1、    腎炎3號方對腎小球系膜細胞增殖影響的實驗研究        摘要：用不同中藥喂家兔后取其血清加入系膜細胞培養液中觀察其生長情況，結果表明腎炎3號方可抑制正常及病理狀態下腎小球系膜細胞增殖，有非常顯著性差異（P0.01），透射電鏡觀察也支持上述結果。說明腎炎3號方可抑制腎小球系膜細胞增殖，對以系膜增生為主的慢性腎炎有很好治療作用。關鍵詞：腎炎3號方；腎小球系膜細胞；慢性腎炎中分類號：R285.5 Experimental Research on the Effect o

2、f Nephritis Prescription on the Proliferation of Mesangial CellJiang Dexun(姜德訓), Huang Wenzheng(黃文政), Yang Hongtao(楊洪濤), et al.(General Hospital of Beijing Military Region, Beijing 100700)After feeding rabbits with different Chinese medicines, the serum were taken into the culture fluid of mesangial

3、 cell whose growth was observed then.The results showed that the prescription could inhibit the proliferation of mesangial cells under both normal and pathological state, the difference was markedly (P<0.01). It was also supported by the observation through transmission electron microscope. It in

4、dicated that the prescription could treat the chronic nephritis mainly in mesangial proliferation.KEY WORDS: Nephritis prescription ; Mesangial cell; Chronic nephritis慢性腎炎是由多種原因誘發，多種病理類型組成的原發于腎小球的免疫性疾病，在其早期均伴有系膜細胞增殖，系膜細胞異常增殖及其繼發的炎癥介質釋放細胞外基質積聚是導致腎小球硬化加重慢性腎炎的中心環節之一1。我們臨床應用腎炎3號方治療慢性腎炎104例，取得了完全緩解率33.4，

5、總有效率8864的良好療效，并經系膜增殖性腎炎家兔、IgA腎病小鼠等模型得到驗證且進行了相關機理探討。本研究的目的就是在前期工作基礎上進一步探討腎炎3號方對腎小球系膜細胞的影響及有關機理，從而為該方治療慢性腎炎提供新的理論依據。1材料與方法1.1動物選擇純系SD大鼠，雌雄不限，體重150200 g；純種大耳白兔，雌雄不限，體重2.02.5 g。以上動物由國家醫藥管理局天津藥物研究院實驗動物室提供。1.2藥物選擇雷公藤片由湖北省黃石市制藥廠提供，批號960505；腎炎3號口服液由柴胡、黃芩、黨參、山萸肉、益母草、白花蛇舌草等組成，藥物按比例稱后，水煎、過濾至每毫升煎液含生藥2.5 g，裝入瓶中密

6、封，由天津中醫學院第一附屬醫院藥劑室提供。1.3主要儀器及試劑倒置顯微（日本Nikon）、透視電鏡(Philips)、膠原酶V（美國Sigma）、MTT（美國Sigma）1.4動物模型的制備及分組2取純種大耳白兔25只，隨機分為5組。56腎切除組：大耳白兔乙醚吸入麻醉，消毒后，腹部正中切口，暴露腎臟，剝離腎被膜，右腎結扎切除，左腎切除上下兩極后明膠海綿止血，關閉腹腔。雷公藤組：雷公藤片先用蒸餾水溶解后，按成人每日kg用量的15倍分2次灌胃，連續10 d至采血日期。單純喂腎炎3號組：用法同上。56腎切除前喂腎炎3號組：預先喂腎炎3號口服液，至第10日行56腎切除。空白對照組：未行特殊處理。1.5

7、動物血清的制備2含促腎因子血清的制備：單純56腎切除組及56腎切除前喂腎炎3號組均在術后48 h心臟取血，分離血清，0.45 um微孔濾膜過濾除菌，56,30 min滅活，-20冰箱保存。雷公藤組及腎炎3號組均在最后1次灌胃后2 h內心臟取血，同時取空白對照組血，余步驟同前。1.6腎小球系膜細胞的培養及鑒定3 無菌取SD大鼠雙腎，將腎皮質剪成碎片，研磨，過篩，收集腎小球，膠原酶V消化，完全培養液（RPMI1640)丙酮酸鈉，HEPES，青霉素，鏈霉素，胎牛血清，胰島素，并用NaHCO3調pH至7.17.4。以下除血清外同。懸浮并種植于細胞板內，37,5%CO2條件下培養4周左右系膜細胞布滿板底

