1、第第十八章十八章 細細 胞胞 工工 程程 目目 錄錄1 1 植物組織培養技術植物組織培養技術2 2 動物細胞培養技術動物細胞培養技術3 3 細胞培養應用細胞培養應用生物制藥生物制藥4 4 動植物新品種創建技術動植物新品種創建技術5 5 生物反應器與組織工程生物反應器與組織工程第第一節一節 植物組織培養技術植物組織培養技術植物人工繁殖的方法（組培）植物人工繁殖的方法（組培）外植體愈傷組織單細胞激素調控體細胞胚器官發生胚胎發育再生植株植物人工種子一、一、植物組織培植物組織培養概述養概述（一）定義（一）定義 植物器官、組織、細胞或原生質體等外植物器官、組織、細胞或原生質體等外植體材料無菌條件下培養在

2、人工培養基上，植體材料無菌條件下培養在人工培養基上，在適當條件下誘發長成在適當條件下誘發長成完整植株完整植株的一種技術。的一種技術。 （二）組織培養的分類（二）組織培養的分類v據外植體不同據外植體不同: :植株培養、器官培養、組織培植株培養、器官培養、組織培養（含愈傷組織）養（含愈傷組織）v據操作方法不同：據操作方法不同：固體培養、液體培養（包固體培養、液體培養（包括振蕩培養、旋轉培養、靜止培養）括振蕩培養、旋轉培養、靜止培養）（三）（三） 植物組織培養植物組織培養條件條件1.生物條件生物條件 外植體外植體（Explant）主要指用于離體培養的）主要指用于離體培養的植物或組織切段植物或組織切段

3、。 因素：因素： 不同植物品種不同植物品種 同一品種不同取材部位、發育階段同一品種不同取材部位、發育階段 一般：生長點、幼嫩組織一般：生長點、幼嫩組織2.2.物理條件物理條件： 培養培養環境、環境、組織培養室組織培養室無菌環境，人工控無菌環境，人工控制溫度、光照、濕度等培養條件。制溫度、光照、濕度等培養條件。 需要一定的設備、器材和用具。需要一定的設備、器材和用具。2.2.物理條件物理條件： 3.3.化學條件化學條件：培養基培養基（1 1）無機鹽無機鹽 培養基中無機鹽的濃度通常在培養基中無機鹽的濃度通常在25mM左左右。右。 根據添加量多少分為根據添加量多少分為大量元素大量元素（濃度大（濃度大

4、于于0.5mmol/L）和）和微量元素微量元素(濃度低于濃度低于0.5mmol/L)。3.3.化學條件化學條件：培養基培養基（1 1）無機鹽無機鹽大量元素大量元素：主要有氮、硫、磷、鉀、鈣、鎂主要有氮、硫、磷、鉀、鈣、鎂。 氮、硫、磷是蛋白質、氨基酸、核氮、硫、磷是蛋白質、氨基酸、核 酸和酶的主要成分酸和酶的主要成分。微量元素微量元素：主要包括鐵、錳、銅、鋅、氯主要包括鐵、錳、銅、鋅、氯、 硼、鉬等。這些微量元素對于蛋白硼、鉬等。這些微量元素對于蛋白 或酶的生物活性十分重要，并參與或酶的生物活性十分重要，并參與 生物過程的調節生物過程的調節。（2 2）有機物有機物 常用的有機物常用的有機物：糖

5、類、氨基酸、維生素糖類、氨基酸、維生素、肌醇、嘌呤類等。肌醇、嘌呤類等。糖類糖類：是離體培養的植物細胞所必需的，既是離體培養的植物細胞所必需的，既可以作為可以作為碳源碳源，又可以維持，又可以維持滲透壓滲透壓。 最常用的碳源是最常用的碳源是蔗糖蔗糖，葡萄糖和果糖也是，葡萄糖和果糖也是較好的碳源。麥芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖較好的碳源。麥芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在組織培養中也有應用。在組織培養中也有應用。蔗糖使用濃度在蔗糖使用濃度在2%2%3%3%。（2 2）有機物有機物氨基酸氨基酸：是很好的有機氮源，可直接被細胞是很好的有機氮源，可直接被細胞吸收利用。培養基中最常用的氨基酸是吸收利用。培養基中

