1、生物化學與分子生物學實驗生物化學與分子生物學實驗實驗六實驗六血清葡萄糖及血清血清葡萄糖及血清總膽固醇含量測定總膽固醇含量測定生物化學與分子生物學實驗生物化學與分子生物學實驗一、酶法（一、酶法（GOD-PODGOD-POD）測血）測血清葡萄糖含量清葡萄糖含量生物化學與分子生物學實驗生物化學與分子生物學實驗實驗目的實驗目的u 掌握葡萄糖氧化酶法測定血糖含量的原理和掌握葡萄糖氧化酶法測定血糖含量的原理和方法方法u 掌握測定血糖的臨床意義掌握測定血糖的臨床意義生物化學與分子生物學實驗生物化學與分子生物學實驗 鄰甲苯胺法鄰甲苯胺法 酶法：酶法： 血糖的測定方法：血糖的測定方法：準確度、靈敏度準確度、靈敏

2、度高，穩定性好高，穩定性好葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶-過氧化物酶偶聯法過氧化物酶偶聯法 （GOD-POD）實驗原理實驗原理生物化學與分子生物學實驗生物化學與分子生物學實驗偶聯酶法測血糖偶聯酶法測血糖 葡萄糖葡萄糖O2H2O2葡萄糖酸葡萄糖酸葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶（GOD）H2O24-4-氨基氨基安替比林安替比林H2O醌亞胺染料醌亞胺染料過氧化物酶過氧化物酶（POD）紅色紅色生物化學與分子生物學實驗生物化學與分子生物學實驗 紅色醌亞胺染料在紅色醌亞胺染料在500nm500nm處具有吸處具有吸收峰收峰 采用標準對比法可計算得到樣品中葡萄糖采用標準對比法可計算得到樣品中葡萄糖 濃度濃度 紅色醌亞胺染

3、料的生成量與葡萄糖含量紅色醌亞胺染料的生成量與葡萄糖含量 成正比成正比生物化學與分子生物學實驗生物化學與分子生物學實驗實驗器材實驗器材 試管試管1.51.5 5cm5cm（ 3 3）、試）、試管架管架 吸量管吸量管2mL2mL（ 11）、洗耳球）、洗耳球 微量加樣器：微量加樣器：2020l l的的PipetmPipetmanan 恒溫水浴箱恒溫水浴箱 離心機、離心管離心機、離心管10ml10ml（ 2 2）生物化學與分子生物學實驗生物化學與分子生物學實驗實驗試劑實驗試劑 葡萄糖測定試劑盒：原裝試劑在葡萄糖測定試劑盒：原裝試劑在2 288避光避光保存，有效期保存，有效期1515個月。混合后個月。

4、混合后2 288可穩定可穩定11個月，室溫可穩定個月，室溫可穩定3 3天天 葡萄糖標準液：葡萄糖標準液：100mg/Dl100mg/Dl(5.55mmol/L)5.55mmol/L) 實驗樣品：新鮮無溶血血清實驗樣品：新鮮無溶血血清生物化學與分子生物學實驗生物化學與分子生物學實驗實驗操作實驗操作1. 1. 酶工作液配置酶工作液配置（直接用（直接用試劑盒）試劑盒）2. 2. 標本標本處理處理抽取全血抽取全血 3-3-5 5 mLmL3737保溫保溫15分鐘分鐘30003000轉轉/min/min離離心心10min10min取上清液備用取上清液備用生物化學與分子生物學實驗生物化學與分子生物學實驗3

5、. 3. 取取3 3支干凈干燥的小試管按表加入試劑支干凈干燥的小試管按表加入試劑4. 4. 各管加好后混勻，置各管加好后混勻，置3737水浴水浴 30minmin，0.5cm光徑比色杯，以空白試劑調零，在光徑比色杯，以空白試劑調零，在500n500nmm波長下比色波長下比色先加體積少的，先加體積少的，再加多的再加多的 管號管號試劑試劑空白管空白管標準管標準管待測管待測管蒸餾水蒸餾水(L ）10標準葡萄糖標準葡萄糖(L ）10待測血清待測血清(L ）10酶工作液酶工作液(mL ）1.51.51.5生物化學與分子生物學實驗生物化學與分子生物學實驗u 標準液吸取后應立即上蓋，以防水分揮發標準液吸取后

