1、中草藥與卵黃抗體復合氣霧劑體外抑制病毒實驗楊士章1 方希修1* 周根來1龔偉2 陳明1鄧學兵2 蔡爾問3（1.江蘇畜牧獸醫職業技術學院飼料與營養研究所，泰州，225300;2.江蘇天成保健品有限公司，海安，226613; 3.中國動物保健品協會，北京，100081）本研究得到江蘇省科技攻關項目“中獸藥與免疫球蛋白切合防治家禽呼吸道疾病的研究開發”資金資助，項目編號：BE2003618 摘 要：將不同配比的中草藥與卵黃抗體復合氣霧劑體外抑制病毒的能力進行比較，以確定中草藥與卵黃抗體的最佳配比。抑病毒實驗采用兩種方法：病毒致細胞病變抑制實驗和血凝抑制實驗，以產生50%細胞病變的最高藥物稀釋度或不產

2、生凝血的最小藥物濃度為其最小抑病毒的濃度。樣品I對腺病毒7型（AdV7）的最小抑制濃度為1/640，作用弱于樣品II，而對其它病毒的作用都最強。樣品IV除對腺病毒3型（AdV3）的最小抑制濃度為1/640，對其余病毒的抑制作用在4種樣品中最弱。體外抑制病毒實驗表明選用1:1配比的復合氣霧劑最能有效防治呼吸道疾病。關鍵詞：中草藥；卵黃抗體；氣霧劑；抑病毒 Experiments of restraining virus of complex aerosol of Chinese medicine and yolk antibody in vitro Gong-wei 1, Fang Xi-xiu

3、 1 ,Cai Er-wen3, et al(1. Jiangsu Tiancheng animal healthy product limited company, Hai'an, 226613,2.Jiangsu animal husbandry and veterinarian college, Taizhou, 225300; 3.Chinese animal healthy product association, Beijing, 100081)Abstract: To confirm the best ratio of Chinese medicine and yolk

4、antibody in compound aerosol, the virustatic test among different compound aerosol of Chinese medicine and yolk antibody were compared. Virustatic test includes cytopathic inhibition test of different virus and the inhibition test of TPHA, regarding the 50% tissue culture infectious dose (TCID50) or

5、 the maximum dilution degree at which 50% cytopathic effect can be inhibited as the interferon effect value. The minimum virustatic concentration of sample I for AdV7 is 1/640, which power is less than sample II, but its power for other virus is strongest. Other than the minimum virustatic concentra

6、tion for AdV3 is 1/640, the inhibition to other virus of sample IV is weakest among four samples. The experiment of virustatic in vitro suggest that compound aerosol, which ratio is 1:1, has the best effect on control breath illness.Key words: Chinese medicine; yolk antibody; aerosol; virustatic雞上呼吸

7、道感染是指雞上呼吸道受病原微生物侵襲所致的疾病。雞常見呼吸道病主要由病毒、細菌和敗血霉形體等引起，其臨床的主要特征為流淚、流鼻涕、咳嗽、氣喘、羅音和呼吸困難、眼腫。中獸藥不僅可用于治療細菌、鉤端螺旋體、致病性真菌和原蟲感染，還能用于防治病毒感染。本實驗通過比較不同配比的中草藥與卵黃抗體復合氣霧劑在體外抑制病毒的能力來選擇最佳配比，從而為家禽呼吸道病毒感染的治療提供理論基礎。1 實驗材料1.1 實驗用樣品配制中草藥喘康制劑由江蘇天成保健品有限公司生產，利用超聲波提取其有效成分，經過低溫冷凍干燥機進行制成粉劑；卵黃抗體粉劑由江蘇畜牧獸醫職業技術學院飼料與營養研究所制備。實驗樣品為不同配比的中草藥“

8、禽喘康復散”與卵黃抗體復合氣霧劑，配比分別為1:1，1:0.8，1:0.5，1:0.2，分別記為樣品I、II、III、IV。提取溶劑為70%乙醇溶液，在水浴上加熱回流提取1h，趁熱過濾，藥渣再重復提取1次，合并濾液，濃縮至原液濃度為1g/mL，采用間歇法滅菌。1.2 儀器設備超凈工作臺，CO2培養箱，96孔培養板，微量滴定板，普通顯微鏡。1.3 實驗用病毒及細胞實驗用病毒:柯薩奇病毒3、5型(CB3、CB5)，腺病毒3、7型(AdV3、AdV7)，合胞病毒(RSV)，流感病毒(F)，副流感病毒(P )。實驗用細胞：Hep-2細胞單層培養物。選用9-10d齡雞胚、1%的雞紅細胞。1.4 組織培養

