1、生化最后沖刺復習要點生物化學考試輔導資料一.考試內容精要  一、蛋白質的生物學功能(了解即可)  蛋白質是生命的物質基礎，沒有蛋白質就沒有生命，生物體結構越復雜，其蛋白質種類和功能越繁多，  其主要的生物學功能是:  （一）催化和調節能力  某些蛋白質是酶，催化生物體內的物質代謝反應。  某些蛋白質是激素，具有一定的調節功能，如胰島素調節糖代謝、體內信號轉導也常通過某些蛋白質介導。  （二）轉運功能  某些蛋白具有運載功能，如血紅蛋白是

2、轉運氧氣和二氧化碳的工具，血清白蛋白可以運輸自由脂肪酸及膽紅素等。  (三）收縮或運動功能  某些蛋白質賦予細胞與器官收縮的能力，可以使其改變形狀或運動。如骨骼肌收縮靠肌動蛋白和肌球蛋白。  （四)防御功能 如免疫球蛋白，可抵抗外來的有害物質，保護機體。  （五）營養和儲存功能如鐵蛋白可以儲存鐵。  (六）結構蛋白  許多蛋白質起支持作用，給生物結構以強度及保護，如韌帶含彈性蛋白，具有雙向抗拉強度。  （七）其他功能  如病毒和噬菌體是

3、核蛋白，病毒可以致病。  二、蛋白質的分子組成  （一）元素組成  組成蛋白質分子的主要元素有碳、氫、氧、氮、硫。有些還含有少量磷或金屬元素。各種蛋白質的含氮量很接近，平均為16，且蛋白質是體內的主要含氮物，因此可以根據生物樣品的含氮量推算出蛋白質的大致含量。  （二）氨基酸  氨基酸是蛋白質的基本組成單位，存在于自然界的氨基酸有300余種，但組成人體蛋白質的氨基酸僅有20種，且均屬L-氨基酸（甘氨酸除外）即左旋氨基酸，因為甘氨酸無手性碳原子(與四個不同的原子或基團相連的碳原子)，大多數有手性碳

4、原子的是手性分子，手性分子有旋光活性。根據它們的側鏈R的結構和性質可分為四類:  1.非極性疏水性氨基酸:  這類氨基酸的特征是在水中的溶解度小于極性氨基酸。  2極性中性氨基酸:  這類氨基酸的特征是比非極性氨基酸易溶于水，且羧基數等于氨基數，故為中性氨基酸，但因為羧基電離能力較大，故其實際上具有弱酸性。  3.酸性氨基酸:天冬氨酸、谷氨酸。這兩種氨基酸都含有兩個羧基，在生理條件下帶負電，故為酸性氨基酸。  4.堿性氨基酸:賴氨酸、精氨酸和組氨酸。這類氨基酸在生理條件下帶正

5、電，故為堿性氨基酸。  還需要記住這20種氨基酸的英文縮寫符號，尤其是三字符號，并且這四種類別的氨基酸中還有幾種特殊的氨基酸，也需記住它們的獨特特征。  芳香族氨基酸:苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸分子中含有芳香環   含硫氨基酸:甲硫氨酸、半胱氨酸分子中含硫元素，甲硫氨酸也叫蛋氨酸。   亞氨基酸:脯氨酸，其氨基處于環中，為亞氨基酸   支鏈氨基酸:纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸，這三種均含有支鏈   其中有八種氨基酸人體內不能自身合成，必須從食物中獲得，稱為必需氨基酸，它們是纈氨酸、

6、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。  三、氨基酸的理化性質  （一）兩性電離及等電點  氨基酸分子中含有堿性的-氨基和酸性的-羧基，能與酸或堿類物質結合成鹽，故它是一種兩性電解質。在某一pH值的溶液中氨基酸解離成陽離子和陰離子的趨勢與程度相等，成為兼性離子，呈電中性，此時溶液的pH稱為該氨基酸的等電點(pI)。這里有一個等電點的計算問題:  1側鏈R為非極性基團或雖為極性但不解離的，此種氨基酸的等電點主要由-氨基和-羧基的解離常數的負對數pK1，pK2決定，pI=1/2(pK1+pK2)&

7、#160; 2側鏈基團可以解離，則由-氨基，-羧基及R基團解離情況共同決定，只需寫出電離式，取其兼性離子兩邊的pK值的平均值即可。如賴氨酸其電離式為:  由電離式可以看出，其兼性離子兩邊pK值分別是pK-NH3+和pK-NH3+而與-羧基無關故其pI=1/2 (8.95+10.537)=9.74  （二）紫外吸收性質  色氨酸、酪氨酸在280nm波長附近有最大的紫外吸收峰，由于大多數蛋白  質含有這類氨基酸，所以測定蛋白質溶液280nm的光吸  收值，是分析溶液中蛋白質含量的快速簡便方

8、法。  （三）茚三酮反應:氨基酸+茚三酮水合物還原茚三酮+氨，還原茚三酮+氨+茚三酮藍紫色化合物  此化合物最大吸收峰在570nm波長處，由于此吸收峰值的大小與氨基酸釋放出的氨量成正比，因此可以作為氨基酸定量分析的方法。  四、肽  (一)肽鍵  兩分子氨基酸可由一分子所含的氨基與另一分子所帶的羧基脫去一分子水縮合成二肽，兩個氨基酸之間產生的酰胺鍵稱為肽鍵，具有不典型雙鍵性質。由10個以內的氨基酸縮合而成的肽稱為寡肽，更多的氨基酸相連而構成多肽。pr是具有更大分子量的多肽鏈，但多肽和pr在分子量