6、應立即上蓋，以防水分揮發u 工作液混濁或有絮狀物視為失效工作液混濁或有絮狀物視為失效u 本法特異性高，維生素本法特異性高，維生素C C，谷胱甘肽，左，谷胱甘肽，左 旋多巴引起負偏差旋多巴引起負偏差u 1010l l液體必須全部溶于液體必須全部溶于1.5ml1.5ml酶工作液中酶工作液中注意注意u 1010LL液體不易精確加入，實驗時要仔細液體不易精確加入，實驗時要仔細檢查移液槍的密封性。此外，移液槍外壁不要沾有檢查移液槍的密封性。此外，移液槍外壁不要沾有液體。液體。生物化學與分子生物學實驗生物化學與分子生物學實驗二、酶法（二、酶法（COD-PAPCOD-PAP）測血清總膽固醇測血清總膽固醇(T

7、C)(TC)生物化學與分子生物學實驗生物化學與分子生物學實驗實驗目的實驗目的u 掌握酶法測定血清總膽固醇含量的原理掌握酶法測定血清總膽固醇含量的原理u 熟悉酶法測定血清總膽固醇含量的操作熟悉酶法測定血清總膽固醇含量的操作方法方法u 了解總膽固醇測定的臨床意義了解總膽固醇測定的臨床意義生物化學與分子生物學實驗生物化學與分子生物學實驗膽固醇酯酶膽固醇酯酶+FFA膽甾烯酮膽甾烯酮+ H+ H2 2OO2 2膽固醇氧化酶膽固醇氧化酶COD實驗原理實驗原理+4-氨基安替比林氨基安替比林 +酚酚醌亞胺醌亞胺過氧化物酶過氧化物酶H2O2PAP 膽固醇酯膽固醇酯 游離膽固醇游離膽固醇生物化學與分子生物學實驗生

8、物化學與分子生物學實驗 紅色的醌型化合物在紅色的醌型化合物在510nm處有吸收峰，顏處有吸收峰，顏色深淺與總膽固醇的濃度成色深淺與總膽固醇的濃度成正比正比。 采用采用標準對比法標準對比法可計算其含量。可計算其含量。 總膽固醇含量正常參考值范圍為總膽固醇含量正常參考值范圍為3.1-5.7mmol/L生物化學與分子生物學實驗生物化學與分子生物學實驗實驗器材實驗器材u 小試管（小試管（3）、試管架）、試管架u 刻度吸量管刻度吸量管2mL（1）、洗耳球）、洗耳球u 微量加樣器微量加樣器(20l)u 恒溫水浴箱恒溫水浴箱u 離心機、離心管離心機、離心管10ml（2）生物化學與分子生物學實驗生物化學與分子

9、生物學實驗實驗試劑實驗試劑u R1 R1液：磷酸鹽緩沖液、對氯酚液：磷酸鹽緩沖液、對氯酚u R2 R2液：液：4-4-氨基安替比林、酶氨基安替比林、酶u 膽固醇標準液：膽固醇標準液：5.2mmol/L5.2mmol/L生物化學與分子生物學實驗生物化學與分子生物學實驗實驗步驟實驗步驟u 1. 工作試劑配制：工作試劑配制： R1 10ml+R2 1ml混合，可保存混合，可保存1周周u 2. 標本處理標本處理:抽取全血抽取全血35ml37保溫保溫15分鐘分鐘3000轉轉/min離心離心10min取上清液備用取上清液備用u 最適樣品為當日空腹采集無溶血無乳糜的血清。最適樣品為當日空腹采集無溶血無乳糜的

