1、菌株分離（separation）就是將一個(gè)混雜著各種微生物的樣品通過分離技術(shù)區(qū)分開，并按照實(shí)際要求和菌株的特性采取 迅速、準(zhǔn)確、有效的方法對(duì)他們進(jìn)行分離、篩選，進(jìn)而得到所需微生物的過程。菌株分離、篩選（screening）雖為兩個(gè)環(huán)節(jié)，但卻不能絕然分開，因?yàn)榉?離中的一些措施本身就具有篩選作用。工業(yè)微生物產(chǎn)生菌的篩選一般包括兩大部分：一是從自然界分離所需要的菌株，二是把分離到的野生型菌株進(jìn)一步純化并進(jìn)行 代謝產(chǎn)物鑒別。在實(shí)驗(yàn)工作中，為使篩選達(dá)到事半功倍的效果，總的說來可從以下幾個(gè)途徑進(jìn)行收集和篩選：（1）向菌種保藏機(jī)構(gòu)索取有關(guān)的菌株，從中篩選所需菌株。（2）由自然界采集樣品，如土壤、水、動(dòng)植物

2、體等，從中進(jìn)行分離篩選。（3）從一些發(fā)酵制品中分離目的菌株，如從醬油中分離蛋白酶產(chǎn)生菌，從酒醪中分離淀粉酶或糖化酶的產(chǎn)生菌等。該類發(fā)酵制品經(jīng)過長(zhǎng)期的自然選擇，具有悠久的歷史，從這些傳統(tǒng)產(chǎn)品中容易篩選到理想的菌株。菌株的分離和篩選一般可分為采樣、富集、分離、產(chǎn)物鑒別幾個(gè)步驟。第一節(jié)   含微生物樣品的采集自然界含菌樣品極其豐富，土壤、水、空氣、枯枝爛葉、植物病株、爛水果等都含有眾多微生物，種類數(shù)量十分可觀。但總體來講土壤樣品的含菌量最多。一、從土壤中采樣土 壤由于具備了微生物所需的營(yíng)養(yǎng)、空氣和水分，是微生物最集中的地方。從土壤中幾乎可以分離到任何所需的菌株，空氣、水中的微生物

3、也都來源于土壤，所以土壤 樣品往往是首選的采集目標(biāo)。一般情況下，土壤中含細(xì)菌數(shù)量最多，且每克土壤的含菌量大體有如下的遞減規(guī)律：細(xì)菌（108）>放線菌（107） >霉菌（106）>酵母菌 （105）>藻類（104）>原生動(dòng)物（103），其中放線菌和霉菌指其孢子數(shù)。但各種微生物由于生理特性不同，在土壤中的分布也隨著地理?xiàng)l 件、養(yǎng)分、水分、土質(zhì)、季節(jié)而有很大的變化。因此，在分離菌株前要根據(jù)分離篩選的目的，到相應(yīng)的環(huán)境和地區(qū)去采集樣品。（一）根據(jù)土壤特點(diǎn)1土壤有機(jī)質(zhì)含量和通氣狀況一般耕作土、菜園土和近郊土壤中有機(jī)質(zhì)含量豐富，營(yíng)養(yǎng)充足，且土壤成團(tuán)粒結(jié)構(gòu)，通氣飽水性能好，因而

4、，微生物生長(zhǎng)旺盛，數(shù)量多，尤其適合于細(xì)菌、放線菌生長(zhǎng)。山坡上的森林土，植被厚，枯枝落葉多，有機(jī)質(zhì)豐富，且陰暗潮濕，適合霉菌、酵母菌生長(zhǎng)繁殖，微生物數(shù)量相應(yīng)也比較少。從 土層的縱剖面看，15cm的表層土由于陽光照射，蒸發(fā)量大，水分少，且有紫外線的殺菌作用，因而微生物數(shù)量比525cm土層少；25cm以下土層則因 土質(zhì)緊密，空氣量不足，養(yǎng)分與水分缺乏，含菌量也逐步減少。因此，采土樣最好的土層是525cm。一般每克土中含菌數(shù)約幾十萬到幾十億個(gè)，并且各種類型 的細(xì)菌和放線菌幾乎都能分離到。如好氣芽孢桿菌、假單胞菌、短桿菌、大腸桿菌、某些嫌氣菌等。但總的說來酵母菌分布土層最淺，約510cm，霉菌和好氧芽孢

5、桿菌也分布在淺土層。2.土壤酸堿度和植被狀況土壤酸堿度會(huì)影響微生物種類的分布。偏堿的土壤（pH7.07.5）環(huán)境，適合于細(xì)菌、放線菌生長(zhǎng)。反之在偏酸的土壤（pH7.0以下）環(huán)境下，霉菌、酵母菌生長(zhǎng)旺盛。由于植物根部的分泌物有所不同，因此，植被對(duì)微生物分布也有一定的影響。如番茄地或腐爛番茄堆積處有較多維生素C生產(chǎn)菌。葡萄或其他果樹在果實(shí)成熟時(shí)，其根部附近土壤中酵母菌數(shù)量增多。豆科植物的植被下，根瘤菌數(shù)量比其他植被下占優(yōu)勢(shì)。3地理?xiàng)l件南方土壤比北方土壤中的微生物數(shù)量和種類都要多，特別是熱帶和亞熱帶地區(qū)的土壤。許多工業(yè)微生物菌種，如抗生素產(chǎn)生菌，尤其是霉菌、酵母菌，大多從南方土壤中篩選出來。原因是南

6、方溫度高，溫暖季節(jié)長(zhǎng)，雨水多，相對(duì)濕度高，植物種類多，植被覆蓋面大，土壤有機(jī)質(zhì)豐富，造成得天獨(dú)厚的微生物生長(zhǎng)環(huán)境。4季節(jié)條件不 同季節(jié)微生物數(shù)量有明顯的變化，冬季溫度低，氣候干燥，微生物生長(zhǎng)緩慢，數(shù)量最少。到了春天隨著氣溫的升高，微生物生長(zhǎng)旺盛，數(shù)量逐漸增加。但就南方來 說，春季往往雨水多，土壤含水量高，通氣不良，即使有微生物所需的溫度、濕度，也不利于其生長(zhǎng)繁殖。隨后經(jīng)過夏季到秋季，約有710個(gè)月處在較高的溫度 和豐富的植被下，土壤中微生物數(shù)量比任何時(shí)候都多，因此，秋季采土樣最為理想。（二）采樣方法用取樣鏟，將表層5cm左右的浮土除去，取 525處的土樣1025，裝入事先準(zhǔn)備好的塑料袋內(nèi)扎好。