9、上很難劃出明確界限，實際應用中只有一個習慣上的劃分。肽鏈中的氨基酸分子因脫水縮合而基團不全，稱為氨基酸殘基。多肽鏈中自由氨基末端稱為N端，自由羧基末端稱為C端，命名從N端指向C端。  （二）生物活性肽  1.谷胱甘肽  由谷氨酸和甘氨酸和半胱氨酸組成的三肽。第一個肽鍵比較特殊，由谷氨酸-羧基與半胱氨酸的氨基組成。分子中半胱氨酸的巰基是該化合物的主要功能基團。此巰基具有還原性，要記住谷胱甘肽的生理作用:1作為體內重要的還原劑；保護蛋白質或酶免遭氧化，使它們處在活性狀態2可還原細胞內產生的H2o2，避免細胞受損3其巰基具有嗜核特性，能與外

10、源的致癌劑或藥物等結合，從而阻斷它們與DNA、RNA或蛋白質結合，保護機體免遭損害。  2.多肽類激素及神經肽。 體內有許多激素屬寡肽或多肽，如催產素、促腎上腺皮質激素，促甲狀腺激素等。神經肽是在神經傳導過程中起信號轉導作用的肽類，如腦啡肽、-內啡肽等。  五pr的分類  pr的分類分單純pr、結合pr，后者除aa外，還含有非pr部分即輔基，絕大部分輔基以共價健與pr部分相連，根據形狀分纖維pr及球狀pr  六、蛋白質的分子結構  (要注意構成各級結構的化學鍵)  可分為一級

11、、二級、三級、四級結構四個層次，后三者統稱為高級結構或空間構象。蛋白質的空間構象涵蓋了蛋白質分子中每一個原子在三維空間的相對位置，并非所有pr都有四級結構，由二條或二條以上多肽鏈形成的pr才有四級結構。  （一）蛋白質的一級結構  蛋白質的一級結構是指蛋白質分子中氨基酸的排列順序。主要化學鍵是肽鍵和二硫鍵。一級結構是蛋白質空間結構和特異生物學功能的基礎。氨基酸排列順序的差別意味著從多肽鏈骨架伸出的側鏈R基團的性質和順序對于每一種蛋白質是特異的因為R基團大小不同，所帶電荷數目不同，對水的親和力不相同，所以蛋白質的空間構象也不同。  （二

12、）蛋白質的二級結構  蛋白質的二級結構指蛋白質分子中某一段肽鏈的局部空間結構，也就是該段肽鏈主鏈骨架原子的相對空間位置，并不涉及氨基酸殘基側鏈的構象。維系二級結構的化學鍵主要是氫鍵。二級結構的主要形式包括:-螺旋結構、一折疊、-轉角和無規則卷曲。  1肽單元。  參與肽鍵的6個原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，且C1、C2在平面上所處的位置為反式構型，此6個原子即構成了肽單元，其基本結構為  圖中的A、B鍵是單鍵，可自由旋轉，也正由于這兩個單鍵的自由旋轉角度，決定了相鄰肽單  元之間的

13、相對空間位置。其中的肽鍵有一定程度雙鍵性質，不能自由旋轉。  2.-螺旋。  多肽鏈主鏈圍繞中心軸有規律的螺旋式上升，每隔3.6個殘基螺旋上升一圈，每個氨基酸殘基向上平移0.15nm，故螺距為0.54nm。螺旋的走向為右手螺旋。-螺旋的每個肽鍵的NH和第四個肽鍵的羰基氧形成氫鍵，氫鍵的方向與螺旋長軸基本平行，側鏈R基團則伸向螺旋外。  3.-折疊。  多肽鏈充分伸展，每個肽單元以C為旋轉點折疊成鋸齒狀結構，側鏈R基團交錯位于鋸齒狀結構的上下方。可由兩條以上肽鏈或一條肽鏈內的若干肽段折疊成鋸齒狀結構。平行肽段間靠鏈間

14、肽鍵羰基氧和亞氨基氫形成氫鍵，使構象穩定，此氫鍵方向與折疊的長軸垂直。兩條平行肽鏈走向可相同或相反，由一條肽鏈折返形成的-折疊多為反式，反式平行較順式平行更為穩定。  4.-轉角和無規卷曲。-轉角常發生于肽鏈進行180度回折時的轉角上，通常由4個氨基酸殘基組成，其第一個殘基的羰基氧與第四個殘基的氨基氫可形成氫鍵。-轉角第二個殘基常為脯氨酸，因為其N原子位于環中，形成肽鍵N原子上已沒有H，不能再形成氫鍵，故走向轉折-轉角常發生在蛋白質分子的表面，這與蛋白質的生物學功能有關。無規卷曲用來闡述沒有確定規律性的那部分肽鏈結構。  5.模序。指在許多蛋白質分子中，

15、可發現兩個或三個具有二級結構的肽段，在空間上相互接近，形成一個具有特殊功能的空間結構，稱為模序。實際上它是一種超二級結構。一個模序總有其特征性的氨基酸序列，并發揮特殊的功能。常見的-螺旋環-螺旋結構及鋅指結構，前者可結合Ca2+，后者可結合Zn2+，使-螺旋能鑲嵌于DNA的大溝中。  因此含此結構的pr可與DNA或RNA結合，這對于pr調控DNA的轉錄和pr翻譯過程是必要的。一段肽鏈其氨基酸殘基的側鏈適合形成-螺旋或-折疊，就會出現相應的二級結構，aa殘基帶相同的電荷或側鏈太大，都會妨礙二級結構的形成，此外還有一個分子伴侶的概念，其作用就是使肽鏈正確折疊，從而形成正確的空間