10、血清。生物化學與分子生物學實驗生物化學與分子生物學實驗u3. 取取3支小試管編號，按表加入試劑支小試管編號，按表加入試劑 管號管號 試劑試劑空白管空白管標準管標準管待測管待測管蒸餾水蒸餾水（l）1010標準液標準液（l）1010樣品樣品（l）1010工作試劑工作試劑（ml）0.60.60.60.60.60.6充分混合，充分混合，3737水浴水浴1515分鐘分鐘蒸餾水蒸餾水（ml）1.01.01.01.01.01.0u0.5cm光徑比色杯，以空白試劑調零，在光徑比色杯，以空白試劑調零，在510nm波長下比色波長下比色生物化學與分子生物學實驗生物化學與分子生物學實驗注意事項注意事項u 最后加酶工作

11、試劑，各管反應時間應一致最后加酶工作試劑，各管反應時間應一致u 工作試劑防止葡萄糖和甘油三酯污染工作試劑防止葡萄糖和甘油三酯污染u 若需檢測游離膽固醇含量，將酶試劑去掉膽若需檢測游離膽固醇含量，將酶試劑去掉膽固醇酯酶即可固醇酯酶即可生物化學與分子生物學實驗生物化學與分子生物學實驗實驗結果與討論實驗結果與討論u 計算結果計算結果u 記錄結果記錄結果A標標=標準管吸光度標準管吸光度A待待=待測管吸光度待測管吸光度 C待待=A待待A標標C標標C標標=血液中葡萄糖或膽固醇濃度血液中葡萄糖或膽固醇濃度C標標=標準液中葡萄糖或膽固醇濃度標準液中葡萄糖或膽固醇濃度生物化學與分子生物學實驗生物化學與分子生物學

12、實驗血清葡萄糖測定臨床意義血清葡萄糖測定臨床意義 病理性高血糖：病理性高血糖： 常見于糖尿病；顱內壓升高，如顱內出血，顱外傷常見于糖尿病；顱內壓升高，如顱內出血，顱外傷等；脫水引起的高血糖，如嘔吐、腹瀉和高熱等也等；脫水引起的高血糖，如嘔吐、腹瀉和高熱等也可使血糖升高；胰島可使血糖升高；胰島 細胞瘤等細胞瘤等 病理性低血糖：病理性低血糖： 常見于胰島素分泌異常、肝功能嚴重衰退等；嚴重常見于胰島素分泌異常、肝功能嚴重衰退等；嚴重肝病患者，肝臟不能有效地調節血糖；糖原累積癥肝病患者，肝臟不能有效地調節血糖；糖原累積癥。生物化學與分子生物學實驗生物化學與分子生物學實驗 危險閾值：危險閾值：5.2-6

13、.2mmol/L 高膽固醇血癥：高膽固醇血癥：6.2mmol/L TC增高：常見于動脈粥樣硬化、高脂蛋白增高：常見于動脈粥樣硬化、高脂蛋白血癥、梗阻性黃疸、腎病綜合征、甲狀腺血癥、梗阻性黃疸、腎病綜合征、甲狀腺功能低下、慢性腎功能衰竭、糖尿病等功能低下、慢性腎功能衰竭、糖尿病等 TC降低：常見于低脂蛋白血癥、貧血、肝降低：常見于低脂蛋白血癥、貧血、肝臟疾病、營養吸收不良、惡性腫瘤等。臟疾病、營養吸收不良、惡性腫瘤等。血清總膽固醇測定臨床意義血清總膽固醇測定臨床意義生物化學與分子生物學實驗生物化學與分子生物學實驗思考題思考題u 正常人的血糖為什么能維持在一定水平正常人的血糖為什么能維持在一定水平

14、?u 胰島素和腎上腺素對血糖有何影響胰島素和腎上腺素對血糖有何影響? 為什么為什么?u 測定血清總膽固醇的臨床意義有哪些？測定血清總膽固醇的臨床意義有哪些？生物化學與分子生物學實驗生物化學與分子生物學實驗 722722型分光光度計型分光光度計 能在可見光譜區域內對樣品物質作定量分析。能在可見光譜區域內對樣品物質作定量分析。廣泛應用于醫藥衛生、臨床檢驗、生物化學、石廣泛應用于醫藥衛生、臨床檢驗、生物化學、石油化工、環境保護、質量控制，是生物化學實驗油化工、環境保護、質量控制，是生物化學實驗室常用分析儀器之一。室常用分析儀器之一。生物化學與分子生物學實驗生物化學與分子生物學實驗原理原理 不同的物質

