒光分析方法與應用三、熒光分析方法與應用1. 1. 特點

16、特點（1 1）靈敏度高）靈敏度高 比紫外比紫外- -可見分光光度法高可見分光光度法高2 24 4個數量級；為什么？個數量級；為什么？ 檢測下限：檢測下限：0.10.10.10.1 g/cmg/cm-3-3 相對靈敏度：相對靈敏度：0.05mol/L 0.05mol/L 奎寧硫酸氫鹽的硫酸溶液奎寧硫酸氫鹽的硫酸溶液。（2 2）選擇性強）選擇性強 既可依據特征發射光譜，又可根據特征吸收光譜；既可依據特征發射光譜，又可根據特征吸收光譜；（3 3）試樣量少）試樣量少 缺點：缺點：應用范圍小應用范圍小。2.2.定量依據與方法定量依據與方法(1)定量依據定量依據 熒光強度熒光強度 If正比于吸收的光量正比

17、于吸收的光量Ia和熒光量子效率和熒光量子效率 ： If = Ia 由朗由朗-比耳定律：比耳定律： Ia = I0(1-10- l c ) If = I0(1-10- l c ) = I0(1-e-2.3 l c ) 濃度很低時，將括號項近似處理后：濃度很低時，將括號項近似處理后： If = 2.3 I0 l c = Kc（2 2）定量方法）定量方法標準曲線法：標準曲線法： 配制一系列標準濃度試樣測定熒光強度，繪制標準曲線，再在相同條件下測量未知試樣的熒光強度，在標準曲線上求出濃度；比較法：比較法： 在線性范圍內，測定標樣和試樣的熒光強度，比較；3.3.熒光分析法的應用熒光分析法的應用(1)(1)無機化合物的分析無機化合物的分析 與有機試劑配合物后測量；可測量約60多種元素。 鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土常采用熒光分析法； 氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