6、最常用的氨基酸是甘氨甘氨酸酸，其他的如，其他的如精氨酸精氨酸、谷氨酸谷氨酸，谷酰胺谷酰胺、天天冬氨酸冬氨酸、天冬酰胺天冬酰胺、丙氨酸丙氨酸等也常用。等也常用。 通常采用蛋白質水解產物（包括酪蛋白水通常采用蛋白質水解產物（包括酪蛋白水解物）、谷氨酰胺或氨基酸解物）、谷氨酰胺或氨基酸混合物混合物。 用量用量：10-1000mg10-1000mgL L維生素維生素：以各種輔酶形式參與多種代謝活動，以各種輔酶形式參與多種代謝活動， 對生長、分化等有好的促進作用。對生長、分化等有好的促進作用。0.1-1mg0.1-1mgL L 常用的維生素包括常用的維生素包括：鹽酸鹽酸硫胺素（硫胺素（V VB1B1）、

7、）、鹽鹽酸酸吡哆醇（吡哆醇（V VB6B6）、）、VcVc（抗壞血酸）、有時還使用（抗壞血酸）、有時還使用生物素生物素、葉酸葉酸、V VB12B12等。等。vV VB1B1對對愈傷組織的產生和生活力愈傷組織的產生和生活力有重要作用有重要作用；vV VB6B6能能促進根的生長促進根的生長；vVcVc有有防止組織變褐防止組織變褐的作用。的作用。肌醇肌醇：對對糖類的相互轉化有促進作用糖類的相互轉化有促進作用。能促進能促進愈傷組織的生長以及胚狀體和芽的形成愈傷組織的生長以及胚狀體和芽的形成。對組織。對組織和細胞的繁殖、分化有促進作用，對細胞壁的形和細胞的繁殖、分化有促進作用，對細胞壁的形成也有作用。成

8、也有作用。使用濃度一般為使用濃度一般為lOOmglOOmgL L。腺嘌呤腺嘌呤：是合成細胞分裂素的前體物質之一是合成細胞分裂素的前體物質之一。添加腺嘌呤添加腺嘌呤能促進細胞合成分裂素能促進細胞合成分裂素，有利于細胞，有利于細胞的分裂和分化，促進芽的形成的分裂和分化，促進芽的形成。（3 3）調節物質調節物質 植物激素植物激素(Phytohormone(Phytohormone) )：是植物自然狀態是植物自然狀態下產生的、對生長發育有顯著作用的微量有機下產生的、對生長發育有顯著作用的微量有機物。物。能影響生長和分化能影響生長和分化。 植物體內的激素與細胞內某種稱為植物體內的激素與細胞內某種稱為激素

9、受激素受體體的蛋白質結合后，的蛋白質結合后，影響影響DNADNA、RNARNA和蛋白質的和蛋白質的合成，并對特殊酶的合成起調控作用，從而表合成，并對特殊酶的合成起調控作用，從而表現出調節代謝的功能。現出調節代謝的功能。生長生長素素(auxin(auxin) )： 是由色氨酸通過一系列中間產物形成的是由色氨酸通過一系列中間產物形成的。生長素主要用來生長素主要用來刺激細胞分裂刺激細胞分裂和和誘導根的分化誘導根的分化 常用的生長素有：吲哚乙酸（常用的生長素有：吲哚乙酸（IAAIAA）、）、2,4-2,4-二氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸( (2,4-D2,4-D) )、萘乙酸、萘乙酸( (NAANAA) )