16、構象。  （三）蛋白質的三級結構  指整條肽鍵中全部氨基酸殘基的相對空間位置，也就是整條肽鏈所有原子在三維空間的排布位置。三級結構的形成和穩定主要靠疏水鍵、鹽鍵、二硫鍵、氫鍵和范德華力等次級鍵。其中疏水鍵是最主要的穩定力量。疏水鍵是蛋白質分子中疏水基團之間的結合力，酸性和堿性氨基酸的R基團可以帶電荷，正負電荷互相吸引形成鹽鍵，與氫原子共用電子對形成的鍵為氫鍵。  分子量大的蛋白質三級結構其整條肽鏈中常可分割成多折疊得轉為緊密的結構域，實際上結構域也是一種介于二級和三級結構之間的結構層次，每個結構域執行一定的功能。  

17、;（四）蛋白質的四級結構  蛋白質的四級結構是由有生物活性的兩條或多條肽鏈組成，肽鏈與肽鏈之間不通過共價鍵相連，而由非共價鍵維系。每條多肽鏈都有其完整的三級結構，稱為蛋白質的亞基，這種蛋白質分子中各個亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為蛋白質的四級結構。在四級結構中，各亞基之間的結合力主要是疏水作用，氫鍵和離子鍵也參與維持四級結構。含有四級結構的蛋白質，單獨的亞基一般沒有生物學功能，只有完整的四級結構才有生物學功能。  七、蛋白質結構與功能的關系  (一)蛋白質一級結構與功能的關系要明白三點:  1.

18、一級結構是空間構象和功能的基礎，空間構象遭破壞的多肽鏈只要其肽鍵未斷，一級結構未被破壞，就能恢復到原來的三級結構，功能依然存在。  2.即使是不同物種之間的多肽和蛋白質，只要其一級結構相似，其空間構象及功能也越相似。  3.物種越接近，其同類蛋白質一級結構越相似，功能也相似。  但一級結構中有些氨基酸的作用卻是非常重要的，若蛋白質分子中起關鍵作用的氨基酸殘基缺失或被替代，都會嚴重影響其空間構象或生理功能，產生某種疾病，這種由蛋白質分子發生變異所導致的疾病，稱為“分子病”。  (二)蛋白質空間結構與功能的關系

19、0; 蛋白質多種多樣的功能與各種蛋白質特定的空間構象密切相關。其構象發生改變，功能活性也隨之改變。以肌紅蛋白(Mb)和血紅蛋白(Hb)為例闡述蛋白質空間結構與功能的關系。  Mb與Hb都是含有血紅素輔基的蛋白質。攜帶氧的是血紅素中的Fe2+，Fe2有6個配位鍵，其中四個與吡咯環N配位結合，一個與蛋白質的組氨酸殘基結合，另一個即可與氧結合。而血紅素與蛋白質的穩定結合主要靠以下兩種作用:一是血紅素分子中的兩個丙酸側鏈與肽鏈中氨基酸側鏈相連，另一作用即是肽鏈中的組氨酸殘基與血紅素中Fe2+  配位結合。  Mb只有一條肽鏈，故只結

20、合一個血紅素，只攜帶1分子氧，其氧解離曲線為直角雙曲線，而Hb是由四個亞基組成的四級結構，共可結合4分子氧，其氧解離曲線為“S”形曲線，從曲線的形狀特征可知，Hb第一個亞基與O2結合，可促進第二、第三個亞基與O2的結合，前三個亞基與O2結合，又大大促進第四個亞基與O2結合，這種一個亞基與其配體結合后，能影響蛋白質分子中另一亞基與配體結合能力的效應，稱協同效應，O2與Hb之間是促進作用，稱正協同效應。之所以會有這種效應，是因為未結合O2時，Hb結構緊密，此時Hb與O2親和力小，隨著O2的結合，其亞基之間鍵斷裂，空間結構變得松弛，此種狀態Hb與O2親和力即增加。  這種一個氧分

21、子與Hb亞基結合后引起亞基構象變化的效應稱變構效應，有關此效應會在后面酶一章中詳細解釋。肌紅蛋白只有一條肽鏈，不存在協同效應。  由此可見，Hb與Mb在空間結構上的不同，決定了它們在體內發揮不同的生理功能。  八、蛋白質的理化性質及其分離純化  (一)蛋白質的理化性質  pr既具有aa的相關性質，又具有作為生物大分子的一些獨特的性質。  1.蛋白質的兩性電離及等電點，這與aa的性質相似，其氨基、羧基及側鏈的某些基團皆可解離。  當蛋白質溶液處于某一pH時，蛋白質解離成正負離子

22、的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質的等電點。蛋白質溶液的pH大于等電點時，該蛋白質顆粒帶負電荷，反之帶正電荷。體內各種蛋白質的等電點不同，但大多數接近于pH5.0，所以在人體體液pH7.4的環境下，大多數蛋白質解離成陰離子，帶負電。  2.蛋白質的膠體性質  這是pr作為生物大分子才有的性質可將蛋白質溶液看作膠體溶液。pr作為溶液穩定存在的兩大因素:一是蛋白質顆粒表面大多為親水基團，可吸引水分子，使顆粒表面形成一層水化膜，從而阻斷蛋白質顆粒的相互聚集，防止溶液中蛋白質的沉淀析出；二是蛋白質顆粒表面可帶相同電荷顆粒之間相互排斥

23、不易聚集沉淀，也可以起穩定顆粒的作用。若去除蛋白質顆粒這兩個穩定因素，蛋白質極易從溶液中沉淀。  3.蛋白質的變性、沉淀和凝固  這也是pr區別于aa的特有性質。  (1)變性:蛋白質在某些理化因素的作用下，其空間結構受到破壞，從而改變其理化性質，并失去其生物活性，稱為變性。一般認為蛋白質變性并不涉及一級結構的改變，故若蛋白質變性較輕，在去除變性因素后，其仍可恢復原有的構象和功能，稱復性。但若其空間構象遭到嚴重破壞，則去除變性因素也不能復性，稱不可逆變性。引起變性的因素有各種物理或化學因素。蛋白質變性后因其空間結構受到破壞，其性質也受

