1、中草藥與卵黃抗體復(fù)合氣霧劑體外抑制病毒實(shí)驗(yàn)楊士章1 方希修1* 周根來1龔偉2 陳明1鄧學(xué)兵2 蔡爾問3（1.江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院飼料與營養(yǎng)研究所，泰州，225300;2.江蘇天成保健品有限公司，海安，226613; 3.中國動(dòng)物保健品協(xié)會(huì)，北京，100081）本研究得到江蘇省科技攻關(guān)項(xiàng)目“中獸藥與免疫球蛋白切合防治家禽呼吸道疾病的研究開發(fā)”資金資助，項(xiàng)目編號(hào)：BE2003618 摘 要：將不同配比的中草藥與卵黃抗體復(fù)合氣霧劑體外抑制病毒的能力進(jìn)行比較，以確定中草藥與卵黃抗體的最佳配比。抑病毒實(shí)驗(yàn)采用兩種方法：病毒致細(xì)胞病變抑制實(shí)驗(yàn)和血凝抑制實(shí)驗(yàn)，以產(chǎn)生50%細(xì)胞病變的最高藥物稀釋度或不產(chǎn)

2、生凝血的最小藥物濃度為其最小抑病毒的濃度。樣品I對(duì)腺病毒7型（AdV7）的最小抑制濃度為1/640，作用弱于樣品II，而對(duì)其它病毒的作用都最強(qiáng)。樣品IV除對(duì)腺病毒3型（AdV3）的最小抑制濃度為1/640，對(duì)其余病毒的抑制作用在4種樣品中最弱。體外抑制病毒實(shí)驗(yàn)表明選用1:1配比的復(fù)合氣霧劑最能有效防治呼吸道疾病。關(guān)鍵詞：中草藥；卵黃抗體；氣霧劑；抑病毒 Experiments of restraining virus of complex aerosol of Chinese medicine and yolk antibody in vitro Gong-wei 1, Fang Xi-xiu

3、 1 ,Cai Er-wen3, et al(1. Jiangsu Tiancheng animal healthy product limited company, Hai'an, 226613,2.Jiangsu animal husbandry and veterinarian college, Taizhou, 225300; 3.Chinese animal healthy product association, Beijing, 100081)Abstract: To confirm the best ratio of Chinese medicine and yolk

4、antibody in compound aerosol, the virustatic test among different compound aerosol of Chinese medicine and yolk antibody were compared. Virustatic test includes cytopathic inhibition test of different virus and the inhibition test of TPHA, regarding the 50% tissue culture infectious dose (TCID50) or

5、 the maximum dilution degree at which 50% cytopathic effect can be inhibited as the interferon effect value. The minimum virustatic concentration of sample I for AdV7 is 1/640, which power is less than sample II, but its power for other virus is strongest. Other than the minimum virustatic concentra

6、tion for AdV3 is 1/640, the inhibition to other virus of sample IV is weakest among four samples. The experiment of virustatic in vitro suggest that compound aerosol, which ratio is 1:1, has the best effect on control breath illness.Key words: Chinese medicine; yolk antibody; aerosol; virustatic雞上呼吸

7、道感染是指雞上呼吸道受病原微生物侵襲所致的疾病。雞常見呼吸道病主要由病毒、細(xì)菌和敗血霉形體等引起，其臨床的主要特征為流淚、流鼻涕、咳嗽、氣喘、羅音和呼吸困難、眼腫。中獸藥不僅可用于治療細(xì)菌、鉤端螺旋體、致病性真菌和原蟲感染，還能用于防治病毒感染。本實(shí)驗(yàn)通過比較不同配比的中草藥與卵黃抗體復(fù)合氣霧劑在體外抑制病毒的能力來選擇最佳配比，從而為家禽呼吸道病毒感染的治療提供理論基礎(chǔ)。1 實(shí)驗(yàn)材料1.1 實(shí)驗(yàn)用樣品配制中草藥喘康制劑由江蘇天成保健品有限公司生產(chǎn)，利用超聲波提取其有效成分，經(jīng)過低溫冷凍干燥機(jī)進(jìn)行制成粉劑；卵黃抗體粉劑由江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院飼料與營養(yǎng)研究所制備。實(shí)驗(yàn)樣品為不同配比的中草藥“

8、禽喘康復(fù)散”與卵黃抗體復(fù)合氣霧劑，配比分別為1:1，1:0.8，1:0.5，1:0.2，分別記為樣品I、II、III、IV。提取溶劑為70%乙醇溶液，在水浴上加熱回流提取1h，趁熱過濾，藥渣再重復(fù)提取1次，合并濾液，濃縮至原液濃度為1g/mL，采用間歇法滅菌。1.2 儀器設(shè)備超凈工作臺(tái)，CO2培養(yǎng)箱，96孔培養(yǎng)板，微量滴定板，普通顯微鏡。1.3 實(shí)驗(yàn)用病毒及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)用病毒:柯薩奇病毒3、5型(CB3、CB5)，腺病毒3、7型(AdV3、AdV7)，合胞病毒(RSV)，流感病毒(F)，副流感病毒(P )。實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞：Hep-2細(xì)胞單層培養(yǎng)物。選用9-10d齡雞胚、1%的雞紅細(xì)胞。1.4 組織培養(yǎng)