10、、吲哚丁酸（吲哚丁酸（IBAIBA）等。）等。 生長生長素素(auxin(auxin) )： IAAIAA活力較弱?；盍^弱。 NAANAA和和IBAIBA廣泛用于生根，并與細胞分裂素廣泛用于生根，并與細胞分裂素互作促進芽的增殖和生長?；プ鞔龠M芽的增殖和生長。 2,42,4D D促進愈傷組織的形成上活力最高，促進愈傷組織的形成上活力最高，但它強烈抑制芽的形成。但它強烈抑制芽的形成。細胞分裂素細胞分裂素 （CytokininCytokinin）: : 大多是大多是嘌呤族衍生物嘌呤族衍生物，根，根、莖端、萌發中、莖端、萌發中的種子、發育中的果實和種子都能合成分裂素。的種子、發育中的果實和種子都能合

11、成分裂素。 分裂素的生理作用分裂素的生理作用主要是主要是誘導芽的分化促誘導芽的分化促進側芽萌發生長、促進細胞分裂與擴大進側芽萌發生長、促進細胞分裂與擴大。細胞分裂素細胞分裂素 （CytokininCytokinin）: : 包括激動素（包括激動素（KTKT）、）、6-6-芐基腺嘌呤（芐基腺嘌呤（BABA）和玉米素（和玉米素（ZTZT）等。其中最常用的是）等。其中最常用的是BABA。其中其中ZTZT活性最強，但昂貴，常用的是活性最強，但昂貴，常用的是BABA。激素配比激素配比 （ 生長素生長素/ / 細胞分裂素細胞分裂素） 高高：利于根的形成和愈傷組織的形成利于根的形成和愈傷組織的形成/ / 適

12、中適中：有利于根芽的分化有利于根芽的分化 低低：有利于芽的形成有利于芽的形成19561956年，米勒（年，米勒（MillerMiller）與斯庫格（）與斯庫格（SkoogSkoog）一起提出了一起提出了植物激素控制器官形成植物激素控制器官形成的觀點的觀點。（4 4）其他輔助成分）其他輔助成分v抗生素：抗生素：青霉素、鏈霉素、慶大霉素等，用青霉素、鏈霉素、慶大霉素等，用量在量在5-20mg5-20mgL L之間。之間。v抗酚類氧化物：抗酚類氧化物：半胱氨酸、半胱氨酸、VcVc，可用，可用50-50-200mg200mgL L涂于外植體傷口表面。涂于外植體傷口表面。v活性炭，活性炭，0.5-10g

13、0.5-10gL L，吸附非極性物質和色，吸附非極性物質和色素等大分子物質。素等大分子物質。富鹽平衡培養基富鹽平衡培養基： 使用最廣。代表使用最廣。代表有有MSMS、LSLS、BLBL、BMBM、ERER等。等。 特點是特點是： 無機鹽濃度高，無機鹽濃度高，微量元素種類微量元素種類全；元素間比全；元素間比 例適當，離子平衡性好，例適當，離子平衡性好，具有較強的緩沖能具有較強的緩沖能 力、穩定性好、營養豐富，力、穩定性好、營養豐富，一般培養時無需一般培養時無需 再加入有機成分。再加入有機成分。培養基培養基分類分類 高硝態氮培養基高硝態氮培養基：代表代表有有B5B5、N6N6、SHSH。 特點是：

14、特點是： 硝酸鉀濃度高，氨態氮濃度低，含有較硝酸鉀濃度高，氨態氮濃度低，含有較高濃度的硫胺素（高濃度的硫胺素（VB1VB1）。）。 低鹽培養基低鹽培養基: :代表代表 WhiteWhite、WSWS、HEHE、HBHB 特點是特點是： 無機鹽、有機成分含量濃度低，多用作無機鹽、有機成分含量濃度低，多用作生根培養的培養基生根培養的培養基。 中鹽培養基中鹽培養基：代表有代表有NitschNitsch、MillerMiller、H H、BlaydesBlaydes。大多是在。大多是在MSMS基礎上改良設計基礎上改良設計。 特點是：特點是：大量元素無機鹽為大量元素無機鹽為MSMS的一半，微的一半，微量