7、北方土壤干燥，可在1030處取樣。給塑料袋編號(hào)并記錄地點(diǎn)、土壤質(zhì)地、植被名稱、時(shí)間及 其他環(huán)境條件。一般樣品取回后應(yīng)馬上分離，以免微生物死亡。但有時(shí)樣品較多，或到外地取樣，路途遙遠(yuǎn)，難以做到及時(shí)分離，則可事先用選擇性培養(yǎng)基做好試管 斜面，隨身帶走。到一處將取好的土樣混勻，取34撒到試管斜面上，這樣可避免菌株因不能及時(shí)分離而死亡。二根據(jù)微生物生理特點(diǎn)采樣1.根據(jù)微生物營(yíng)養(yǎng)類型每 種微生物對(duì)碳氮源的需求不一樣,分布也有差異。研究表明，微生物的營(yíng)養(yǎng)需求和代謝類型與其生長(zhǎng)環(huán)境有著很大的相關(guān)性。如森林土有相當(dāng)多枯枝落葉和腐爛的 木頭等，富含纖維素，適合利用纖維素作碳源的纖維素酶產(chǎn)生菌生長(zhǎng)；在肉類加工廠附

8、近和飯店排水溝的污水、污泥中，由于有大量腐肉、豆類、脂肪類存在，因 而，在此處采樣能分離到蛋白酶和脂肪酶的產(chǎn)生菌；在面粉加工廠、糕點(diǎn)廠、酒廠及淀粉加工廠等場(chǎng)所，容易分離到產(chǎn)生蛋白酶、糖化酶的菌株。若要篩選以糖質(zhì)為 原料的酵母菌， 通常到蜂蜜、蜜餞、甜果及含糖濃度高的植物汁液中采樣。在篩選果膠酶產(chǎn)生菌時(shí)，由于柑橘、草莓及山芋等果蔬中含有較多的果膠，因此，從上述樣品的腐爛部分 及果園土中采樣較好。若需要篩選代謝合成某種化合物的微生物，從大量使用、生產(chǎn)或處理這種化合物的工廠附近采集樣品，容易得到滿意的結(jié)果。在油田附近的土 壤中就容易篩選到利用碳?xì)浠衔餅樘荚吹木辍artman等人曾從乙烯氯化物的

9、工廠附近分離到一株以乙烯氯化物為碳源和能源的分枝桿菌。含1%乙烯氯 化物的空氣通過該菌培養(yǎng)可除去93%的毒性。也有人從含油污泥中篩選出能以20#機(jī)械潤(rùn)滑油為惟一碳源的株石油降解菌菌株，分別為動(dòng)膠菌屬 （Zoogloea sp.）、氮單胞菌屬（Azomonas sp.）和假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）。當(dāng)然，也可將一種需要降解的物質(zhì)作為樣品中微生物的惟一碳源或氮源進(jìn)行富集，然后分離篩選。此外，不少微生物對(duì)碳源的利用是不完全專一 的，如以油脂為碳源的某些脂肪酶產(chǎn)生菌同樣也可以分解淀粉或其他糖類物質(zhì)獲得能源而生長(zhǎng)。以石油等碳?xì)浠衔餅樘荚吹挠吞镂⑸铮部梢岳靡恍┨穷悶樘?源。具有以

10、上特性的微生物在一般土壤、水、及其他樣品中也會(huì)存在。不過數(shù)量較少。.根據(jù)微生物的生理特性在篩選一些具有特殊性質(zhì)的微生 物時(shí)，需根據(jù)該微生物獨(dú)特的生理特性到相應(yīng)的地點(diǎn)采樣。如篩選高溫酶產(chǎn)生菌時(shí)，通常到溫度較高的南方，或溫泉、火山爆發(fā)處及北方的堆肥中采集樣品；分離低 溫酶產(chǎn)生菌時(shí)可到寒冷的地方，如南北極地區(qū)、冰窖、深海中采樣；分離耐壓菌則通常到海洋底部采樣。因?yàn)樯詈Ｖ猩畹奈⑸锬苣秃芨叩撵o水壓，如從海中篩到 一株水活微球菌（Micrococcus aquivivus）,它能在600個(gè)大氣壓下生長(zhǎng)。分離耐高滲透壓酵母菌時(shí)，由于其偏愛糖分高、酸性的環(huán)境，一般在土壤中分布很少，因此，通常到甜果、蜜餞或

11、甘蔗渣堆積處采樣。如有人曾在花蜜中分離到一株能耐30%高糖的耐高滲透壓的酵母菌。三、特殊環(huán)境下采樣1局部環(huán)境條件的影響值 得注意的是微生物的分布除了本身的生理特性和環(huán)境條件綜合因素的影響之外，還要受局部環(huán)境條件的影響。如北方氣候寒冷，年平均溫度低，高溫微生物相對(duì)較 少。但在該地區(qū)的溫泉或堆肥中，卻會(huì)出現(xiàn)為數(shù)眾多的高溫微生物。氧氣充足的土層中按理只適合于好氧菌生長(zhǎng)，實(shí)際上也有一些嫌氣菌生活，原因是好氣菌生長(zhǎng)繁 殖消耗了土層中大量氧氣，為嫌氣菌創(chuàng)造了局部生長(zhǎng)的有利環(huán)境，故一般土壤中也能分離到嫌氣菌。海洋對(duì)于微生物來說是一個(gè)特殊的局部環(huán)境，盡管許多 微生物也是經(jīng)河水、污水、雨水或塵埃等途徑而來，但由

12、于海洋獨(dú)特的高鹽度、高壓力、低溫及光照條件，使海洋微生物具備特殊的生理活性，相應(yīng)也產(chǎn)生了一些不 同于陸地來源的特殊產(chǎn)物。前蘇聯(lián)學(xué)者發(fā)現(xiàn)，20%50%的海鞘、海參體內(nèi)的微生物可產(chǎn)生具有細(xì)菌毒性和殺菌活性的化合物。此外，美國(guó)馬里蘭大學(xué)也曾從海 綿體內(nèi)的共生或共棲的細(xì)菌中分離到抗白血病、 鼻咽癌的抗癌物質(zhì)。日本發(fā)現(xiàn)深海魚類腸道內(nèi)的嗜壓古細(xì)菌，80%以上的菌株可以生產(chǎn)EPA 和DHA，最高產(chǎn)量可達(dá)36%和24%。筆者從鱈魚腸道中分離到一株pj20細(xì)菌，產(chǎn)EPA14.78mg/L，在15培養(yǎng)時(shí)EPA占脂肪酸的 12.7%。日本也從海洋Thraustochvtrium aureum中篩選到一株產(chǎn)DNA達(dá)2