9、基生長(zhǎng)液為10%小牛血清MEM液，含青、鏈霉素各100IU/mL。維持液為2%小牛血清MEM培養(yǎng)液。2 實(shí)驗(yàn)方法2.1 樣品對(duì)細(xì)胞毒性測(cè)定選用的4種樣品以0.1g/mL為原液，按2n×101倍比稀釋，分別加人已長(zhǎng)成單層Hep-2細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，放37CO2溫箱過夜，觀察各配比制劑對(duì)細(xì)胞的毒性作用，以對(duì)細(xì)胞不產(chǎn)生毒性時(shí)的樣品濃度記為CC0，作為抑病毒實(shí)驗(yàn)的起始濃度。2.2 病毒感染滴度測(cè)定取CB3、CB5、AdV3、AdV7、RSV的新鮮病毒懸液，以10倍遞次稀釋法稀釋成不同稀釋度，分別接種到組織培養(yǎng)單層細(xì)胞管內(nèi)，每管接種100L，每個(gè)稀釋度接種4只細(xì)胞管，使病毒與細(xì)胞充分接觸，

10、37吸附1h，以Hanks液洗3次，加入細(xì)胞維持液，37培養(yǎng)，逐日在普通顯微鏡下觀察記錄細(xì)胞病變情況，觀察15d，測(cè)定組織培養(yǎng)半數(shù)感染量TCID50。本實(shí)驗(yàn)選用不同病毒的100TCID50/0.1mL。2.3 中和實(shí)驗(yàn)將樣品從CC0起作系列倍比稀釋，1樣品與100TCID50的病毒等量相加，搖勻放37水浴作用1.5h，接種到形成單層細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板內(nèi)，同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照、正常細(xì)胞對(duì)照、樣品對(duì)照組，以產(chǎn)生50%細(xì)胞病變的樣品最高稀釋度作為判定結(jié)果。2.4 血凝抑制實(shí)驗(yàn)取96孔培養(yǎng)板，將樣品順序作倍比稀釋至15120，每孔加入4個(gè)單位的血凝素100L等量混合，37作用1h，加入1%雞紅細(xì)胞各100L

11、，搖勻后置室溫30、45各觀察1次結(jié)果，以45為準(zhǔn)。對(duì)照組設(shè)樣品對(duì)照，病毒對(duì)照(分別加入4、2、1、1/2單位血凝素各100L +生理鹽水各100L)、紅細(xì)胞對(duì)照，以上各對(duì)照組再分別加入1%雞紅細(xì)胞100L，搖勻，在相同條件下觀察結(jié)果。以能完全抑制紅細(xì)胞凝集的最小藥物濃度為終點(diǎn)。3 結(jié)果樣品對(duì)細(xì)胞毒性測(cè)定結(jié)果見表1。樣品初始濃度選擇對(duì)Hep-2出現(xiàn)*的濃度，即樣品I為1/640，樣品II為1/320，樣品III為1/160，樣品IV為1/80。表1 樣品對(duì)Hep-2細(xì)胞毒性的作用藥物濃度（g/mL）1/101/201/401/801/1601/3201/6401/12801/2560樣品I#$

12、&*樣品II#$&&*樣品III#$&*樣品IV#$*表示100%的細(xì)胞病變，#表示50%的細(xì)胞病變，$表示25%的細(xì)胞病變，&表示12.5%的細(xì)胞病變，*表示無細(xì)胞病變。中草藥與卵黃抗體復(fù)合氣霧劑的最小抑制病毒濃度見表2、表3。從5種病毒7個(gè)分型的呼吸道病患常見病毒的抑病毒的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，樣品I除對(duì)AdV7作用較弱外，對(duì)其它病毒的作用都強(qiáng)于其余樣品。樣品II對(duì)病毒的作用相對(duì)強(qiáng)于樣品III、樣品IV，而樣品IV對(duì)病毒的作用最弱。表2 CB3、CB5、AdV3、AdV7、RSV的最小抑制病毒濃度（g/mL）CB3CB5AdV3AdV7RSV樣品I1/640

13、1/25601/12801/6401/2560樣品II1/3201/6401/6401/12801/1280樣品III1/3201/1601/3201/3201/640樣品IV1/801/1601/6401/3201/320表3 對(duì)流感、副流感病毒的最小抑制病毒濃度（g/mL）流感副流感樣品I1/12801/640樣品II1/3201/320樣品III1/801/320樣品IV1/401/1604 討論急性上呼吸道感染有70%80%由病毒引起，實(shí)驗(yàn)所選7種病毒為呼吸道感染最常見的病毒，尤其是合胞病毒，對(duì)呼吸道病毒感染具有一定代表性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，中草藥與卵黃抗體配比為1:1，對(duì)各病毒的抑制效果最強(qiáng)。這也合理解釋了其防治呼吸道疾病效果最佳。結(jié)果也與先前提高肉雞日增重和飼料轉(zhuǎn)化效率，促進(jìn)蛋雞法氏囊發(fā)育，有效保護(hù)傳染性支氣管炎等實(shí)驗(yàn)一致。本實(shí)驗(yàn)是相同條件下的體外抑病毒試驗(yàn)，在臨床實(shí)際應(yīng)用中，因給藥途徑、劑量、作用方式的不同，療效自然有一定差異，但早期能及時(shí)氣霧吸入，繼之靜點(diǎn)粉針劑，療效應(yīng)當(dāng)很好。確切情況還有待臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。參考文獻(xiàn)：1 樊宏偉，王翔，肖大偉. 喉咽清氣霧劑中甘草酸抑菌、抑病毒及誘生干擾素作用的研究，中國中醫(yī)藥科技，2002，9（6）:3433442 胡克