15、元素種類減少、含量增高。維生素種類比量元素種類減少、含量增高。維生素種類比MSMS增多，例如增加了生物素、葉酸等增多，例如增加了生物素、葉酸等。二、植物組織培養的技術路線二、植物組織培養的技術路線 （一）培養材料（全能細胞）采集（一）培養材料（全能細胞）采集 受精卵受精卵 分生組織細胞：分生組織細胞：如分生組織、根尖、嫩莖、如分生組織、根尖、嫩莖、幼葉、花等的細胞。幼葉、花等的細胞。 快速繁殖多用莖尖細胞；無病毒培養多僅取快速繁殖多用莖尖細胞；無病毒培養多僅取莖尖分生組織細胞莖尖分生組織細胞 配子和單倍體細胞配子和單倍體細胞（二）培養材料的消毒（二）培養材料的消毒v材料洗凈、瀝干、切成小塊材料

16、洗凈、瀝干、切成小塊 v70%70%酒精或酒精或-10-10H H2 2O O2 2浸泡浸泡30-60s30-60s（無菌）（無菌）v消毒消毒10min10min（飽和漂白粉液或（飽和漂白粉液或0.01%HgCl0.01%HgCl2 2） v無菌水沖洗干凈無菌水沖洗干凈(3-4(3-4次次) )（三）制備外植體（三）制備外植體v將消毒材料按培養要求進行處理（將消毒材料按培養要求進行處理（無菌無菌） 如：切成如：切成0.2-0.5cm0.2-0.5cm厚的小塊厚的小塊( (片片););去去除芽的鱗片、嫩枝的外皮、種皮胚乳等。除芽的鱗片、嫩枝的外皮、種皮胚乳等。但葉片不需剝皮但葉片不需剝皮 注意：

17、注意：整個過程無菌操作；嚴禁用手整個過程無菌操作；嚴禁用手觸摸材料觸摸材料 （四）接種與培養（四）接種與培養v接種：接種：外植體植入培養基上（外植體植入培養基上（4-104-10個個/ /瓶）瓶）v封口：封口：培養瓶、管等用無菌材料密封培養瓶、管等用無菌材料密封v愈傷組織培養：愈傷組織培養：外植體膨大形成愈傷組織外植體膨大形成愈傷組織v增殖：增殖：繼代培養與分化培養。繼代培養與分化培養。 25 25C C左右培養出新梢，分株或切段左右培養出新梢，分株或切段 后于增殖培養基上繼續培養成芽苗后于增殖培養基上繼續培養成芽苗植物組培流程植物組培流程無菌操作及操作車間無菌操作及操作車間植物組培室植物組培

18、室植物組織培養的應用：植物組織培養的應用： v（1 1）試管苗的快速繁殖）試管苗的快速繁殖v（2 2）無病毒植物的培育）無病毒植物的培育v（3 3）品種選育品種選育v（4 4）人工種子）人工種子v（5 5）轉基因植物的培育）轉基因植物的培育三、三、植物組織培養再生植株的途徑植物組織培養再生植株的途徑（一）器官發生途徑（一）器官發生途徑：成熟細胞成熟細胞愈傷組織愈傷組織 出根出芽出根出芽完整植株。完整植株。（二）體細胞胚發生途徑（二）體細胞胚發生途徑： 成熟細胞成熟細胞分生細胞分生細胞胚狀體胚狀體完整植株。完整植株。離體的植物離體的植物器官、組織器官、組織或細胞或細胞 ( (外植體外植體) )愈

19、愈傷傷組組織織根根芽芽植植物物體體脫分化脫分化再分化再分化愈傷組織愈傷組織：是植物細胞脫分化后形成和一種無：是植物細胞脫分化后形成和一種無 定形狀態的薄壁細胞。定形狀態的薄壁細胞。 愈傷組織愈傷組織具有再度分化成其他組織細胞的能力。具有再度分化成其他組織細胞的能力。鐵皮石斛組培苗鐵皮石斛組培苗煉苗與移栽煉苗與移栽煉苗煉苗: : 不打開瓶口強光煉苗不打開瓶口強光煉苗2-32-3天天; ;開口煉苗開口煉苗1-21-2天天. .移栽：移栽： 自來水洗凈培養基（防菌），可再用自來水洗凈培養基（防菌），可再用0.1%-0.1%-0.3%0.3%高錳酸鉀或多菌靈浸泡高錳酸鉀或多菌靈浸泡2020分鐘；苗床上

