1、LOGOThe Advances in Research of the Transgenic Plants with Safe or No Selection Markers小組成員：竇富強、鄢苗、張哲、張作林小組成員：竇富強、鄢苗、張哲、張作林指導老師：張椿雨指導老師：張椿雨 教授教授安全選擇標記和無選擇標記安全選擇標記和無選擇標記轉基因技術研究進展轉基因技術研究進展引言引言v轉基因植物的形成過程（以Bt抗蟲棉為例）： 在這個過程中，為了提高在這個過程中，為了提高對轉化細胞的篩選效率，我們對轉化細胞的篩選效率，我們不可避免地引入了不可避免地引入了 M Marker Gene ，如圖中的抗生素

2、基因。，如圖中的抗生素基因。引言引言 （一）轉基因技術的發展及意義 改良遺傳性狀（二）轉基因技術的現狀 標記基因轉化后仍留在植物體，植物及環境安全性能否能到保障？ 為此，科學家們提出了無標記轉基因作物（Marker-Free Transgenic Plants，MFTPs）的概念。目錄目錄標記基因的潛在危害安全篩選標記技術MFTPS獲得途徑一、標記基因的潛在危害一、標記基因的潛在危害（1）安全性安全性：antibiotic resistance（抗生素抗性標記基因）（抗生素抗性標記基因） ： cross talk （水平轉移）、（水平轉移）、 gene escape（基因逃逸）（基因逃逸）he

3、rbicide resistance（除草劑抗性標記基因）：（除草劑抗性標記基因）： ecological risk（2）影響轉化細胞再生影響轉化細胞再生（3）影響多重轉化影響多重轉化二、安全篩選標記技術二、安全篩選標記技術2.1 基因正向選擇基因正向選擇（Positive Selection）的安全標記基因的安全標記基因（1）與激素生物合成有關的基因）與激素生物合成有關的基因異戊烯基轉移酶基因ipt和吲哚-3-乙酰胺水解酶基因IaaH。（2）與糖類代謝有關的基因）與糖類代謝有關的基因與糖類代謝有關的基因主要包括甘露糖磷酸異構酶基因pmi，木糖異構酶基因xylA和核糖醇操縱子rtl。（3）與氨

4、基酸代謝有關的基因）與氨基酸代謝有關的基因l 主要有D-氨基酸氧化酶(DAAO)和天冬氨酸激酶(AK)等。l 細菌的ak基因對賴氨酸和蘇氨酸并不敏感。二、安全篩選標記技術二、安全篩選標記技術2.2 基于負向選擇的安全標記基因基于負向選擇的安全標記基因 利用來源于植物的基因（如菠菜BADH基因）作為選擇標記基因，該基因所編碼的甜菜堿脫氫酶將有毒的甜菜堿醛轉化為無毒的甜菜堿。2.3 基于可視化選擇的安全標記基因基于可視化選擇的安全標記基因 維多利亞水母中分離出的綠色熒光蛋白(GFP)二、安全篩選標記技術二、安全篩選標記技術2.4 該技術的優缺點：該技術的優缺點：l ipt 基因 優點：高水平有利于

5、轉化植物的再生，提高轉化率。 缺點：ipt的低水平表達會導致植物表型的反常變化，如植物出現莖不伸長，側根難以形成等一系列不正常的發育現象；l GFP基因 優點：能夠對轉化細胞進行可視化觀察，方法靈活，范圍廣泛，檢測快捷，使用方便。 缺點：野生型GFP發光較弱，熒光反應也不是酶反應，且不能通過添加某些物質來加強信號,更不易對熒光進行定量檢測。另外，GFP基因在植物細胞內的表達頻率并不高，甚至在某些植物細胞中并不表達。三、三、MFTPS 獲得途徑獲得途徑First approach：excise or segregate a marker gene from a target geneSecond

6、 approach：overexpression of the isopentenyl transferase (ipt) gene無標記轉基因植物無標記轉基因植物（Marker-free Transgenic Plants，MFTPS）三、三、MFTPS 獲得途徑獲得途徑3.1 Excise a marker gene( (標記基因移除標記基因移除) ) 技術流程：技術流程： 利用通常的選擇標記篩選出初級轉基因植株，然后利用轉基因植株后代遺傳重組使選擇標記與目的基因分離，或利用位點特異性酶將標記基因切除而培育無選擇標記的轉基因植株。 標記移除技術標記移除技術：co-transformatio