13、90mg/L的菌株。從海洋中采樣時(shí)，可參考其中不同種類微生物的分布規(guī)律：表層多為好氣異養(yǎng)菌，底層由于有機(jī)質(zhì)豐 富，硫化氫含量高，厭氣性腐敗菌和硫酸鹽還原菌較多，兩層中則多為紫硫菌。具有特殊性質(zhì)的微生物通常分布在一些特殊的環(huán)境中。如得克薩斯州中南部 的一個(gè)巖洞中存在著大量嗜堿性的，能進(jìn)行氨氧化和產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的微生物，其原因是這里生活這2000萬只蝙蝠，它們每晚吃釣5萬lb（磅）昆蟲，其排泄物造 成了洞內(nèi)0m深的豐富營(yíng)養(yǎng)層，這種特殊的環(huán)境對(duì)該種微生物起了選擇和富集的作用。還有人從侵蝕木船的一種蠕蟲腸道中分離到既能固氮又能降解纖維素的微生 物。從考拉(Koala)熊腸中也曾分離到萜烯分解酶的產(chǎn)生菌，這

14、可能因?yàn)榭祭瓕３院懈咻葡┑蔫駱漕愔参铮o該種微生物創(chuàng)造了一個(gè)適宜的生長(zhǎng)環(huán)境。美國(guó) 從用硝酸處理過的花生殼中分離到一株節(jié)桿菌，該菌以木質(zhì)素為唯一碳源，它對(duì)處理過的花生殼的消化率可達(dá)到63%，再加入釀酒酵母使其蛋白質(zhì)含量達(dá)到13.6%，可作為牛、豬、雞飼料的添加劑。2極端環(huán)境條件的影響微 生物一般在中溫、中性pH條件下生長(zhǎng)。但在絕大多數(shù)微生物所不能生長(zhǎng)的高溫、低溫、高酸、高堿、高鹽或高輻射強(qiáng)度的環(huán)境下，也有少數(shù)微生物存在，這類微生 物被稱為極端微生物。生活所處的特殊環(huán)境，導(dǎo)致它們具有不同與一般微生物的遺傳特性、特殊結(jié)構(gòu)和生理機(jī)能，因而在冶金、采礦及生產(chǎn)特殊酶制劑方面有著巨大 的應(yīng)用價(jià)值。嗜冷菌（

15、thermophiles）的最適生長(zhǎng)溫度為15，在0也可生長(zhǎng)繁殖，最高溫度不超過20。主要分布于寒冷的環(huán)境中， 如南北兩極地區(qū)、冰窟、高山、深海和土壤等低溫環(huán)境中。這類微生物在低溫發(fā)酵時(shí)可生產(chǎn)許多風(fēng)味食品且可節(jié)約能源及減少中溫菌的污染。最適生長(zhǎng)pH在8.0 以上，通常在pH910之間的微生物，稱之為嗜堿菌（alkaliphiles）。大量不同類型的嗜堿菌已經(jīng)從土壤、堿湖、堿性泉甚至海洋中分離得到。 由于大部分堿湖伴有高鹽，許多嗜堿菌同時(shí)也是嗜鹽菌。該類菌所產(chǎn)生的酶如耐堿蛋白酶和堿性纖維素酶可作為洗滌劑的舔加成分，也可將堿性淀粉酶用于紡織品工 業(yè)。嗜堿菌中的基因還可以用來調(diào)節(jié)其他細(xì)菌中基因產(chǎn)物的

16、表達(dá)和分泌。嗜熱微生物是嗜熱菌最好的來源。有人從溫泉和海底火山口分離出了極端嗜熱菌。從意大利 境內(nèi)的噴硫磺氣的火山口中分離到一種原始的微生物，在pH2和90時(shí)生長(zhǎng)最好，其代謝類型極不尋常，既能作為耗氧型自養(yǎng)菌將硫氧化成硫酸，使自己增殖， 又能作為厭氧菌用氫還原硫，生成H2S。第二節(jié)   含微生物樣品的富集培養(yǎng)富集（enrichment）培養(yǎng)是在目的微生物含量較少時(shí)，根據(jù)微生物的生理特點(diǎn)，設(shè)計(jì)一種選擇性培養(yǎng)基，創(chuàng)造有利的生長(zhǎng)條件，使目的微生物在最適的環(huán)境下迅速地生長(zhǎng)繁殖，數(shù)量增加，由原來自然條件下的劣勢(shì)種變成人工環(huán)境下的優(yōu)勢(shì)種，以利分離到所需要的菌株。富集培養(yǎng)主要根據(jù)微生物的

17、碳、氮源、pH、溫度、需氧等生理因素加以控制。一般可從以下幾個(gè)方面來進(jìn)行富集。一、控制培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分微 生物的代謝類型十分豐富，其分布狀態(tài)隨環(huán)境條件的不同而異。如果環(huán)境中含有較多某種物質(zhì)，則其中能分解利用該物質(zhì)的微生物也較多。因此，在分離該類菌株之 前，可在增殖培養(yǎng)基中人為加入相應(yīng)的底物作惟一碳源或氮源。那些能分解利用的菌株因得到充足的營(yíng)養(yǎng)而迅速繁殖，其他微生物則由于不能分解這些物質(zhì)，生長(zhǎng)受 到抑制。當(dāng)然，能在該種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的微生物并非單一菌株，而是營(yíng)養(yǎng)類型相同的微生物群。富集培養(yǎng)基的選擇性只是相對(duì)的，它只是微生物分離中的一個(gè)步驟。現(xiàn) 舉兩例，如要分離水解酶產(chǎn)生菌，可在富集培養(yǎng)基中以相應(yīng)底

18、物為惟一碳源，加入含菌樣品，給目的微生物以最佳的培養(yǎng)條件（pH、溫度、營(yíng)養(yǎng)、通氣等）進(jìn)行培 養(yǎng)。能分解利用該底物的菌類得以繁殖，而其他微生物則因得不到碳源無法生長(zhǎng)，菌數(shù)逐漸減少。此時(shí)分離將得到所需的微生物。又如要分離耐高滲酵母菌，由于該類菌在一般樣品中含量很少，富集培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件必須嚴(yán)密設(shè)計(jì)。首先要到含糖分高的花蜜、糖質(zhì)中去取樣。富集培養(yǎng)基為5%6%的麥牙汁，30%40%葡萄糖，pH34，在2025溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，可以達(dá)到富集的目的。在富集培養(yǎng)時(shí)，還需根據(jù)微生物的不同種類選用相應(yīng)的富集培養(yǎng)基，如淀粉瓊脂培養(yǎng)基通常用于絲狀真菌的增殖，配方為（%）：可溶性淀粉4，酵母浸膏0.5，瓊脂2，pH6.