24、影響，如易沉淀，粘度增加，作為酶其催化活性喪失等。雖然變性后蛋白質失去水化膜，其疏水側鏈暴露，但只要其溶液pH值不等于蛋白質酶等電點，蛋白質仍可不沉淀，故變性后，蛋白質溶解度減少卻并不一定沉淀。  醫學上消毒滅菌，就是基于蛋白質變性的原理，而生物制品的制備和保存則必須防止蛋白質變性。  （2）沉淀:蛋白質在溶液中的穩定因素是水化膜及電荷，因而凡是能消除蛋白質表面的水化膜并中和電荷的試劑均可以引起蛋白質的沉淀。常用的有中性鹽、有機溶劑、某些生物堿試劑、大分子酸類及重金屬鹽類等。  （3）凝固:蛋白質經強酸、強堿作用發生變性后，仍能溶解于

25、強堿或強酸溶液中，若將pH調至等電點，則變性蛋白質立即結成絮狀的不溶解物，此絮狀物仍可溶于強酸和強堿中，如再加熱則絮狀物可變成較堅固的凝塊，此凝塊不易再溶于強酸與強堿中，這種現象稱為蛋白質的凝固作用。如雞蛋煮熟后本來流動的蛋清變成了固體，實際上凝固是蛋白質變性后進一步發展的不可逆的結果。  4蛋白質的紫外吸收。  由于蛋白質分子中含有有共軛雙鍵的酪氨酸、色氨酸，因此在280nm波長處有特征性吸收峰，這與aa相似。在此波長范圍內，蛋白質的吸收光度值與其濃度成正比關系，因此可作蛋白質定量測定。  5蛋白質的呈色反應  

26、1茚三酮反應:與氨基酸作用原理相似。  2雙縮脲反應:肽鍵+硫酸銅>稀堿溶液 紫色、紅色物，氨基酸不出現此反應，故可檢測蛋白質水解程度。  （二）蛋白質的分離與純化  蛋白質的分離純化過程就是巧妙利用蛋白質分子在大小、形狀、所帶電荷種類與數量、極性與非極性氨基酸比例、溶解度、吸附性質以及對其他生物大分子親和力上的差異，將雜蛋白除去的過程，即利用蛋白質物理、化學性質的差異，將不同的蛋白質采用恰當的方法分開，常用的方法如下:  1.根據蛋白質兩性電離及等電點分離的方法:  1等電點沉淀法:因為

27、蛋白質在其等電點的pH值附近易沉淀析出，故利用各種蛋白質等電點的不同，即可將蛋白質從混合溶液中分開。  2電泳:指蛋白質在一定pH情況下帶電荷，在電場中能由電場一極向另一極移動的現象。這實際上也利用了蛋白質分子、形狀的不同，因為游動快慢與蛋白質所帶電荷的性質、數目、分子、形狀有關，對帶相同性質電荷的蛋白質來說，帶電多、分子小及為球狀分子的蛋白質游動速率大，故不同蛋白質得以分離。根據支撐物不同，可分為薄膜電泳和凝膠電泳等。不同支持物，分辨率不同，如正常人血清蛋白電泳僅分出五條區帶，而聚丙烯酰胺凝膠電泳可分出30多條帶。電泳結束后，用蛋白質顯色劑呈色，即可看到一條條已經分離的蛋

28、白質條帶。離子交換層析：在某一特定pH值時，混合蛋白質溶液中各種蛋白質所帶電荷數目及性質不同，事先在層析柱中裝上離子交換劑，其所帶電荷性質與蛋白質電荷性質相反，當蛋白質混合溶液流經層析柱時，即可被吸附于柱上，隨后用與蛋白質帶相同性質電荷的洗脫劑洗脫，蛋白質可被置換下來，由于各種蛋白質帶電量不同，離子交換劑結合的緊密度不同，帶電量小的蛋白質先被洗脫下來，增加洗脫液離子強度，帶電量多的也被洗脫下來，可將蛋白質分離。2利用蛋白質分子量不同分離的方法透析：利用特殊膜制成透析袋，此膜只允許小分子化合物透過，而蛋白質是高分子化合物故留在袋內，故把袋置于水中，蛋白質溶液中的小分子雜質可被去除，如去除鹽析后蛋

29、白質中混雜的鹽類。也常利用此方法濃縮蛋白質。即袋外放吸水劑，小分子的水即可透出，蛋白質溶液可被濃縮。分子篩：也叫凝膠過濾，是層析的一種。層析柱內填充帶有網孔的凝膠顆粒。蛋白質溶液加于柱上，小分子蛋白進入孔內，大分子蛋白不能進入孔內而直接流出，小分子因在孔內被滯留而隨后流出，從而蛋白質得以分離。超速離心：蛋白質膠體溶液與氯化鈉等真溶液不同之處在于：蛋白質在強大離心場中，在溶液中會逐漸沉降，各種蛋白質沉降所需離心力場不同，故可用超速離心法分離蛋白質及測定其分子量，因其結果準確又不使蛋白質變性，故是目前分離生物高分子常用的方法。3.與蛋白質的沉淀的性質相關的分離方法：鹽析：硫酸銨、硫酸鈉等中性鹽因能