7、n(共轉化)homologous recombination（同源重組)site-specific recombination system(位點特異性重組系統)transposes mediated reorientation(轉座子介導的再定位系統) multi-auto-transformation vector(MAT載體系統)tissue specific expression(組織特異性表達）三、三、MFTPS獲得途徑獲得途徑3.1.1 Co-transformation（共轉化）（共轉化）農農桿桿菌菌介介導導三、三、MFTPS獲得途徑獲得途徑3.1.1 Co-transforma

8、tion（共轉化）（共轉化）無標記基因無標記基因三、三、 MFTPS獲得途徑獲得途徑3.1.1 Co-transformation無標記基因無標記基因三、三、 MFTPS獲得途徑獲得途徑 目前對煙草、擬南芥、水稻、玉米、油菜、大豆、小麥等都已成功目前對煙草、擬南芥、水稻、玉米、油菜、大豆、小麥等都已成功。不適于馬鈴薯、甘蔗等無性繁殖植物，不適于多年生植物。不適于馬鈴薯、甘蔗等無性繁殖植物，不適于多年生植物。3.1.1 Co-transformation（共轉化）（共轉化）應用實例應用實例三、三、 MFTPS獲得途徑獲得途徑 3.1.2 Homologous Recombination（同源重組

9、）（同源重組） 同源重組發生在同源重組發生在DNA的同源序列之間，只要兩條的同源序列之間，只要兩條DNA序列相序列相同或相近，重組就可以在此序列中的任何一點發生。同或相近，重組就可以在此序列中的任何一點發生。 3.1.2 Homologous Recombination（同源重組）（同源重組） 用選擇標記進行篩選并獲得轉基因植株后，再重新導入一段序列，使標記基因置于2個DNA同源序列之間，通過染色體內重組將含有選擇標記的DNA片段去除，獲得MFTPS。三、 MFTPS獲得途徑獲得途徑基基因因打打靶靶三、 MFTPS獲得途徑獲得途徑成功地應用于動物和微生物，植物上尚處于探索階段。3.1.2 Ho

10、mologous Recombination（同源重組）應用實例（同源重組）應用實例三三、 MFTPS獲得途徑獲得途徑 該方法利用重組酶催化2個短的特定DNA序列間的重組，將位于這兩個短DNA序列中間的選擇標記基因篩除，獲得無選擇標記轉基因植物。已發現的位點特異性重組系統包括Cre/loxp、FLP/FRT、R/RS和Gin/gix、attp等5種。3.1.3 Site-specific Recombination System（位點特異性重組）（位點特異性重組） Cre/loxP系統是目前位點特異性重組系統中研究較多的一種，其原理是將標記基因構建于2個同向重復的lox位點(34 bp)之間，

11、將目的基因構建于lox位點之外。在獲得轉基因植株后,再誘導植株體內Cre基因的表達，將位于lox位點之間的選擇標記基因切除。 （王賀偉等，2013）三三、 MFTPS獲得途徑獲得途徑3.1.3 Site-specific Recombination System（Cre/loxP）三三、 MFTPS獲得途徑獲得途徑 Cre重組酶介導兩個LoxP位點間的重組是一個動態、可逆的過程，可以分成三種情況：v1、如果兩個LoxP位點位于一條DNA鏈上，且方向相同，Cre重組酶能有效切除兩個LoxP位點間的序列；v2、如果兩個LoxP位點位于一條DNA鏈上，但方向相反，Cre重組酶能導致兩個LoxP位點間

12、的序列倒位；v3、如果兩個LoxP位點分別位于兩條不同的DNA鏈或染色體上，Cre酶能介導兩條DNA鏈的交換或染色體易位。3.1.3 Site-specific Recombination System（Cre/loxP）三三、MFTPS獲得途徑獲得途徑3.1.3 Site-specific Recombination System（Cre/loxP）三三、MFTPS獲得途徑獲得途徑3.1.3 Site-specific Recombination System應用實例：應用實例： Andrew等以pART27為骨架構建了一個ART54-PCre-1去標記系統，其中pART54載體TDNA中含

13、一個uidA報告基因，一個nptII選擇標記基因和一個指示刪除反映的負標記基因codA，PCre載體是一個含有Cre基因和hpt基因的雙元載體。 Luo等開發的基于該系統的“基因刪除(GM-Gene-Deletor)”技術（2007），以高效的外源基因刪除效率成功應用于煙草、玉米(Zea mays)和油菜(Brassica，napus)等經濟植物。三三、 MFTPS獲得途徑獲得途徑3.1.4 Transposes Mediated Reorientation（轉座子系統）（轉座子系統） 通過轉座酶的轉座作用實現基因重組，轉座子由自主成員和非自主成員兩部分組成，如玉米的Ac/Ds系統，其自主成員

