1、骨髓間質(zhì)干細(xì)胞結(jié)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白促進(jìn)兔椎間關(guān)節(jié)融合的實(shí)驗(yàn)研究         08-06-28 14:45:00     編輯：studa20             作者：陳為堅(jiān)，李貴濤，羅狄鑫，陳錫然，陳造宏，武光勤，葉偉，李晶【摘要】  目的探索應(yīng)用骨髓間質(zhì)干細(xì)胞結(jié)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白進(jìn)行脊柱前路融合的方法。方法自髂骨抽取骨髓4 ml，在體外擴(kuò)增

2、出自體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞；對(duì)12只新西蘭大白兔經(jīng)前路腹膜外行腰椎間盤切除脊柱融合術(shù)。每只動(dòng)物取3個(gè)脊柱節(jié)段隨機(jī)接受4種移植方法：骨髓間質(zhì)干細(xì)胞、骨形態(tài)發(fā)生蛋白和纖維蛋白膠（A組），骨髓間質(zhì)干細(xì)胞和纖維蛋白膠（B組），骨形態(tài)發(fā)生蛋白和纖維蛋白膠（C組），纖維蛋白膠（D組）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在術(shù)后3個(gè)月處死，利用放射學(xué)和組織學(xué)方法觀察、分析脊柱融合情況。結(jié)果A組的椎間隙骨痂形成明顯較其他組多，組織學(xué)上有連續(xù)的骨痂形成；B組和C組顯示出近似的放射學(xué)和組織學(xué)變化，有不連續(xù)骨痂生成。D組融合效果最差，為纖維肉芽組織填充椎間隙，無(wú)骨痂生成。結(jié)論自體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、纖維蛋白和骨形態(tài)發(fā)生蛋白復(fù)合體在移植入體內(nèi)3個(gè)月后有良

3、好的成骨并初步獲得椎體間融合。 【關(guān)鍵詞】  骨髓間質(zhì)干細(xì)胞； 骨形態(tài)發(fā)生蛋白； 脊柱融合術(shù)脊柱融合術(shù)常用于治療脊柱退變性疾病、椎體滑脫、脊柱畸形等臨床多發(fā)病。融合的材料多數(shù)用自體骨、異體骨和人工骨。這些植入物體積大，須破壞較多的機(jī)體組織以獲得良好的手術(shù)暴露，而且并發(fā)癥多、費(fèi)用高。因此開發(fā)具有良好生物學(xué)活性的可注射式植骨替代材料，改開放手術(shù)為微創(chuàng)手術(shù)是臨床研究的熱點(diǎn)。研究表明骨髓間質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells,MSCs）經(jīng)骨形態(tài)發(fā)生蛋白誘導(dǎo)可分化成骨細(xì)胞，作者探討應(yīng)用骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、牛骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bovine bone morphogenic prote

4、in,bBMP）與纖維蛋白膠（fibrin glue，F(xiàn)G）的混合物作為骨移植材料，通過(guò)與單純使用纖維蛋白膠、bBMP和MSCs比較來(lái)評(píng)價(jià)這種移植材料的成骨效果，以期為微創(chuàng)手術(shù)下行椎間融合提供參考1、2。    1  材料與方法    1.1  主要試劑和儀器    新西蘭大白兔購(gòu)自中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；胎牛血清（FBS）、DMEM培養(yǎng)基、及胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；纖維蛋白原、凝血酶抑肽酶（哈爾濱翰邦醫(yī)療科技有限公司），無(wú)菌液態(tài)bBMP（廣州陸軍總院提供）。 &

5、#160;  1.2  方法    （1）兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)：健康10周齡新西蘭大白兔12只，雌雄不限，各兔耳朵打孔標(biāo)志，自脛骨粗隆處抽取骨髓4 ml，加入DHanks液搖勻，細(xì)胞懸液按11.5比例加到細(xì)胞分離液上層進(jìn)行密度梯度離心（2 500 r/min，20 min）。小心吸取富含有核細(xì)胞的中間細(xì)胞層（富含骨髓基質(zhì)細(xì)胞），以DHanks液吹打洗滌細(xì)胞離心清除分離液后，分3份加入含有DMEM培養(yǎng)液（含20%胎牛血清、10 mgL谷胺酰胺）的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中分別培養(yǎng)，7 d后換液，后每3 d換液1次，直至貼壁細(xì)胞鋪滿整個(gè)培養(yǎng)孔的底面。用0.25

