1、會計學1實驗三血清實驗三血清球蛋白的分離純化及鑒定七年球蛋白的分離純化及鑒定七年制制第一頁，編輯于星期一：十九點 四十四分。【實驗目的實驗目的】1 1學習鹽析法、凝膠層析和離子交換層析分離純學習鹽析法、凝膠層析和離子交換層析分離純 化蛋白質的基本原理及應用化蛋白質的基本原理及應用2 2掌握醋酸纖維薄膜電泳技術的原理及應用掌握醋酸纖維薄膜電泳技術的原理及應用3 3了解蛋白質分離純化的總體思路了解蛋白質分離純化的總體思路第1頁/共40頁第二頁，編輯于星期一：十九點 四十四分?！緦嶒灧椒▽嶒灧椒ā?一、鹽析法粗分一、鹽析法粗分-球蛋白球蛋白 二、凝膠過濾方法脫鹽二、凝膠過濾方法脫鹽 三、離子交換層析

2、方法純化三、離子交換層析方法純化-球蛋白球蛋白 四、醋酸纖維素薄膜電泳法鑒定四、醋酸纖維素薄膜電泳法鑒定-球蛋白的純度球蛋白的純度第2頁/共40頁第三頁，編輯于星期一：十九點 四十四分。【基本原理基本原理】 蛋白質的分離、純化及鑒定蛋白質的分離、純化及鑒定是研究蛋白質化學性質及是研究蛋白質化學性質及生物學功能的重要手段之一。生物學功能的重要手段之一。 不同蛋白質的不同蛋白質的分子量、溶解度分子量、溶解度及在一定條件下，及在一定條件下，帶電帶電的情況的情況等都有所不同。利用這些性質的差別，可分離等都有所不同。利用這些性質的差別，可分離純化各種蛋白質。純化各種蛋白質。第3頁/共40頁第四頁，編輯于

3、星期一：十九點 四十四分。分離蛋白質的方法分離蛋白質的方法分離方法分離方法沉淀法沉淀法鹽析法鹽析法有機溶劑沉淀法有機溶劑沉淀法層析法層析法 電學法電學法電泳法電泳法等電聚焦等電聚焦超速離心法超速離心法離子交換層析離子交換層析吸附層析吸附層析凝膠過濾（分子篩凝膠過濾（分子篩）親和層析親和層析在分離純化時，根據情況選用幾種方法，相互在分離純化時，根據情況選用幾種方法，相互配合才能達到分離純化一種蛋白質的目的。配合才能達到分離純化一種蛋白質的目的。第4頁/共40頁第五頁，編輯于星期一：十九點 四十四分?！净驹砘驹怼?本實驗采用本實驗采用硫酸銨鹽析、葡聚糖凝膠過濾硫酸銨鹽析、葡聚糖凝膠過濾、離

4、子交換層析、離子交換層析方法，分離純化血清方法，分離純化血清-球蛋球蛋白。最后用白。最后用醋酸纖維素薄膜電泳法醋酸纖維素薄膜電泳法鑒定鑒定-球蛋白的純度。球蛋白的純度。 第5頁/共40頁第六頁，編輯于星期一：十九點 四十四分。7分段鹽析去除雜蛋白分段鹽析去除雜蛋白凝膠層析脫凝膠層析脫鹽鹽交聯葡聚糖吸水濃縮交聯葡聚糖吸水濃縮醋酸纖維素薄膜電泳鑒定醋酸纖維素薄膜電泳鑒定離子交換層析純化離子交換層析純化第6頁/共40頁第七頁，編輯于星期一：十九點 四十四分。 鹽析法是根據不同蛋白質在不同濃度的中鹽析法是根據不同蛋白質在不同濃度的中性鹽溶液中性鹽溶液中溶解度溶解度不同，分別析出，達到彼此分不同，分別析

5、出，達到彼此分離的方法。離的方法。 本實驗在本實驗在半飽和硫酸銨半飽和硫酸銨溶液中，清蛋白溶溶液中，清蛋白溶解，解，球蛋白將沉淀球蛋白將沉淀析出，經離心所得的沉淀即析出，經離心所得的沉淀即為球蛋白的粗提液。為球蛋白的粗提液。第7頁/共40頁第八頁，編輯于星期一：十九點 四十四分。優點：優點：蛋白質不變性，常用。蛋白質不變性，常用。第8頁/共40頁第九頁，編輯于星期一：十九點 四十四分。鹽析步驟鹽析步驟取離心管一支加入血清取離心管一支加入血清 2ml加入加入2ml 0.9%氯化鈉搖勻氯化鈉搖勻邊攪拌混勻邊緩慢滴加飽和邊攪拌混勻邊緩慢滴加飽和(NH4)2SO4 4ml上清液（主要含清蛋白）傾去上清