8、時，用胰蛋白酶及EDTA消化并轉種培養，經倒置顯微鏡、透射電鏡證實為系膜細胞，第二代細胞用于實驗。1.7實驗分組空白對照組含3正常兔血清；雷公藤組含3雷公藤血清；病模組含3促腎因子血清；觀察組含3腎炎3號血清；治療組含3腎炎3號及促腎因子血清。1.8腎小球系膜細胞增殖的檢測4系膜細胞以1×104孔接種于96孔板內，24 h后換成無血清的培養液，繼續孵育48 h，使細胞同步于靜止期，棄上清，然后加入正常兔血清、單純藥物血清、促腎因子血清及含促腎因子和腎炎3號的血清（均為3%濃度），再以胎牛血清補齊完全培養液，使血清濃度達10%。37，5%CO2條件下孵育48 h，1500 r/min離

9、心10 min，棄上清，用濾紙吸干，加入0.5 g/L MTT液50 U/孔，振蕩1 min, 37，5%CO2條件下培養4 h,1500 r/min離心5 min，棄上清，加入1：300的鹽酸異丙醇振蕩3 min,酶標儀上測OD值，波長為570 nm。1.9腎小球系膜細胞組織學觀察腎小球系膜細胞經3%戊二醛和1%鋨酸雙固定，丙酮酸梯度脫水，Epon 812樹脂包埋，LKB-V超薄切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色，Philps,Em400-ST電鏡觀察腎小球系膜細胞超微結構。1.10統計學處理方法采用單因素方差分析法進行統計學處理。2實驗結果2.1腎小球系膜細胞增殖的測定結果結果見表1。結果

10、顯示：(1)觀察組、雷公藤組及病模組與空白對照組比較有非常顯著性差異（P<0.01），觀察組與雷公藤組比較無顯著性差異(P.0.05)。說明腎炎3號血清和雷公藤血清均有抑制正常腎小球系膜細胞增殖作用，而從抑制趨勢看，腎炎3號方更強于雷公藤；含促腎因子血清有促進正常腎小球系膜細胞增殖作用。(2)治療組與病模組比較有非常顯著性差異(P<0.01)。說明腎炎3號血清可抑制促腎因子誘發的腎小球系臘細胞增殖。表1腎炎3號方對腎小球系膜細胞增殖的影響 （<"xx1 (49 bytes)" src="/med/cano/201003/2010032419224

11、9980" 8 9>±s）組別n吸光度值/OD值空白對照組7 0.388±0.028雷公藤組 7 0.309±0.034觀察組 70.296±0.013病模組 70.434±0.017治療組 70.355±0.040*     注：*與空白對照組比較P<0.01； *與病模組比較P<0.01 2.2腎小球系膜細胞透射電鏡觀察結果空白對照組可見細胞外形不規則，表面有數量較多的微絨毛；胞漿中細胞器不甚豐富，可見粗面內質網（Esr），核糖體（Ri），為數不多的線粒體（Mi）

12、和少許脂滴（L），并可見少量囊泡狀次級溶酶體（Ly），胞核不規則圓形，雙核膜清晰，染色質分布稀疏，均勻，著色淺淡。雷公藤組可見不規則胞突，稀疏的微絨毛，少許脂滴和大量空泡狀的Ly。觀察組：梭形胞體表面可見少量分布稀疏的微絨毛；胞核卵圓形，著色淺淡，核膜凹突呈向日葵樣；胞漿中充滿大小不等，密度不一的Ly。病模組可見核圓、色淡；胞體表面可見少量微絨毛；胞漿中Mi、Esr形態正常，滑面內質網散在，Ly體積和數量中等。治療組可見梭形細胞表面微絨毛稀少，核長卵圓形，表面有切跡，胞漿中L（+），Ly（+）。說明腎炎3號血清對正常及病理狀態下腎小球系膜細胞均有抑制生長作用，而含促腎因子血清可刺激正常腎小球系