14、Ac基因編碼轉座酶用于自身和非自主成員Ds基因的轉座。非自主成員是由自主成員缺失了某些序列后所形成的，不具備合成轉座酶的能力。非自主成員兩端有數百個核苷酸是必需的，中間可換成或插入較大的外源基中間可換成或插入較大的外源基因因，而插入外源基因的非自主成員仍能同自主成員一起被轉座酶轉移。把標記基因置于整個轉座子的外部，目的基因將設于非自主成員內部，轉化后植物可通過轉座作用將二者分離，最后分離出無標記的轉基因后代。三三、 MFTPS獲得途徑獲得途徑3.1.4 Transposes Mediated Reorientation應用實例：應用實例： 金維正等（2003）， 利用了Ac/Ds轉座系統獲得了

15、無選擇標記基因的轉基因水稻；（目的基因轉座） Ebinuma等（1997）和CotsafIis等（2002），就是采用標記基因轉座，得到了高轉化頻率且僅含有目的基因的轉基因煙草和水稻。（標記基因轉座）三三、 MFTPS獲得途徑獲得途徑 該方法將選擇標記基因同位點特異重組R/RS體系或玉米的轉座元件進行整合，利用特異性重組或轉座將轉化細胞中的標記基因剔除。3.1.5 Multi-auto-transformation (MAT)載體系統載體系統三、MFTPS獲得途徑獲得途徑l R/RS是從酵母中獲得另外一種位點特異性重組系統。重組酶基因切除與之相鄰位于重組位點RS之間的DNA片段。將選擇標記基因

16、位于RS之間，而目的基因位于RS區域外。 l sugit等報道了兩步法轉化煙草，MAT載體中R重組酶由來源于玉米的化學誘導啟動子谷膚甘膚-s-轉移酶(GST-n-27)啟動，轉基因植株培養添加外源除草劑的解毒劑SafenerR29148即可激活，R重組酶的將篩選標記iPt切除，從而高效獲得無篩選標記的轉基因植物(圖3)。經過二次篩選，獲得大量的單拷貝、無篩選標記且表型正常的植株。3.1.5 Multi-auto-transformation (MAT)載體系統應用載體系統應用 3.1.6 Tissue Specific Expression（組織特異性）（組織特異性） 利用一個能在時間或空間上

17、起控制作用的組織特異性表達的啟動子（如G10-90、AoPRLl、AFP啟動子等）調控選擇標記基因在轉化位點的表達，即使選擇標記基因只在早期篩選時表達，而在轉基因植株生長過程中不表達，也可能在成熟植株中獲得不表達選擇標記基因的轉化體。 在食用植物上有重要的應用價值，例如定向刪除果實、菜葉等食用器官中的標記基因，以降低對人體健康的影響。三、MFTPS獲得途徑獲得途徑三、MFTPS獲得途徑獲得途徑 3.1.6 Tissue Specific Expression（組織特異性）（組織特異性） 應用實例應用實例A、腫瘤特異性調控元件調控基因表達腫瘤特異性調控元件調控基因表達 許多腫瘤都有其自身特異性的

18、標志物，即腫瘤相關抗原。將治療治療基因置于這類抗原的順式調控元件（如啟動子、增強子）的調控之下基因置于這類抗原的順式調控元件（如啟動子、增強子）的調控之下，可以使目的基因在相應的腫瘤細胞中獲得高表達，正常細胞由于缺乏與該順式調控元件相應的轉錄激活因子等原因而不表達該基因。B B、組織特異性調控元件調控基因表達、組織特異性調控元件調控基因表達 這類調控元件調控元件與腫瘤特異性調控元件并沒有嚴格的界限，外源基因在組織特異性啟動子調控下，可使基因治療局限于發生癌變的組織和基因治療局限于發生癌變的組織和器官中器官中，而不至于給其它組織帶來損害。 例如：Selvakumaran等 從鼠卵巢中分離得到462bp的卵巢特異性啟動子，并用于卵巢癌的基因治療。 3.2 Marker-free Mransformation(無標記轉化）的轉化技術無標記轉化）的轉化技術 左鍵儒等發現在擬南芥中可利用化學調控(chemical-inducible),DNA位點切除(site-specific DNA excision system)調控 Cre/loxP 載體DNA 重組系統。重組酶的表達受雌激素載體融合XVE反式激活因子嚴格控制。被感應到的-雌二醇，可標記編碼序列，Cre和兩個loxP端夾住的XVE從擬南芥的基因組移除。 Sum等在擬南芥基因組中發現7個基因