6、液（主要含清蛋白）傾去靜置靜置10min，再離心（，再離心（5000轉轉/分）分）10min沉淀用沉淀用1ml 0.9%氯化鈉攪拌溶解氯化鈉攪拌溶解逐滴加飽和逐滴加飽和(NH4)2SO4 2ml, ,搖勻搖勻靜置靜置10min，再離心（，再離心（5000轉轉/分）分）10min傾棄上清液（主要含傾棄上清液（主要含、球蛋白）球蛋白）沉淀即為初步純化的沉淀即為初步純化的球蛋白球蛋白加入加入磷酸緩沖液（磷酸緩沖液（pH=6.3)1ml溶解溶解球蛋白球蛋白粗提液粗提液第9頁/共40頁第十頁，編輯于星期一：十九點 四十四分。 欲去除鹽析法分離得到的球蛋白粗提液中大量鹽欲去除鹽析法分離得到的球蛋白粗提液中

7、大量鹽，通常有兩種方法：，通常有兩種方法： 凝膠層析法、透析凝膠層析法、透析本試驗采用本試驗采用葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠Sephadex G 25Sephadex G 25層析層析方法除去球方法除去球蛋白粗提液中的鹽蛋白粗提液中的鹽硫酸銨硫酸銨，以便下一步用離子交換層析，以便下一步用離子交換層析方法進一步提純球蛋白。方法進一步提純球蛋白。 第10頁/共40頁第十一頁，編輯于星期一：十九點 四十四分。凝膠層析凝膠層析原理：原理：P31凝膠層析法是按混合物各組分凝膠層析法是按混合物各組分分子量分子量大小大小不同隨流不同隨流動相經過層析柱的時間不同而被分離的技術。動相經過層析柱的時間不同而被分離的技術。

8、 是一類具有三維多孔網狀結構的干燥顆粒，是一類具有三維多孔網狀結構的干燥顆粒，凝膠凝膠直徑大于凝膠網直徑大于凝膠網孔的孔的不能進入凝膠內部，只能沿著凝膠顆粒間的間隙不能進入凝膠內部，只能沿著凝膠顆粒間的間隙隨流動相向下移動，所以流程短、流速快，首先流出層析柱；而隨流動相向下移動，所以流程短、流速快，首先流出層析柱；而直徑小于凝膠網孔能自由出入，洗脫時間長，后流出層析直徑小于凝膠網孔能自由出入，洗脫時間長，后流出層析柱，經過一定時間柱，經過一定時間。 第11頁/共40頁第十二頁，編輯于星期一：十九點 四十四分。第12頁/共40頁第十三頁，編輯于星期一：十九點 四十四分。第13頁/共40頁第十四頁

9、，編輯于星期一：十九點 四十四分。第14頁/共40頁第十五頁，編輯于星期一：十九點 四十四分。數學模型 Vo Vi VtViVi凝膠孔內水（內水）凝膠孔內水（內水）VoVo顆粒間水（外水）顆粒間水（外水）VgVg凝膠體積凝膠體積總體積總體積VtVt= = Vi Vi + +VoVo+ +VgVg第15頁/共40頁第十六頁，編輯于星期一：十九點 四十四分。17Kd Kd 分配系數：精確衡量混合物中某一待分配系數：精確衡量混合物中某一待分離成分在凝膠柱內的洗脫行為，反映物質分離成分在凝膠柱內的洗脫行為，反映物質分子進入凝膠顆粒的程度，是溶質分子大小分子進入凝膠顆粒的程度，是溶質分子大小的一個函數的

10、一個函數VeVe洗脫體積：分離物被洗脫時所用的洗脫液洗脫體積：分離物被洗脫時所用的洗脫液體積體積 K Kd d=(V=(Ve e-V-Vo o)/V)/Vi i 洗脫曲線：以洗脫體積為橫坐標，各物質濃度洗脫曲線：以洗脫體積為橫坐標，各物質濃度/ /吸光度為縱坐標作圖吸光度為縱坐標作圖第16頁/共40頁第十七頁，編輯于星期一：十九點 四十四分。18（1 1）完全被排阻的極端大分子，）完全被排阻的極端大分子，VeVe= =VoVo，KdKd=0=0（2 2）中等分子，）中等分子，VeVe= =VoVo+ +KdKdViVi，00KdKd11（3 3）完全滲透的小分子，）完全滲透的小分子，VeVe=