30、破壞蛋白質在溶液中穩定存在的兩大因素，故能使蛋白質發生沉淀。不同蛋白質分子顆粒大小不同，親水程度不同，故鹽析所需要的鹽濃度不同，從而將蛋白質分離，如用硫酸銨分離清蛋白和球蛋白，在半飽和的硫酸銨溶液中，球蛋白即可從混合溶液中沉淀析出除掉，而清蛋白在飽和硫酸銨中才會沉淀。鹽析的優點是不會使蛋白質發生變性。丙酮沉淀：丙酮可溶于水，故能與蛋白質爭水破壞其水化膜，使蛋白質沉淀析出，在pH值和離子強度適當的情況下更佳，但丙酮使蛋白質變性，故應低溫快速分離，還可用其他有機溶劑。重金屬鹽沉淀：因其帶正電荷，可與蛋白質負離子結合形成不溶性蛋白鹽沉淀，可利用此性質以大量清蛋白搶救重金屬鹽中毒的人。(三)多肽鏈中氨

31、基酸序列分析主要步驟及原理如下：1純化蛋白質：用于序列分析的蛋白質應是分子大小均一，電游呈現一條帶具有一定純度的樣品。2分析蛋白質的氨基酸組成：用酸、堿等將蛋白質肽鏈水解為游離氨基酸，再用電泳、層析等方法分離、鑒定所有游離氨基酸的種類和含量，現在可用氨基酸自動分析儀來快速測定。3.測定肽鏈中N末端和C末端為何種氨基酸；若蛋白質由兩條以上肽鏈組成，通過末端氨基酸的測定還可估計蛋白質中的肽鏈數目。N末端氨基酸測定：二硝基氟苯、丹磺酰氯都可與末端氨基反應，再用鹽酸等將肽鏈水解，將帶有二硝基氟苯或丹磺酰氯的氨基酸水解下來，即可分離鑒定出為何種氨基酸，因丹磺酰氯具強烈熒光更易鑒別。C末端氨基酸測定：用相

32、應的羧肽酶將C末端氨基酸水解下來，因各種羧肽酸水解氨基酶的專一性不同，故可對C末端氨基酸做出鑒定。4.將鏈間、鏈內二硫鍵打開，否則會阻礙蛋白水解溶劑的作用，常用巰基化合物還原法。 5.選擇適當的酶或化學試劑將肽鏈部分水解成適合作序列分析的小肽段，常用的方法有： 胰蛋白酶法：水解賴氨酸或精氨酸的羧基形成的肽鍵，故若蛋白質分子中有4個精氨酸或賴氨酸殘基，可得5個肽段。胰凝乳蛋白酶法：水解芳香族氨基酸羧基側的肽鍵溴化氰法：水解甲硫氨酸羧基側的肽鍵。6.測定各肽段的氨基酸排列順序：一般采用Edman降解法。因PITC(異硫氰酸苯酯)只與N末端氨基酸作用，用冷稀酸將此末端殘基水解下來，鑒定為何種氨基酸衍

33、生物，殘留的肽段N末端可繼續與PITC反應，依次逐個鑒定出氨基酸的排列順序。7.多肽鏈用兩種方法分別裂解成幾組肽段，并測定每一方法中每一肽段的氨基酸排列順序，肽段重疊法確定整條肽鏈的氨基酸順序，若用兩種方法找不出重疊肽段，就需用第三種、第四種方法，直到找出重疊肽段。8.確定二硫鍵位置：用電泳法將拆開二硫鍵的肽段條帶與未拆開二硫鍵的條帶進行對比即可定位二硫鍵的位置。如此以來，一個完整蛋白質分子的一級結構即可被測定。(四)蛋白質空間結構測定常用的方法有X射線晶體衍射法和二維核磁共振技術，還可根據蛋白質的氨基酸序列預測其三維空間結構。一、核酸的化學組成核酸是以核苷酸為基本組成單位的生物大分子。包括兩

34、類：一類為脫氧核糖核酸（DNA），另一類為核糖核酸（RNA ）。DNA存在于細胞核和線粒體內，攜帶遺傳信息；RNA存在于細胞質和細胞核中，參與細胞內遺傳信息的表達。核酸的基本組成單質是核苷酸，而核苷酸又是由堿基、戊糖、磷酸組成。(一)堿基構成核苷酸的堿基主要有五種，分屬嘌呤和嘧啶兩類。嘌呤類化合物包括腺嘌呤A和鳥嘌呤G兩種。嘧啶類化合物有三種，胞嘧啶C和胸腺嘧啶T尿嘧啶U。嘌呤和嘧啶環中均含有共軛雙鍵，因此對波長260nm左右的紫外光有較強吸收，這一性質可用于對核酸、核苷酸、及堿基進行定性定量分析。(二)戊糖與核苷、核苷酸戊糖是核苷酸的另一個主要成分，RNA和DNA主要區別有兩點：一是構成DN

35、A的堿基為A、T、G、C，而RNA的堿基為A、U、C、G，二是構成DNA的核苷酸的戊糖是-D2-脫氧核糖，而構成DNA的核苷酸的戊糖為-D核糖。即RNA糖環上2號碳原子處連的是-OH，而DNA此處連的是-H。表示堿基和糖環上各原子次序時，在堿基雜環上標以順序1，2，3；在糖環上標以l，2，3 以作區別。堿基與戊糖通過糖苷鍵連接成核苷。連接位置是C-1。核苷與磷酸通過磷酸酯鍵連接成核苷酸連接位置是C-5。此處可連接一個、二個、三個磷酸基團，稱為核苷一磷酸、核苷二磷酸、核苷三磷酸。體內還有一種核苷酸，即C-3與C-5與同一磷酸基團相連，在信號轉導中起重要作用。二、DNA的結構與功能DNA與蛋白質一