19、57.0。在配制時(shí)要特別注意酵母浸膏加量，過多會(huì)刺激菌絲生長(zhǎng)，而不利于孢子的產(chǎn)生。根 據(jù)微生物對(duì)環(huán)境因子的耐受范圍具有可塑性的特點(diǎn)，可通過連續(xù)富集培養(yǎng)的方法分離降解高濃度污染物的環(huán)保菌。如以苯胺作惟一碳源對(duì)樣品進(jìn)行富集培養(yǎng)，待底物 完全降解后，再以一定接種量轉(zhuǎn)接到新鮮的含苯胺的富集培養(yǎng)液中，如此連續(xù)移接培養(yǎng)數(shù)次。同時(shí)將苯胺濃度逐步提高，便可得到降解苯胺占優(yōu)勢(shì)的菌株培養(yǎng)液，采 用稀釋涂布法或平板劃線法進(jìn)一步分離，即可得到能降解高濃度苯胺的微生物。移種的時(shí)間既可根據(jù)底物的降解情況，也可通過微生物的生長(zhǎng)情況確定。如在分離環(huán) 己烷降解菌時(shí)，樣品經(jīng)環(huán)己烷為惟一碳源的培養(yǎng)基富集后，培養(yǎng)液由原來的無色變?yōu)闇?/p>

20、濁的乳白色。同時(shí)錐行瓶壁上也可觀察到微生物的生長(zhǎng)情況。此時(shí)可以2%的 接種量移入新鮮的富集培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。連續(xù)富集培養(yǎng)的方法雖耗時(shí)較長(zhǎng)，有時(shí)甚至需要67個(gè)月，但效果較好。通過該方法分離DDT、甲基對(duì)硫磷（MP） 及其他一些污染物的分解菌，也都取得了滿意的結(jié)果。               二、控制培養(yǎng)條件在篩選某些微生物時(shí)，除通過培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的選擇外，還可通過它們對(duì)pH、溫度及通氣量等其他一些條件的特殊要求加以控制培養(yǎng)，達(dá)到有效的分離目的。如細(xì)菌、放線菌的生長(zhǎng)繁殖一般要求偏堿（7.07.5）

21、，霉菌和酵母菌要求偏酸（4.56）。因此，富集培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)到被分離微生物的要求范圍不僅有利于自身生長(zhǎng)，也可排除一部分不需要的菌類。分離放線菌時(shí)，可將樣品液在40恒溫預(yù)處理20分鐘，有利于孢子的萌發(fā)，可以較大的增加放線菌數(shù)目，達(dá)到富集的目的。篩選極端微生物時(shí)，需針對(duì)其特殊的生理特性，設(shè)計(jì)適宜的培養(yǎng)條件，達(dá)到富集的目的。一般所篩選的微生物通常是好氧菌，但有時(shí)也需分離厭氧菌。因嚴(yán)格厭氧菌不僅可省略通氣、攪拌裝置，還可節(jié)省能耗。這時(shí)除了配置特殊的培養(yǎng)基外，還需準(zhǔn)備特殊的培養(yǎng)裝置，創(chuàng)造一個(gè)有利于厭氧菌的生長(zhǎng)環(huán)境，使其數(shù)量增加，易于分離。       

22、;      三、抑制不需要的菌類在分離篩選的過程中，除了通過控制營(yíng)養(yǎng)和培養(yǎng)條件，增加富集微生物的數(shù)量以有利于分離外，還可通過高溫、高壓、加入抗生素等方法減少非目的微生物的數(shù)量，使目的微生物的比例增加，同樣能夠達(dá)到富集的目的。從 土壤中分離芽孢桿菌時(shí)，由于芽孢具有耐高溫特性，100很難殺死，要在121才能徹底死亡。可先將土樣加熱到80或在50%乙醇溶液中浸泡1h，殺 死不產(chǎn)芽孢的菌種后再進(jìn)行分離。在富集培養(yǎng)基中加入適量的膽鹽和十二烷基磺酸鈉可抑制革蘭陽性菌的生長(zhǎng)，對(duì)革蘭陰性無抑制作。分離厭氧菌時(shí)，可加入少量硫 乙醇酸鈉作為還原劑，它能使培養(yǎng)基氧化還原電勢(shì)下降，造成

23、缺氧環(huán)境，有利于厭氧菌的生長(zhǎng)繁殖。篩選霉菌時(shí)，可在培養(yǎng)基中加入四環(huán)素等抗生素抑制細(xì) 菌，使霉菌在樣品的比例提高，從中便于分離到所需的菌株；分離放線菌時(shí)，在樣品懸浮液中加入10滴10%的酚或加青霉素（抑制G+菌）、鏈霉素（抑制G- 菌）各3050U/ml，以及丙酸鈉10g/ml（抑制霉菌類）抑制霉菌和細(xì)菌的生長(zhǎng)。另外據(jù)報(bào)道，重鉻酸鉀對(duì)土壤真菌、細(xì)菌有明顯的抑制作用，也可 用于選擇分離放線菌。在分離除鏈霉菌以外的放線菌時(shí)，先將土樣在空氣中干燥，再加熱到100保溫1h，可減少細(xì)菌和鏈霉菌的數(shù)量。分離耐高濃度酒精和高 滲酵母菌時(shí)，可分別將樣品在高濃度酒精和高濃度蔗糖溶液中處理一段時(shí)間，殺死非目的微生物