13、膜細胞生長。3討論系膜組織是腎小球毛細血管之間的間質組織，主要由腎小球系膜細胞和細胞外基質組成。已知系膜細胞有兩種5：一種是來源于毛細血管壁的間皮細胞，形態和特征類似于平滑肌細胞，現認為這類細胞是腎小球系膜區的基本構成細胞，稱為原始系膜細胞；另一種是骨髓源性并表達MHC類抗原，類似于單核-巨噬細胞的系膜吞噬細胞，一般認為慢性腎炎的系膜細胞增殖主要以后者為主。系膜細胞具有收縮、增殖、吞噬、抗原提呈作用，其增殖乃至胞外基質擴張是慢性腎炎組織學最主要特征，為此探討腎小球系膜細胞增殖抑制因素將可能為慢性腎炎微觀辨證及治療提供新的理論依據。 腎炎3號方在臨床運用及動物實驗中都得到了有效驗證并進行了生理、

14、病理、生化、免疫學等機理探討。本實驗正是為了進一步探討腎炎3號方治療慢性腎炎的細胞生物學機理，選用雷公藤和促腎因子作為對照組，因為雷公藤是臨床常用的免疫抑制劑，其對體液免疫和細胞免疫均顯示抑制作用。而5/6腎切除模型可產生促腎因子并明顯刺激系膜細胞生長2，這樣就能從促進和抑制兩個方面全面探討腎炎3號方對腎小球系膜細胞增殖的影響。我們的研究表明腎炎3號方對腎小球系膜細胞的抑制作用不僅發生于正常大鼠的細胞，而且發生于伴有促腎因子存在條件下的細胞，透射電鏡也觀察到類似結果，而且從抑制趨勢看腎炎3號方更強于雷公藤。已知被激活的系膜細胞其表面膜受體與相應細胞因子結合，經酶的作用，使一種磷酸前體分解，胞漿

15、內產生第二信使如cAMP、DAG（甘油二脂）等作用于核內產生轉錄因子，后者再作用于DNA有關成分，促進核分裂或影響某種相關基因，產生新的蛋白質，使細胞表型轉換，分泌相關細胞因子，形成正反饋調節6。系膜細胞可自分泌IL-1、IL-6、TNF、PAF等并接受上述炎癥介質的刺激而活化、收縮、增殖7。我們同期實驗結果也觀察到腎炎3號方可抑制系膜細胞產生IL-1、IL-6、TNF、PAF。腎炎3號方抑制腎小球系膜細胞增殖的體外機理可能通過以下環節來實現：直接抑制系膜細胞，降低細胞因子的合成和分泌；刺激系膜細胞膜受體脫落，增加可溶性細胞因子受體，中和游離細胞因子活性；抑制系膜細胞信號傳導放大，減少相關細胞

16、因子合成，至于詳細機理有待進一步觀察。天津市科委資助課題姜德訓，男，36歲，醫學碩士，主治醫師姜德訓（北京軍區總醫院北京100700）黃文政（天津中醫學院第一附屬醫院天津300192）楊洪濤（天津中醫學院第一附屬醫院天津300192）賈海驊（中國中醫研究院中醫基礎理論研究所北京100700）李建東（北京軍區總醫院北京100700）王侖（北京軍區總醫院北京100700）李慶（北京軍區總醫院北京100700）參考文獻1.李曉玫，戴振華，王海燕. 腎小球系膜細胞增殖抑制因子. 國外醫學*泌尿系統分冊， 1997，17（1）： 31342.蔣工偉，陳香美，黎磊石. 大黃對體外腎小球系膜細胞生長的影響. 中華腎臟雜志， 1990，6（3）： 1