36、樣，也有其一級、二級、三級結構。（一） DNA的一級法構指DNA分子中核苷酸的排列順序。由于核苷酸的差異主要表現在堿基上，因此也叫做堿基序列。四種核苷酸按一定排列順序，通過磷酸二酯鍵連成主要核苷酸鏈，連接都是由前一核苷酸3-OH與下一核苷酸5-磷酸基形成3-5磷酸二酯鍵，故核苷酸鏈的兩個末端分別是5-游離磷酸基和3-游離羥基，書寫應從5到3。（二）DNA的二級結構即雙螺旋結構模型，要與蛋白質的-螺旋相區別。1Chargaff規則DNA分子中腺嘌呤與胸腺嘧啶的含量相等，鳥嘌呤與胞嘧啶的含量相等；因此DNA中嘌呤與嘧啶的總數相等：即AG=CT2雙螺旋結構模型1953年Watson和Crick正式提

37、出了關于DNA二級結構的右手雙螺旋結構模型，主要內容有：（1）DNA分子由兩條反向平行的多聚核苷酸鏈圍繞同一中心軸盤曲而成，兩條鏈均為右手螺旋，鏈呈反平行走向，一條走向是53，另一條是35。（2）DNA鏈的骨架由交替出現的親水的脫氧核糖基和磷酸基構成，位于雙螺旋的外側，堿基配對位于雙螺旋的內側。（3）兩條多聚核苷酸鏈以堿基之間形成氫鍵配對而相連，即A與T配對，形成兩個氫鍵，G與C配對，形成三個氫鍵。堿基相互配對又叫堿基互補。RNA中若也有配對區，A是與U以兩個氫鍵配對互補。(4)堿基對平面與螺旋軸幾乎垂直，相鄰堿基對沿軸轉36°，上升034nm。每個螺旋結構含10對堿基，螺旋的距為3

38、4nm，直徑是20nm。DNA兩股鏈之間的螺旋形成凹槽：一條淺的，叫小溝；一條深的，叫大溝。大溝是蛋白質識別DNA的堿基序列發生相互作用的基礎，使蛋白質和DNA可結合而發生作用。DNA雙螺旋結構要與pr的相區別：DNA是兩條核苷酸鏈通過堿基之間氫鍵相連而成，而蛋白質的-螺旋是一條肽鏈自身盤曲而成，其氫鍵是其內部第一位肽鍵的N-H與第四個肽鍵的羰基氧形成的。（5）DNA雙螺旋結構的穩定主要由互補堿基對之間的氫鍵和堿基堆積力來維持。堿基堆積力是堿基對之間在垂直方向上的相互作用，可以使DNA分子層層堆積，分子內部形成疏水核心，這對DNA結構的穩定是很有利的，堿基堆積力對維持DNA的二級結構起主要作用

39、。3DNA結構的多樣性DNA右手雙螺旋結構是DNA分子在水性環境和生理條件下最穩定的結構，但并不是不變的，當改變溶液的離子強度或相對濕度時，DNA結構會發生改變，除了WastonCrick模型（BDNA）外，還存在ZDNA和ADNA（三）DNA三級結構真核生物DNA分子很大，DNA鏈很長，但卻要存在于小小的細胞核內，因此DNA必須在二級結構的基礎上緊密折疊，這就形成了三級結構。1超螺旋原核生物DNA的三級結構絕大部分原核生物DNA是共價閉合的環狀雙螺旋分子，此環形分子可再次螺旋形成超螺旋，真核生物線粒體、葉綠體DNA也為環形分子，能形成超螺旋，非環形DNA分子在一定條件下局部也可形成超螺旋。2

40、.真核細胞基因組DNA真核細胞核內染色體即是DNA高級結構的主要表現形式。組蛋白H2A、H2B、H3、H4各兩分子組成組蛋白八聚體。DNA雙螺旋纏繞其上構成核心顆粒，顆粒之間再以DNA和組蛋白H1連成核小體，核小體再經多步旋轉折疊形成棒狀染色體，存在于細胞核中。(四)DNA的功能DNA的基本功能就是作為生物遺傳信息復制的模板和基因轉錄的模板，是生命遺傳繁殖的物質基礎，也是個體生命活動的基礎。三、RNA的結構與功能RNA通常以單鏈形式存在，這與DNA雙鏈形成螺旋不同，但也可以有局部的二級結構或三級結構。RNA分子比DNA分子小，它的功能多樣，種類較多，主要有信使RNA、核蛋白體RNA、轉運RNA

41、、小核RNA及核不均一RNA等。各類RNA在遺傳信息表達為氨基酸序列過程中發揮不同的作用。（一）信使RNA（mRNA）在細胞核內以DNA單鏈為模板轉錄生成hnRNA,hnRNA經過剪切變為成熟的mRNA,出核后在胞質內為蛋白質合成提供模板。成熟mRNA的結構特點：1具有5端帽子結構即在5端加上一個7-甲基鳥苷；且原來第一個核苷酸C也是甲基化，這種mGpppGm即為帽子結構。2. 3端多聚腺苷酸尾在mRNA3端有一段多聚腺苷酸節段，是在轉錄后切掉一段多余的RNA后逐個添加上去的，這個多聚尾可能與mRNA從核內向細胞質的轉位及mRNA的穩定性有關。3生物體內mRNA種類多，含量少，代謝活躍，在各種

42、RNA分子中，mRNA半衰期最短，這是細胞內蛋白質合成速度的調控點之一。(二)核蛋白體RNA(rRNA)的結構與功能rRNA是細胞內含量最多的RNA，與核糖體蛋白共同構成核糖體蛋白質的合成部位，參與蛋白質的合成。核蛋白體由大亞基和小亞基組成。1.原核生物：小亞基由16SrRNA和20多種蛋白質組成。大亞基由5S、23SrRNA與30余種蛋白質組成。2.真核生物：小亞基由18SrRNA與30余種蛋白質組成。大亞基由5S、5.8S、28SrRNA和近50種蛋白質構成。(三)轉運RNA(tRNA)的結構與功能1.tRNA的一級結構tRNA是細胞內分子量最小的一類核酸，含有大量稀有堿基：如甲基化的嘌呤