24、后再進(jìn)行分離。對(duì)于含菌數(shù)量較少的樣品或分離一些稀有微生物時(shí)，采用富集培養(yǎng)以提高分離工作效率是十分必要的。但是如果按通常分離方法，在培養(yǎng)基平板上能出現(xiàn)足夠數(shù)量的目的微生物，則不必進(jìn)行富集培養(yǎng)，直接分離、純化即可。第三節(jié)   微生物的分離經(jīng)富集培養(yǎng)以后的樣品，目的微生物得到增殖，占了優(yōu)勢(shì)，其他種類的微生物在數(shù)量上相對(duì)減 少，但并未死亡。富集后的培養(yǎng)液中仍然有多種微生物混雜在一起，即使占了優(yōu)勢(shì)的一類微生物中，也并非純種。例如同樣一群以油脂為碳源的脂肪酶產(chǎn)生菌，有的 是細(xì)菌，有的是霉菌，有的是芽孢桿菌，有的不產(chǎn)芽孢，有的生產(chǎn)能力強(qiáng)，有的生產(chǎn)能力弱等等。因此，經(jīng)過富集培養(yǎng)后的樣品，也

25、需要進(jìn)一步通過分離純化，把最 需要的菌株直接從樣品中分離出來。一、好氣微生物的分離分離的方法很多，大體可分為兩類：一類較為粗放，只能達(dá)到“菌落純”，如稀釋涂布 法，劃線分離法，組織分離法等。前兩種方法由于操作簡(jiǎn)便有效，工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用較多。組織分離法則通常是從有病或特殊組織中分離菌株。另一類是較細(xì)的單細(xì)胞 或單孢子分離方法，可達(dá)到“菌株純”或“細(xì)胞純”的水平。這類方法需采用專門的儀器設(shè)備，復(fù)雜的如顯微操作裝置，簡(jiǎn)單的可利用培養(yǎng)皿或凹玻片作分離小室進(jìn) 行分離。下面對(duì)這幾種分離純化方法分別加以介紹。           

26、（一）        稀釋涂布法把土壤樣品以十倍的級(jí)差，用無 菌水進(jìn)行稀釋，取一定量的某一稀釋度的懸浮液，涂抹于分離培養(yǎng)基的平板上，經(jīng)過培養(yǎng)，長(zhǎng)出單個(gè)菌落，挑取需要的菌落移到斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)。土壤樣品的稀釋 程度，要看樣品中的含菌數(shù)多少，一般有機(jī)質(zhì)含量高的菜園土等，樣品中含菌量大，稀釋倍數(shù)高些，反之稀釋倍數(shù)低些。采用該方法，在平板培養(yǎng)基上得到單菌落的 機(jī)會(huì)較大，特別適合于分離易蔓延的微生物。（二）        劃線分離法用接種環(huán)取部分樣品或菌體，在事先已準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基平板上劃線，當(dāng)單個(gè)菌落長(zhǎng)出后，將菌落移入斜面培

27、養(yǎng)基上，培養(yǎng)后備用。該分離方法操作簡(jiǎn)便、快捷，效果較好。在 樣品含菌量較少或某種目的微生物不多的情況下，微生物的純種分離方法可以簡(jiǎn)化如下：第一種方法，取一支盛有35ml無菌水的粗試管或小三角瓶，取混勻的 樣品少許（0.5g左右）放入其中，充分振蕩分散，用滅菌滴管取一滴土壤懸液于瓊脂平板上涂抹培養(yǎng)，或者用接種環(huán)接一環(huán)于平板上劃線培養(yǎng)。這種方法不需要 菌落計(jì)數(shù)，比以上常規(guī)稀釋法簡(jiǎn)便。第二種方法，取風(fēng)干粉末狀的土樣少許（幾十毫克）直接灑在選擇性分離培養(yǎng)基平板上或混入培養(yǎng)基中制成平板，置適溫培養(yǎng)一 定時(shí)間，長(zhǎng)出菌落。例如分離小單孢菌就可采用該方法，從河泥中取樣，風(fēng)干研碎，取樣品粉末2050mg直接加到

28、天門冬酰胺培養(yǎng)基中，混合均勻制成平板， 培養(yǎng)后長(zhǎng)出魚卵狀菌落。這種方法有時(shí)分離不夠充分，可用劃線法進(jìn)一步純化。（三）利用平皿的生化反應(yīng)進(jìn)行分離這是一種利用特殊的分離培養(yǎng)基對(duì)大量混雜微生物進(jìn)行初步分離的方法。分離培養(yǎng)基是根據(jù)目的微生物特殊的生理特性或利用某些代謝產(chǎn)物生化反應(yīng)來設(shè)計(jì)的。通過觀察微生物在選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀況或生化反應(yīng)進(jìn)行分離，可顯著提高菌株分離純化的效率。1.透明圈法在 平板培養(yǎng)基中加入溶解性較差的底物，使培養(yǎng)基混濁。能分解底物的微生物便會(huì)在菌落周圍產(chǎn)生透明圈，圈的大小初步反應(yīng)該菌株利用底物的能力。該法在分離水解 酶產(chǎn)生菌時(shí)采用較多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶產(chǎn)生菌都會(huì)在含有

29、底物的選擇性培養(yǎng)基平板上形成肉眼可見的透明圈。在分離淀粉酶產(chǎn)生菌時(shí)，培養(yǎng)基以 淀粉為惟一碳源，待樣品涂布到平板上，經(jīng)過培養(yǎng)形成單個(gè)菌落后，再用碘液浸涂，根據(jù)菌落周圍是否出現(xiàn)透明的水解圈來區(qū)別產(chǎn)酶菌株。如要分離該酸水解酶產(chǎn)生 菌，可用雙層平板法，首先在普通平板培養(yǎng)基上把懸浮液涂抹培養(yǎng)，等長(zhǎng)出菌落后覆蓋一層營(yíng)養(yǎng)瓊脂，內(nèi)含3%酵母RNA，0.7%瓊脂及0.1mol/LEDTA，pH7.0，于42左右培養(yǎng)24h,四周產(chǎn)生透明圈的菌落，即為核酸分解酶產(chǎn)生菌。在 分離某種產(chǎn)生有機(jī)酸的菌株時(shí)，也通常采用透明圈法進(jìn)行初篩。在選擇性培養(yǎng)基中加入碳酸鈣，使平板成混狀，將樣品懸浮液涂抹到平板上進(jìn)行培養(yǎng)，由于產(chǎn)生菌能