11、 =VoVo+ +ViVi， KdKd=1=1第17頁/共40頁第十八頁，編輯于星期一：十九點 四十四分。1 1、層析柱保持垂直。層析柱保持垂直。2 2、放蒸餾水，排出空氣，關閉出口。、放蒸餾水，排出空氣，關閉出口。3 3、加入攪拌均勻的、加入攪拌均勻的SephadexG-25懸液，調節流速懸液，調節流速10滴滴/min，使凝膠均勻沉降，不斷補充，直至，使凝膠均勻沉降，不斷補充，直至18cm。4、上留、上留1-2mm的水，關閉出口。的水，關閉出口。 床面上要保持少許床面上要保持少許水，水， ，用玻棒輕輕攪動，讓凝膠自然沉降，用玻棒輕輕攪動，讓凝膠自然沉降， 使表面平整。使表面平整。第18頁/共

12、40頁第十九頁，編輯于星期一：十九點 四十四分。1、加樣：、加樣：用滴管將鹽析后樣品加入柱床面，打開出口使樣品用滴管將鹽析后樣品加入柱床面，打開出口使樣品 溶液滲入凝膠。溶液滲入凝膠。2、洗脫：、洗脫：加入洗脫液，打開出口，保持流速加入洗脫液，打開出口，保持流速10滴滴/min，收，收 集洗脫液，每管收集集洗脫液，每管收集1ml。用。用。3、保存：、保存：，保存，保存 含量高的進一步純化含量高的進一步純化 不斷加洗脫液，使不斷加洗脫液，使全部流出，為下次實驗做準備全部流出，為下次實驗做準備第19頁/共40頁第二十頁，編輯于星期一：十九點 四十四分。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10上樣

13、上樣球蛋白，球蛋白， 粗粗提液提液 裝柱裝柱 葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠G-25， 柱高柱高18-20cm流速：每分鐘流速：每分鐘10滴左右滴左右收集收集 20滴換滴換一支試管一支試管第20頁/共40頁第二十一頁，編輯于星期一：十九點 四十四分。第21頁/共40頁第二十二頁，編輯于星期一：十九點 四十四分。1 . 凝膠柱的制備質量決定分離效果的好壞凝膠柱的制備質量決定分離效果的好壞 。 2. 加樣分離時，滴速越慢，分離效果越好。加樣分離時，滴速越慢，分離效果越好。 以管號為橫軸，蛋白以管號為橫軸，蛋白質含量為縱軸繪制洗脫質含量為縱軸繪制洗脫曲線，分析實驗結果。曲線，分析實驗結果。第22頁/共40頁第

14、二十三頁，編輯于星期一：十九點 四十四分。 1. 1. 通過使用通過使用進一步進一步 純化純化-球蛋白脫鹽液，得到較純的球蛋白脫鹽液，得到較純的-球蛋白溶液球蛋白溶液 2. 2. 學習了解離子交換層析方法的基本原理和應用學習了解離子交換層析方法的基本原理和應用第23頁/共40頁第二十四頁，編輯于星期一：十九點 四十四分。 離子交換層析是一種常用的、通過使用各種類型的離子交換劑達離子交換層析是一種常用的、通過使用各種類型的離子交換劑達到分離純化目的的層析方法。離子交換劑是通過化學反應將帶電基團到分離純化目的的層析方法。離子交換劑是通過化學反應將帶電基團引入到惰性支持物上形成的固體物質，在實驗中作

15、為固定相。如果其引入到惰性支持物上形成的固體物質，在實驗中作為固定相。如果其帶負電，則能結合陽離子，成為帶負電，則能結合陽離子，成為陽離子交換劑陽離子交換劑；如果其帶正電，；如果其帶正電，則能結合陰離子，稱為則能結合陰離子，稱為陰離子交換劑陰離子交換劑。可根據實驗需要，選擇不。可根據實驗需要，選擇不同的離子交換劑進行離子交換層析。同的離子交換劑進行離子交換層析。 DEAE DEAE （二乙基氨基乙基）纖維素（二乙基氨基乙基）纖維素含有可離子化的堿基，含有可離子化的堿基，可與氫離子結合，成為帶正電荷的陰離子交換劑?？膳c氫離子結合，成為帶正電荷的陰離子交換劑。 第24頁/共40頁第二十五頁，編輯于