9、基生長液為10%小牛血清MEM液，含青、鏈霉素各100IU/mL。維持液為2%小牛血清MEM培養液。2 實驗方法2.1 樣品對細胞毒性測定選用的4種樣品以0.1g/mL為原液，按2n×101倍比稀釋，分別加人已長成單層Hep-2細胞的96孔培養板中，放37CO2溫箱過夜，觀察各配比制劑對細胞的毒性作用，以對細胞不產生毒性時的樣品濃度記為CC0，作為抑病毒實驗的起始濃度。2.2 病毒感染滴度測定取CB3、CB5、AdV3、AdV7、RSV的新鮮病毒懸液，以10倍遞次稀釋法稀釋成不同稀釋度，分別接種到組織培養單層細胞管內，每管接種100L，每個稀釋度接種4只細胞管，使病毒與細胞充分接觸，

10、37吸附1h，以Hanks液洗3次，加入細胞維持液，37培養，逐日在普通顯微鏡下觀察記錄細胞病變情況，觀察15d，測定組織培養半數感染量TCID50。本實驗選用不同病毒的100TCID50/0.1mL。2.3 中和實驗將樣品從CC0起作系列倍比稀釋，1樣品與100TCID50的病毒等量相加，搖勻放37水浴作用1.5h，接種到形成單層細胞的96孔培養板內，同時設病毒對照、正常細胞對照、樣品對照組，以產生50%細胞病變的樣品最高稀釋度作為判定結果。2.4 血凝抑制實驗取96孔培養板，將樣品順序作倍比稀釋至15120，每孔加入4個單位的血凝素100L等量混合，37作用1h，加入1%雞紅細胞各100L

11、，搖勻后置室溫30、45各觀察1次結果，以45為準。對照組設樣品對照，病毒對照(分別加入4、2、1、1/2單位血凝素各100L +生理鹽水各100L)、紅細胞對照，以上各對照組再分別加入1%雞紅細胞100L，搖勻，在相同條件下觀察結果。以能完全抑制紅細胞凝集的最小藥物濃度為終點。3 結果樣品對細胞毒性測定結果見表1。樣品初始濃度選擇對Hep-2出現*的濃度，即樣品I為1/640，樣品II為1/320，樣品III為1/160，樣品IV為1/80。表1 樣品對Hep-2細胞毒性的作用藥物濃度（g/mL）1/101/201/401/801/1601/3201/6401/12801/2560樣品I#$

12、&*樣品II#$&&*樣品III#$&*樣品IV#$*表示100%的細胞病變，#表示50%的細胞病變，$表示25%的細胞病變，&表示12.5%的細胞病變，*表示無細胞病變。中草藥與卵黃抗體復合氣霧劑的最小抑制病毒濃度見表2、表3。從5種病毒7個分型的呼吸道病患常見病毒的抑病毒的實驗結果來看，樣品I除對AdV7作用較弱外，對其它病毒的作用都強于其余樣品。樣品II對病毒的作用相對強于樣品III、樣品IV，而樣品IV對病毒的作用最弱。表2 CB3、CB5、AdV3、AdV7、RSV的最小抑制病毒濃度（g/mL）CB3CB5AdV3AdV7RSV樣品I1/640

13、1/25601/12801/6401/2560樣品II1/3201/6401/6401/12801/1280樣品III1/3201/1601/3201/3201/640樣品IV1/801/1601/6401/3201/320表3 對流感、副流感病毒的最小抑制病毒濃度（g/mL）流感副流感樣品I1/12801/640樣品II1/3201/320樣品III1/801/320樣品IV1/401/1604 討論急性上呼吸道感染有70%80%由病毒引起，實驗所選7種病毒為呼吸道感染最常見的病毒，尤其是合胞病毒，對呼吸道病毒感染具有一定代表性。實驗結果表明，中草藥與卵黃抗體配比為1:1，對各病毒的抑制效果最強。這也合理解釋了其防治呼吸道疾病效果最佳。結果也與先前提高肉雞日增重和飼料轉化效率，促進蛋雞法氏囊發育，有效保護傳染性支氣管炎等實驗一致。本實驗是相同條件下的體外抑病毒試驗，在臨床實際應用中，因給藥途徑、劑量、作用方式的不同，療效自然有一定差異，但早期能及時氣霧吸入，繼之靜點粉針劑，療效應當很好。確切情況還有待臨床實驗進一步驗證。參考文獻：1 樊宏偉，王翔，肖大偉. 喉咽清氣霧劑中甘草酸抑菌、抑病毒及誘生干擾素作用的研究，中國中醫藥科技，2002，9（6）:3433442 胡克