30、 夠把菌落周圍的碳酸鈣水解，形成清晰的透明圈，可以輕易地鑒別出來。分離乳酸產(chǎn)生菌時(shí)，由于乳酸是一種較強(qiáng)的有機(jī)酸，因此，在培養(yǎng)基中加入的碳酸鈣不僅有 鑒別作用，還有酸中和作用。2.變色圈法對(duì)于一些不易產(chǎn)生透明圈產(chǎn)物的產(chǎn)生菌，可在底物平板中加入指示劑或顯色劑，使所需微生物能被快速 鑒別出來。如篩選果膠酶產(chǎn)生菌時(shí)，用含0.2%果膠為惟一碳源的培養(yǎng)基平板，對(duì)含微生物樣品進(jìn)行分離，待菌落長(zhǎng)成后，加入0.2%剛果紅溶液染色4h，具 有分解果膠能力的菌落周圍便會(huì)出現(xiàn)絳紅色水解圈。在分離谷氨酸產(chǎn)生菌時(shí)，可在培養(yǎng)基中加入溴百里酚藍(lán)，它是一種酸堿指示劑，變色范圍在 pH6.27.6，當(dāng)pH在6.2以下時(shí)為黃色，p

31、H7.6以上為藍(lán)色。若平板上出現(xiàn)產(chǎn)酸菌，其菌落周圍會(huì)變成黃色，可以從這些產(chǎn)酸菌中篩選谷氨酸產(chǎn)生 菌。在進(jìn)行解脂微生物的分離時(shí)，雖然有很多精確的測(cè)定方法，如酸堿滴定法、電位滴定法、濁度滴定法、甘油滴定法及色譜分析法等，但由于步驟繁瑣， 不適于大規(guī)模篩選測(cè)定。為提高分離篩選效率，多采用固體平板的變色圈法，如以吐溫為底物，尼羅藍(lán)（Nile blue）作為指示劑，根據(jù)變色圈大小來判斷脂肪酶活性的高低；也可用甘油三丁酸酯為底物，羅丹明B為指示劑，以熒光圈的大小來測(cè)定。最常使用的方法是把 惡秦染料中的維多利亞藍(lán)和脂類底物混合，制成維多利亞藍(lán)乳脂瓊脂培養(yǎng)基平板，起始培養(yǎng)基調(diào)為中性，當(dāng)土壤樣品的懸濁液分離在平

32、板上，具有脂解能力的 菌落產(chǎn)生的脂肪酶水解油脂底物，使pH值由中性下降到微酸性或酸性，陽性解脂反應(yīng)能顯示粉紅到藍(lán)色的變化。如培養(yǎng)基起始pH為堿性，則陽性解脂反應(yīng)從咖啡 色到藍(lán)綠色，能使脂類底物和解脂后的脂肪酸區(qū)別開來。后來又由Fryer等研究出一種改良的雙層法，先在平皿內(nèi)倒一層營(yíng)養(yǎng)瓊脂，把一張棉紙圓片在被維多利 亞藍(lán)染了色的乳脂中浸濕，鋪在已凝固的瓊脂表面，然后覆蓋一薄層含樣品的營(yíng)養(yǎng)瓊脂，保溫培養(yǎng)，解脂菌落就可以在棉紙中產(chǎn)生藍(lán)帶。分解解脂細(xì)菌的培養(yǎng)基（）為：牛肉膏0.5、蛋白胨0.5、瓊脂2.0、大豆油5.0、維多利亞藍(lán)4mg。分 離內(nèi)肽酶產(chǎn)生菌，除了用酪蛋白作底物平板產(chǎn)生透明圈進(jìn)行鑒別外，還

33、可以用吲羥乙酸酯為底物加到分離培養(yǎng)基中，產(chǎn)生蛋白酶的菌落由于水解吲羥乙酸酯為3-羥 基吲哚，后者能氧化生成藍(lán)色產(chǎn)物，根據(jù)呈色圈便可選出平板上產(chǎn)蛋白酶的菌落。培養(yǎng)基平板由兩層組成，底層含明膠1.2，酵母汁0.1，蛋白胨0.4，瓊脂1.5，待凝固后在其上覆蓋一層瓊脂，瓊脂含量為0.7，由pH7.6的0.5mol/L的磷酸氫鉀緩沖液配制，配制濃度為0.083mol/L的吲羥乙酸酯溶液，取其中的0.3ml加入到上層瓊脂中倒平板。通過平板上的變色圈還可以快速分離篩選產(chǎn)乙醇的菌株。在以糖為碳源的瓊脂平板的菌落上，覆蓋一層含有鹽類的瓊脂，該藍(lán)色物質(zhì)在醇脫氫酶和NAD作用下（在少量乙醇存在時(shí)）反應(yīng)產(chǎn)生的電子脫

34、色。因此生成乙醇的菌落便顯出一個(gè)淡白色的圈，暈圈的大小可初步表示乙醇的產(chǎn)量。3.生長(zhǎng)圈法生 長(zhǎng)圈法通常用于分離篩選氨基酸、核苷酸和維生素的產(chǎn)生菌。工具菌是一些相對(duì)應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。將待檢菌涂布于含高濃度的工具菌并缺少所需營(yíng)養(yǎng)物的平板上 進(jìn)行培養(yǎng)，若某菌株能合成平板所需的營(yíng)養(yǎng)物，在該菌株的菌落周圍周圍便會(huì)形成一個(gè)混濁的生長(zhǎng)圈。如嘌呤營(yíng)養(yǎng)缺陷型大腸桿菌（如E.coliP264）與不 含嘌呤的瓊脂混合倒平板，在其上涂布含菌樣品保溫培養(yǎng)，周圍出現(xiàn)生長(zhǎng)圈的菌落即為嘌呤產(chǎn)生菌。   同樣，只要是篩選微生物所需營(yíng)養(yǎng)物的產(chǎn)生菌時(shí)，都可采用生長(zhǎng)圈法，工具菌用 相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，由于得到