6、胰酶消化傳代，并作細(xì)胞計(jì)數(shù)。    （2）bBMP與FG復(fù)合載體的制備：無(wú)菌操作下在纖維蛋白膠的抑胰肽酶溶液內(nèi)分別加入液態(tài)bBMP，混合纖維蛋白膠溶液各成分聚合為FG，最終bBMP的濃度為20 mgml，將FG注射入12支無(wú)菌離心管中，4 冰箱保存3；另取24支離心管分別注入FG，4 冰箱保存。    （3）MSCs與FG復(fù)合物的制備：FG于紫外線下照射消毒1 h，分別加入各兔上述培養(yǎng)的傳代3次以內(nèi)的MSCs懸液，混勻,標(biāo)志。將細(xì)胞離心后，去上清，使其懸浮于膠原bBMPDMEM混合液和膠原DMEM中，調(diào)整細(xì)胞終濃度約為5×1

7、06/mL。    （4）手術(shù)方法：新西蘭大白兔體重約1.52.5 kg。用氯胺酮行靜脈麻醉后，無(wú)菌操作下，在左側(cè)腰大肌前緣做1個(gè)長(zhǎng)約10 cm縱切口，腹膜后鈍性分離暴露橫突，沿橫突前方推開腰大肌與腹膜，橫突后方推開椎旁肌達(dá)橫突根部，咬斷橫突，可見(jiàn)L3、4、L4、5、L5、6椎間盤和相應(yīng)的椎體。銳刀從側(cè)方切開椎間盤纖維環(huán)，并保留椎間盤前后纖維環(huán)。利用刮匙刮出椎間盤和部分軟骨終板，梭形小磨鉆打磨去軟骨終板，至顯露骨性終板，刮匙探查椎間盤見(jiàn)無(wú)軟骨和髓核殘留。用椎間盤撐開器撐開椎間隙，在L36 3個(gè)椎間隙中分別隨機(jī)注射入4種FG凝膠中的3種，（所移植的細(xì)胞為各兔自體細(xì)胞

8、），松開間盤撐開器將植入物自然溢出椎間盤外，紗布拭去溢出外面之蛋白膠。每盤約可注射凝膠0.080.1 ml。徹底止血后逐層縫合手術(shù)切口。術(shù)后，肌注青霉素40萬(wàn)U，2次d，連續(xù)3 d，籠養(yǎng)，常規(guī)飲食，不限制活動(dòng)。    （5）X線片檢查和組織學(xué)觀察：術(shù)后即時(shí)、術(shù)后3個(gè)月攝正、側(cè)位X線片檢查，3個(gè)月時(shí)加拍極度前屈后伸位X線片；于12周時(shí)處死動(dòng)物，沿椎體邊緣切取椎間盤內(nèi)組織塊，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察。    （6）統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：數(shù)據(jù)用x-±s來(lái)表示,用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，用ANOVA分析比較4組試驗(yàn)數(shù)值之間有

9、無(wú)差異，P0.05為差異有顯著性意義。    2  結(jié)果    2.1  培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征    培養(yǎng)細(xì)胞在平板上生長(zhǎng)，接種12 h后即可貼壁，第2 d細(xì)胞成梭形，但較短粗，形似成纖維細(xì)胞。4 d時(shí)細(xì)胞的形態(tài)為梭形、多角形，細(xì)胞伸出細(xì)長(zhǎng)的突起，生長(zhǎng)活躍，78 d就基本鋪滿瓶底，排列無(wú)規(guī)律。傳代后的細(xì)胞在24 h內(nèi)貼壁,貼壁細(xì)胞很快鋪展,呈簇狀分布,較原代細(xì)胞體積變大,呈不規(guī)則的多角形,有短而薄的胞質(zhì)突起，細(xì)胞核圓形或橢圓形。    2.2  動(dòng)

10、物組織學(xué)觀察    術(shù)后12周時(shí)A組組織塊內(nèi)出現(xiàn)了大量的編織骨，網(wǎng)狀骨小梁，新生骨組織連接前縱韌帶后方的上下終板之間，近椎間盤中心也有少量骨痂形成。B組和C組可見(jiàn)前縱韌帶后方有編織骨形成，骨量少，不連續(xù)。D組見(jiàn)纖維組織增生及少量成骨細(xì)胞，未見(jiàn)新骨形成。各組均未見(jiàn)纖維蛋白膠殘留，椎間盤中有少量椎間盤髓核殘余、中間有少量軟骨組織形成（圖13）。    2.3  影像學(xué)結(jié)果    第12周時(shí)X線片檢查結(jié)果各兔均未造成椎體后緣增生，無(wú)椎管狹窄，經(jīng)ANOVA分析和t檢驗(yàn)，節(jié)段活動(dòng)度A組與B組、C組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），B組與C組之間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）,B組、C組與D組之間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；椎體后緣高度丟失統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示A、B、C和D組組間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（