16、星期一：十九點 四十四分。 血清血清、球蛋白、清蛋白的等電點為：球蛋白、清蛋白的等電點為： 清蛋白清蛋白pI= =， 2球蛋白球蛋白 pI= =， 球蛋白球蛋白pI= =， 球蛋白球蛋白pI= = 本實驗采用本實驗采用0.0175 mol/l pH6.5 NH4Ac緩沖液進行緩沖液進行洗脫。此洗脫。此pH，DEAE帶正電荷，可與帶負電荷的帶正電荷，可與帶負電荷的、-球球蛋白和清蛋白結合，而蛋白和清蛋白結合，而帶正電荷的帶正電荷的-球蛋白不與球蛋白不與DEAEDEAE結結合，首先從層析柱中洗脫出來合，首先從層析柱中洗脫出來，首先收集到的既是純，首先收集到的既是純化的化的-球蛋白。球蛋白。第25頁

17、/共40頁第二十六頁，編輯于星期一：十九點 四十四分。 將脫鹽后的球蛋白加于將脫鹽后的球蛋白加于DEAE柱上（方法同凝膠柱上（方法同凝膠過濾），用過濾），用0.0175 mol/l pH 6.3 NH4Ac緩沖液洗緩沖液洗脫，流速脫，流速10滴滴15滴滴/分，用小試管連續收集流出分，用小試管連續收集流出液（約液（約1.0 ml/管），用管），用20%20%磺基水楊酸溶液檢查蛋白磺基水楊酸溶液檢查蛋白質分布情況質分布情況，收集含量最高的部分，濃縮作純度鑒定。，收集含量最高的部分，濃縮作純度鑒定。用該緩沖液洗脫下來的是用該緩沖液洗脫下來的是球蛋白。球蛋白。第26頁/共40頁第二十七頁，編輯于星期一

18、：十九點 四十四分。. .使用離心機的操作注意事項。使用離心機的操作注意事項。. .裝柱時檢查是否漏水。裝柱時檢查是否漏水。. .裝柱后凝膠裝柱后凝膠均一無斷層，無氣泡，柱床面平整均一無斷層，無氣泡，柱床面平整。. .柱床面保持有緩沖液。柱床面保持有緩沖液。. .加樣時動作緩慢輕柔，不要破壞柱床面的平整。加樣時動作緩慢輕柔，不要破壞柱床面的平整。. .每用一次滴管，請用水清洗干凈，防止試劑及被每用一次滴管，請用水清洗干凈，防止試劑及被測樣品交叉污染。測樣品交叉污染。第27頁/共40頁第二十八頁，編輯于星期一：十九點 四十四分。 利用葡聚糖凝膠富含羥基，吸水，不允許大分子利用葡聚糖凝膠富含羥基，

19、吸水，不允許大分子蛋白進入微孔的特性，在樣品溶液中加少量凝膠，離蛋白進入微孔的特性，在樣品溶液中加少量凝膠，離心，濃縮蛋白。心，濃縮蛋白。 每每mlml純化純化球蛋白溶液加球蛋白溶液加Sephadex G-25 0.25 gSephadex G-25 0.25 g，搖動，搖動2 23 3分鐘，離心分鐘，離心3000r/min3000r/min，5 5分鐘，上清即為濃縮分鐘，上清即為濃縮-球蛋白（球蛋白（或用冷凍干燥儀使其濃縮）?；蛴美鋬龈稍飪x使其濃縮）。 第28頁/共40頁第二十九頁，編輯于星期一：十九點 四十四分。 第29頁/共40頁第三十頁，編輯于星期一：十九點 四十四分。第30頁/共40頁第三十一頁，編輯于星期一：十九點 四十四分。1 1、以醋酸纖維薄膜作為支持體的一種電泳方法。、以醋酸纖維薄膜作為支持體的一種電泳方法。2 2、在、在巴比妥緩沖液中，血清蛋白質在電場中均帶負電巴比妥緩沖液中，血清蛋白質在電場中均帶負電荷，向正極移動。荷，向正極移動。3 3、帶電荷多、分子量相對小的泳動速度快；帶電荷少、帶電荷多、分子量相對小的