43、、雙氫尿嘧啶、次黃嘌呤和假尿嘧啶核苷。假尿嘧啶核苷與一般的嘧啶核苷區別在于以雜環上C-5而非N-1與糖環C-1連成糖苷鍵。tRNA的作用是攜帶相應的氨基酸將其轉運到核蛋白體上以供蛋白質合成。2.tRNA的二級結構呈三葉草樣二級結構：一些能局部互補配對的區域形成局部對鏈，不能配對的部分膨出成環狀。此結構從5末端起第一個環為二氫尿嘧啶環（T），第二個環為反密碼子環，因其環中部的三個堿基可與mRNA中三聯體密碼子形成堿基互補配對，在蛋白質合成過程中解讀密碼子，把正確的氨基酸引入合成位點。第三個環為假尿嘧啶環（DHU），所有tRNA3末端為CCA-OH結構，與氨基酸在此縮合成氨基酰-tRNA，起到轉運

44、氨基的作用。3tRNA的三級結構tRNA的三級結構呈倒L形，T與DHU在二級結構上各處一方，但在三級結構上卻相距很近，維系tRNA三級結構主要是依賴核苷酸之間形成的各種氫鍵。（四）其他類型的RNA如小核RNA（snRNA）參與hnRNA的加工。還有一類RNA分子本身具有自我催化功能，可完成rRNA的剪接。這種具有催化作用的RNA被稱為核酶。要與核酸酶區別，后者是指可水解核酸的酶，故按照底物不同可分為DNA酶和RNA酶。四、核酸的理化性質及其應用（一）核酸的一般理化性質核酸為多元酸，具有較強的酸性。DNA是線性高分子，粘度極大，在機械力作用下易斷裂，因此提取DNA過程中應注意不能過度用力，比如劇

45、烈震蕩吹打等。由于核酸所含的嘌呤和嘧啶分子中都有共軛雙鍵，使核酸分子在紫外260nm波長處有最大吸收峰，這個性質可用于核酸的定量測定。這要與pr在280mm波長處有最大的吸收峰相區別，又因為分子生物學實驗核酸提取過程中，蛋白質是最常見的雜質，故常用UD260/UD280來檢測提取的核酸純度如何。（二) DNA的變性、復性和雜交1變性，這是DNA最重要的一個性質。DNA雙鏈之間以氫鍵連接，氫鍵是一種次級鍵，能量較低，易受破壞，在某些理化因素作用下，DNA分子互補堿基對之間的氫鍵斷裂，使DNA雙螺旋結構松散，變成單鏈，即為DNA變性。DNA變性只涉及二級結構改變，不伴隨一級共價鍵的斷裂。監測DNA

46、是否變性的一個最常用的指標是DNA在紫外區260nm波長處的吸收光值變化。因為DNA變性時，DNA雙鏈發生解離，共軛雙鍵更充分暴露，故DNA變性，DNA在260nm處的吸收光度值增加，并與解鏈程度有一定的比例關系，這種關系叫做DNA的增色效應。DNA的變性從開始到解鏈完全，是在一個相當窄的溫度內完成的，在這一范圍內，紫外光吸收值增加達到最大增加值的50時的溫度叫做DNA的解鏈溫度（Tm）。一種DNA分子的 Tm值的大小與其所含堿基中的 GC的比例相關也與DNA分子大小及變性條件有關，G+C的比例越高，DNA分子越長，溶液離子強度越高，Tm值越大。加熱、低鹽及強酸、強堿均可使DNA變性。2復性變

47、性DNA在適當條件下，兩條互補鏈可重新恢復天然的雙螺旋構象，這種現象稱為復性。熱變性的DNA經緩慢冷卻后即可復性，這一過程也叫退火，一般認為，比Tm值低25的溫度是DNA復性的最佳條件。3DNA復性的實際應用雜交：通過變性DNA的復性性質，我們可知道，DNA單鏈之間、RNA單鏈之間、一條DNA和一條RNA鏈之間只要存在序列互補配對區域，不管是整條鏈互補，還是部分序列互補，即可重新形成整條雙鏈或部分雙鏈，這即為核酸分子雜交，這在分子生物學研究中有極大的應用，比如：可用于在基因組中對特異基因的定位及檢測，PCR技術擴增目的基因等，很多分子生物學實驗技術應用的都是核酸分子雜交的原理，如Souther

48、n Blot, Northern Blot,包括PCR技術等。五、核酸酶指水解核酸的酶，根據底物不同分DNA酶、RNA酶，根據作用位點不同分核酶外切酶和核酸內切酶，其中限制性核酸內切酶在分子生物學技術中的應用尤為重要。一、酶的概念酶通常的定義是指由活細胞合成的對其特異底物起高效催化作用的蛋白質，是機體內催化各種代謝反應最主要的催化劑，但現在已發現存在核酶，其本質為RNA而非蛋白質，主要參與RNA的剪接。根據酶的結構特點可分單體酶、寡聚酶、多酶體系和多功能酶。二、酶的分子組成根據分子組成，酶分為單純酶和結合酶單純酶：僅由氨基酸組成。結合酶：包括兩部分蛋白質部分，稱酶蛋白，決定反應的特異性。非蛋白