35、所需營(yíng)養(yǎng)，凡是目的微生物周圍便會(huì)出現(xiàn)混濁的生長(zhǎng)圈。4.抑菌圈法常用于抗生素產(chǎn)生菌的 分離篩選。通常抗生素的篩選要投入極大的人力、財(cái)力和時(shí)間。據(jù)估計(jì)，篩選1萬個(gè)菌株才能得到1株有用的生產(chǎn)菌。因此設(shè)計(jì)一個(gè)準(zhǔn)確、迅速的篩選模型十分重要。抑菌圈法是常用的初篩方法，工具菌采用抗生素的敏感菌。若被檢菌能分泌某些抑制菌生長(zhǎng)的 物質(zhì)，如抗生素等，便會(huì)在該菌落周圍形成工具菌不能生長(zhǎng)的抑菌圈，很容易被鑒別出來。采用該方法已經(jīng)得到很多有用的抗生素，如春雷霉素和青霉素等。在 青霉素菌種選育中，還可利用加入青霉素酶來篩選青霉素高產(chǎn)菌株，做法如下：將產(chǎn)黃青霉孢子進(jìn)行誘變處理，致死率約為99。分離于瓊脂平板上，控制孢子濃

36、度，使長(zhǎng)成獨(dú)立菌落，一直培養(yǎng)到青霉素產(chǎn)量達(dá)到頂峰，加入0.106U/mol青霉素酶于鑒定菌枯草芽孢桿菌懸浮液中，鋪張于菌落平板表面，凝固后，培養(yǎng) 1720h。測(cè)量抑菌圈大小，根據(jù)有效指標(biāo)（抑菌圈直徑于菌落直徑之比）選出高產(chǎn)突變株。由于現(xiàn)有抗生素種類多樣，得到新的抗生素越來越困難。 人們除了從一些特殊的 地方如極端環(huán)境中采樣分離抗生素的 產(chǎn)生菌，也采用一些特殊的篩選方法，以期從普通土樣中分離篩選倒新的微生物及新的抗生素。除上述的抑菌圈外，稀釋法、擴(kuò)散法、生物自顯影法等也不同程度的 得到應(yīng)用。在這些方法中，檢驗(yàn)菌的選擇十分重要，直接關(guān)系到檢出的靈敏度和篩選到的抗生素的活性和抗菌譜。如在篩選抗細(xì)菌抗

37、生素時(shí)，傳統(tǒng)上常用金黃色葡萄 球菌和枯草芽孢桿菌作為檢驗(yàn)菌來檢驗(yàn)抗生素的抗性。采用聯(lián)合檢驗(yàn)菌，如枯草桿菌和綠色產(chǎn)色鏈霉菌活巴氏梭菌，可分離出抗菌活性低、對(duì)其他試驗(yàn)菌活性高的新 抗生素，如黃色霉素族的抗生素，而這些抗生素在單獨(dú)使用枯草桿菌時(shí)無法檢出。海洋是新抗生素的重要來源。許多海洋生物體內(nèi)都含有微生物，這些微生 物為宿主抵御病害起著關(guān)鍵作用。因此，從魚組織和蝦消化道里分離篩選抗癌藥物和抗炎癥藥物是一個(gè)有效地途徑。已從水母體內(nèi)篩到一種名為 salinamide的抗生素，一種抗真菌抗生素istatin也從海洋生物體中分離出。在篩選抗霉菌抗生素時(shí)，需根據(jù)其特點(diǎn)進(jìn)行篩選，因霉菌與 哺乳動(dòng)物細(xì)胞性質(zhì)相似

38、，為減少藥物對(duì)人體的副作用，需挑選對(duì)霉菌有抗性但對(duì)人體安全的抗生素。由于哺乳動(dòng)物不含幾丁質(zhì)，因此可先篩選抑制幾丁質(zhì)合成酶的生 理活性物質(zhì)，再?gòu)闹泻Y選所需抗生素。三國(guó)霉素和多氧菌素就是通過該方法篩選得到的。抗病毒抗生素及抗腫瘤藥物的篩選則可通過敏感細(xì)菌培養(yǎng)平板的噬菌斑來判 斷。采用抑菌圈法，不僅能篩選抗生素，而且還能篩選某些酶類。 四）組織分離法組織分離法是由一些有病組織或特殊組織中分離菌株的方法。如從患惡苗病的水稻組織中分離赤霉素，從根瘤中分離根瘤菌及從各種食用菌的子實(shí)體中分離孢子等。1.對(duì)一般有病組織的分離方法切 除小塊含菌組織，用干凈水洗去組織表面污物。以10漂白粉或0.1升汞浸泡25分鐘

39、進(jìn)行表面消毒，無菌水沖洗。將消毒后的組織移到平皿培養(yǎng)基上，置 于適宜溫度（2526）培養(yǎng)一定時(shí)間，即可在組織周圍四÷長(zhǎng)出微生物。用肉眼或顯微鏡觀察菌落，基本確認(rèn)后挑入斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)。由這種方法挑選的菌 株往往不純，必須在瓊脂平板上再分離純化，然后挑取單個(gè)菌落于斜面，進(jìn)一步篩選。從豆科植物的根瘤中分離根瘤菌：取新鮮健壯的根瘤，經(jīng)漂白粉或升汞溶液等進(jìn)行表面消毒后，用無菌鑷子將根瘤壓破，取出汁液少許與分離培養(yǎng)基混合倒入平皿中，攤平，培養(yǎng)后在平板上長(zhǎng)出菌落，經(jīng)鏡檢觀察后確認(rèn)典型菌落，移入斜面。2.食用菌孢子分離法食用菌的孢子分離法通常有兩種，即多孢子分離和單孢子分離。多孢子分離有混雜現(xiàn)象，

40、不易篩選到優(yōu)良穩(wěn)定的菌株。因此，從育種角度最好采用單孢子分離。兩種方法的分離步驟、方法介紹如下：（1）多孢子分離法取 產(chǎn)量高、朵大、健壯無病并即將成熟的初生和單生子實(shí)體，用清水洗凈表面污物，對(duì)子實(shí)體外有膜保護(hù)著的菇類，如蘑菇、草菇，在0.1%0.2%升汞溶液浸 泡23 min，用無菌水沖洗數(shù)次。對(duì)子實(shí)體無膜外露的平菇等，不適于用升汞溶液浸泡，要用75%的酒精進(jìn)行表面消毒，再用無菌水沖洗。食用菌的孢子著生在子實(shí)體 的腹面的菌褶上，成熟時(shí)會(huì)自動(dòng)彈出來。孢子采集裝置：用一條兩端彎成鉤的鐵絲，一端鉤著一塊成熟的蠶豆大子實(shí)體，另一端掛在三角瓶的瓶口上。三角瓶?jī)?nèi)事先 制備好馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基平板。懸掛的子實(shí)