20、插分鐘；苗床上插孔置苗后孔置苗后加壓加壓苗床上基質（置苗前澆透水），苗床上基質（置苗前澆透水），移到高濕度環境（移到高濕度環境（90%90%）。）。苗苗 床床 三、人工種子三、人工種子（Artificial seed） 所所謂謂人工種子人工種子，就是將組織培養產，就是將組織培養產生的生的體體細胞胚或不定芽細胞胚或不定芽包裹在能提供養分的包裹在能提供養分的膠囊膠囊里里，再在膠囊外包上一層，再在膠囊外包上一層具有保護功能具有保護功能和防和防止止機械損傷的外膜機械損傷的外膜，造成一種類似于種，造成一種類似于種子的子的結結構。構。 （一）結構（一）結構 天然種子的結構：天然種子的結構： （一）結構（一

21、）結構 天然種子的結構：天然種子的結構： （一）結構（一）結構 從外向里包括三部分從外向里包括三部分： 1. 1.人工種皮人工種皮外層，保護胚狀體中的水分免于外層，保護胚狀體中的水分免于喪失和防止外部力量沖擊；喪失和防止外部力量沖擊； 2. 2.人工胚乳人工胚乳，含有必需的營養成分和某些植，含有必需的營養成分和某些植物激素；物激素； 3. 3.胚狀體或芽。胚狀體或芽。胚狀體胚狀體人工種皮人工種皮人工胚乳人工胚乳（二）人工種子的優點二）人工種子的優點v1.1.便于運輸和儲藏便于運輸和儲藏（相對于試管苗）（相對于試管苗）。v2.2.人工胚乳可根據不同植物的要求配制，通人工胚乳可根據不同植物的要求配

22、制，通過加入植物激素、有益微生物或抗病、抗蟲過加入植物激素、有益微生物或抗病、抗蟲成分，使人工種子優越于天然種子。成分，使人工種子優越于天然種子。 v3.3.可以固定雜種優勢，加速良種繁育?？梢怨潭s種優勢，加速良種繁育。v4.4.可作為植物基因工程和遺傳工程的載體?？勺鳛橹参锘蚬こ毯瓦z傳工程的載體。v5.5.可保存珍貴稀有植物品種。可保存珍貴稀有植物品種。（三）人工種子的制作（三）人工種子的制作 1. 1.胚狀體同步發育胚狀體同步發育v抑制劑法抑制劑法：在細胞培養初期加入細胞分裂抑在細胞培養初期加入細胞分裂抑制劑（如制劑（如5-5-氨基尿嘧啶），一旦去除抑制劑氨基尿嘧啶），一旦去除抑制劑后

23、細胞可以同步發育。后細胞可以同步發育。v低溫法低溫法：低溫處理抑制細胞分裂，再恢復正低溫處理抑制細胞分裂，再恢復正常溫度可以使細胞分裂同步化常溫度可以使細胞分裂同步化。（三）人工種子的制作（三）人工種子的制作 1. 1.胚狀體同步發育胚狀體同步發育v滲透壓法滲透壓法：不同發育時期的胚狀體對滲透壓不同發育時期的胚狀體對滲透壓的要求不同，用一定的滲透壓使胚狀體停止的要求不同，用一定的滲透壓使胚狀體停止在某一階段，然后再使其同步發育在某一階段，然后再使其同步發育。v通氣法通氣法：細胞分裂旺盛時有大量氣體（如乙細胞分裂旺盛時有大量氣體（如乙烯等）生成。可以通過在培養基中通入乙烯烯等）生成?？梢酝ㄟ^在培養基中通入乙烯或氮氣控制細胞同步分裂或氮氣控制細胞同步分裂。（三）人工種子的制作（三）人工種子的制作 1. 1.