15、對光的吸收具有選擇性，有不同的物質對光的吸收具有選擇性，有其各自的吸收光譜。當某單色光通過溶液時，能量其各自的吸收光譜。當某單色光通過溶液時，能量會被吸收而減弱，能量減弱程度和物質濃度有一定會被吸收而減弱，能量減弱程度和物質濃度有一定關系關系生物化學與分子生物學實驗生物化學與分子生物學實驗“MODEMODE”鍵：鍵： 用于設用于設置測試方式置測試方式“100%T100%T”鍵：鍵： 用于自用于自動調整動調整100.0%T100.0%T(100.0(100.0透射比透射比)或或零吸光度零吸光度 “0%T0%T”鍵：鍵： 用于自用于自動調整零透射比動調整零透射比“波長設置波長設置”旋鈕：旋鈕： 用

16、于用于設置分析波長設置分析波長722E722E型型生物化學與分子生物學實驗生物化學與分子生物學實驗比色皿的使用方法比色皿的使用方法 拿比色皿時，只能拿毛玻璃面，不能碰透光面，拿比色皿時，只能拿毛玻璃面，不能碰透光面，以免污染以免污染 使用前，一般先用水沖洗，再用蒸餾水潤洗，還使用前，一般先用水沖洗，再用蒸餾水潤洗，還要用所盛溶液潤洗要用所盛溶液潤洗 外壁的水用擦鏡紙或吸水紙沾干，以保護透光面外壁的水用擦鏡紙或吸水紙沾干，以保護透光面 所盛液體量約占總體積的所盛液體量約占總體積的3/4，即距管口，即距管口1cm左右左右 生物化學與分子生物學實驗生物化學與分子生物學實驗722E型分光光度計操作方法

17、型分光光度計操作方法1. 1. 預熱儀器（關蓋，拉半檔，預熱儀器（關蓋，拉半檔，TT模式）模式） 2. 2. 選定波長選定波長 5. 5. 調調 T=100T=100 (關蓋，拉桿全推進，光關蓋，拉桿全推進，光路對著空白管路對著空白管）4. 4. 調調 T=T= 00% (% (關蓋，拉半檔，光路對著關蓋，拉半檔，光路對著11、2 2格間的擋板）格間的擋板） 3. 3. 放入樣品（放入樣品（光面光面對著光路的方對著光路的方向）向）7. 7. 將模式調至將模式調至“A A”，拉動拉桿至標準管和樣本，拉動拉桿至標準管和樣本管，分別測定管，分別測定A A值并記錄值并記錄8. 8. 按回按回“TT”模

18、式，推回半檔的位置，拿出比色皿，模式，推回半檔的位置，拿出比色皿，關機關機 6. 6. 重復重復4-54-5步至儀器顯示數值穩定。步至儀器顯示數值穩定。生物化學與分子生物學實驗生物化學與分子生物學實驗返回光路生物化學與分子生物學實驗生物化學與分子生物學實驗返回光路生物化學與分子生物學實驗生物化學與分子生物學實驗返回生物化學與分子生物學實驗生物化學與分子生物學實驗注意事項注意事項 每更換一次波長，重新調每更換一次波長，重新調“00”和和“100%100%”； 每次做完實驗后，應立即洗凈比色皿每次做完實驗后，應立即洗凈比色皿 為了防止光電管疲勞，不測定時必須將光路切斷，為了防止光電管疲勞，不測定時必須將光路切斷， 以延長光電管使用壽命以延長光電管使用壽命 當儀器停止工作時，切斷電源，并用套子蓋住儀當儀器停止工作時，切斷電源，并用套子蓋住儀 器，做好使用登記器，做好使用登記 生物化學與分子生物學實驗生物化學與分子生物學實驗u 朗伯比爾定律：朗伯比爾定律： A= c lA= c l：摩爾吸光系數：摩爾吸光系數 c：溶液的濃度：溶液的濃度 l：液層的厚度