49、質部分，多為小分子有機化合物或金屬離子，決定反應的種類與性質。輔助因子又分兩種：輔基：與酶蛋白結合緊密，不能通過透析超濾方法除去，反應中不離開酶蛋白。輔酶：與酶蛋白結合疏松，可用透析、超濾方法去除，反應中可離開酶蛋白，將攜帶的質子或團轉移出去。金屬離子多為酶的輔基，可分為金屬酶、金屬激活酶，小分子有機化合物有的屬于輔酶，有的屬于輔基。結合酶兩部分結合在一起形成的復合物稱全酶，只有全酶才有催化作用。三、酶的活性中心酶分子中與酶的活性密切相關的化學基團叫做酶的必需基團。這些必需基團在一級結構上可能相距很遠，但在空間結構上彼此靠近，組成具有特定空間結構的區域，能與底物特異地結合并將底物轉化成產物，這

50、一區域叫做酶的活性中心，對結合酶來說，輔基或輔酶參與酶活性中心的組成。必需基團活性中心內的必需基團：     （1）催化基團：催化底物發生反應將其轉變為產物。（2）結合基團：與底物特異地結合活性中心外的必需基團：    （1）不參加活性中心的組成，但卻為維持酶活性中心應有的空間構象所必需。酶是一類催化劑，具有一般催化劑的特點，但酶是蛋白質，又具有其自身的特點：1.酶促反應具有極高的效率，酶能比一般催化劑更有效地降低反應的活化能，使底物只需較少的能量便能進人活化狀態。2.酶促反應具有高度特異性，一種酶只作用于一種或一類化合物或一定的化學鍵，進行一種類型的反

51、應，得到一定結構的產物，這種現象稱為酶的特異性。分絕對特異性，相對特異性和立體異構特異性。3.酶促反應的可調節性：酶促反應受多種因素的調控，以適應機體不斷變化的內外環境和生命活動的需要。五、酶促反應的機制（一）酶-底物復合物的形成和誘導契合假說：酶分子構象與作用物結構并不一定完全吻合，當兩者接近時其結構相互誘導、相互變形和相互適應，進而相互緊密結合，即可更利于反應的進行。底物在酶的誘導下發生變形，處于不穩定狀態，易于受酶的攻擊，底物這種不穩定狀態叫做過渡態。（二）鄰近效應與定向排列酶在反應中將諸底物結合到酶的活性中心，使它們相互接近并形成有利于反應的正確定向關系。實際上是將分子間的反應變成類似

52、于分子內的反應，大大提高反應效率。（三）多元催化多元催化指酶同時具有酸和堿的特性。因為酶分子中含有不同功能基團，它們pK值不同，解離度不同，故可起酸的催化作用，也可起堿的催化作用，這種多功能基團的協同作用可極大地提高酶的催化作用。(四）表面效應酶的活性中心內多為疏水環境，底物與酶反應常在酶分子的內部疏水環境中進行，疏水環境排斥了介于底物與酶分子之間的水膜，也消除了水分子對酶和底物功能基團的干擾，有利于底物與酶分子間的直接接觸。 總之，一種酶的催化反應常常是多種催化機制的綜合作用，這是酶促反應提高效率的原因。六、酶促反應動力學酶促反應動力學研究的是酶促反應速度及其影響因素，這些因素包括酶濃度、底

53、物濃度、pH、溫度、抑制劑、激活物等。注意酶促反應動力學中的反應速度一般指反應剛開始的速度，即初速度。(一)底物濃度對反應速度的影響1.在其他因素不變情況下，底物濃度的變化對反應速度(統一用初速度來比較)的影響的作圖呈矩形雙曲線。在底物濃度較低時，V隨S的增加而急劇上升，兩者呈正比關系，因為此時尚有大量游離酶分子可被利用。隨著底物濃度的增加，反應速度不再呈正比加速，因為此時酶已大部分與底物結合，所含游離酶不多，故隨底物濃度的增加，可再利用的酶量有限，故反應速度增加的幅度下降。若繼續增加底物濃度，反應速度不再上升，此時酶的活性中心已被底物飽和。為解釋酶促反應S與V的關系，提出了著名的米氏方程式，

54、即：V=VmaxS/Km+S當底物濃度很低時， KmS，分母S可不計，此時 V=VmaxS/Km,Vmax、Km對同一底物、同一酶、相同反應環境來說是一常數，故反應速度與底物濃度成正比。當底物濃度很高時， KmS，Km可不計，V=Vmax，反應速度達最大速度，再增加S，也不影響反應速度。故從米氏方程中，即可看出底物濃度對反應速度的影響。2.Km的含義：Km是酶的特征常數，它只與酶的結構、酶所催化的底物和反應環境有關，與酶濃度無關。對于同一底物，不同兩酶有不同的Km值，對于同一酶，不同底物也有不同的Km值。由米氏方程，當V=1/2 Vmax時，可得Km=S，由此可見，Km值表示酶促反應速度為最大

55、反應速度一半時的底物濃度。1/Km可近似表示酶對底物親和力的大小，1/m越大表示二者親和力越大，表示不需要很高的底物濃度，便可得到最大反應速度，要注意的是只有在中間產物解離成反應物的速度大大超過其分解成產物速度時才適用。3.要求Km、Vmax，根據底物濃度對速度的矩形曲線求有很大難度，故將米氏方程要采取適當變換，作出直線圖，方可更容易準確地求出Km、Vmax值，雙倒數作圖法是最常用的方法。將米氏方程取倒數：1/V=Km/Vmax*1/S+1/Vmax（二）酶濃度對反應速度的影響。在酶促反應系統中，當底物濃度大大超過酶的濃度，使酶被底物飽和時，反應速度與酶的濃度變化成正比。很顯然若底物濃度很小，酶的濃度本來就很大，再增加酶濃度，對促進反應沒什么意義。所以我們研究酶濃