41、體距離培養(yǎng)基平板23cm。適溫培養(yǎng)12天，就有孢子陸續(xù)彈落于三角瓶底部的培養(yǎng)基上，經(jīng)過45天，孢子 萌芽成菌絲，及時(shí)將菌絲尖端接入到斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后進(jìn)行生產(chǎn)性能對(duì)比試驗(yàn)。（2）單孢子分離法取一條鐵絲，彎曲成蚊香支架形狀，放 在已消毒的玻璃板上。將消毒后的子實(shí)體懸掛在支架上方，下方置一個(gè)已滅菌的去蓋的培養(yǎng)皿，然后罩一個(gè)鐘罩，周圍縫隙用凡士林封好。將這套孢子收集器移到恒 溫室內(nèi)培養(yǎng)12天，將有大量孢子彈到平皿上，收集孢子（圖6.2）。以上操作全部在超凈臺(tái)或無菌室內(nèi)進(jìn)行。將收集到的孢子用稀釋法在馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基 平板上進(jìn)行單孢子分離，培養(yǎng)后把單孢子長(zhǎng)出的菌落移接到斜面上，進(jìn)行生產(chǎn)性能比較試驗(yàn)。

42、（五）單細(xì)胞或單孢子分離法采用特殊的儀器設(shè)備進(jìn) 行單細(xì)胞或單孢子的分離。具體方法有多種，現(xiàn)主要介紹檸檬酸產(chǎn)生菌采用的小滴分離純化方法。操作如下：將待純化的孢子懸液稀釋約為1500ml-1，用校 正口徑的滴管（每毫升400滴）吸取孢子并均勻滴于無菌干燥蓋玻片上，將其小心翻轉(zhuǎn)于凹玻片的孔穴上，穴內(nèi)加一滴已滅菌的培養(yǎng)液，蓋玻片和載玻片用凡士林 密封。顯微鏡下觀察每個(gè)小滴，將只有一個(gè)孢子的小滴位置作好記錄，恒溫培養(yǎng)，挑取單菌落于斜面。除用凹玻片，還可用濾紙進(jìn)行單細(xì)胞或單孢子分離。 具體作法如下：取與皿內(nèi)徑大小一致的濾紙34層，浸在培養(yǎng)液中，取出放在空皿內(nèi)，在濾紙上滴幾滴甘油以防干燥，蓋好皿蓋，滅菌。將

43、稀釋為1500ml- 1的孢子懸液用上述滴管滴在濾紙上，每皿約點(diǎn)20點(diǎn)滴左右，經(jīng)恒溫培養(yǎng)，每滴約出現(xiàn)10個(gè)菌落，將單菌落移接于斜面上。該方法能夠得到單細(xì)胞或單孢子，較 為精確，但操作時(shí)要細(xì)，否則不易得到理想結(jié)果。（六）特殊菌類環(huán)保降解菌的分離自然界存在著大量廢物及污染物，如多環(huán)芳烴 （PAHs）、有機(jī)染料和顏料、表面活性劑、農(nóng)藥、酚類和鹵代烴等。在分離篩選這類物質(zhì)的降解微生物由于該物質(zhì)為唯一碳源或氮源的培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)。不 能利用該物質(zhì)的微生物由于得不到營(yíng)養(yǎng)被淘汰，能分解該物質(zhì) 的微生物則正常生長(zhǎng)。經(jīng)過幾個(gè)月的連續(xù)培養(yǎng)后，將富集培養(yǎng)液劃線或涂布于分離平板上，便能篩選到所需的環(huán)保降解菌株。分離

44、平板可采用該污染物為底物的鑒別 培養(yǎng)基，通過水解圈變色圈進(jìn)一步提高篩選效率。采用該方法分離苯胺、DDT、甲基對(duì)硫磷（MP）石油、甲胺磷等污染物都取得了良好的效果。如王倩 如等人從經(jīng)甲胺磷農(nóng)藥廢水長(zhǎng)期馴化的活性污泥中，篩選到能高效降解甲胺磷農(nóng)藥的蠟狀芽孢桿菌（Bacillus crerus）和嗜中溫假單孢菌（Pseudomonas mesophilica），兩株混合菌對(duì)有機(jī)磷的去除率達(dá)99.7%。在篩選環(huán)保降解 菌時(shí)需注意，某些有毒污染物由于本身對(duì)微生物的生長(zhǎng)有抑制作用，如果直接在培養(yǎng)基中加入該物質(zhì)連續(xù)富集培養(yǎng)，可能效果不佳。這時(shí)就需根據(jù)不同的情況設(shè)計(jì)更 合理的篩選模型。如Harris在分離以氯

45、化物為氮源的細(xì)菌時(shí)，把浸透了KCN溶液的濾紙放到平皿蓋上，濾紙所產(chǎn)生的HCN蒸氣逐漸滲入含無機(jī)鹽的分離培 養(yǎng)基，每天用新制備的浸濕KCN的濾紙更換，培養(yǎng)一段時(shí)間后，從平皿上長(zhǎng)出的菌落中進(jìn)行分離，便容易得到分解氰化物的菌株。由于塑料工業(yè)的發(fā)展， 環(huán)境中到處都有各種高分子包裝廢棄物，這些污染物多為不溶于水的高分子化合物，獲得其降解菌株較為困難。通常采用富集法進(jìn)行篩選，如日本的小野勝道教授以 低濃度聚乙烯作為富集培養(yǎng)基對(duì)土壤微生物進(jìn)行馴化，分離到了三種能降解聚乙烯的細(xì)菌。在淀粉塑料的降解試驗(yàn)中，采用加富土壤淹埋法，篩選到的降解微生物主 要是霉菌與放線菌。這可能是因?yàn)榻z狀體更容易深入共混物內(nèi)部生長(zhǎng)。尤

46、其是膜料中的聚乙烯和淀粉分布并非均勻，由于聚乙烯的流動(dòng)性好，因而在吹塑過程中膜表 面的聚乙烯含量偏高，使細(xì)菌在初期很難降解這類共混物，所以在降解菌的研究方面應(yīng)著重考慮霉菌與放線菌。除馴化培養(yǎng)進(jìn)行降解菌的篩選外，還可采用階段式篩 選法。如在分離聚乙二醇降解菌時(shí)，可先篩選能分解乙二醇、丙二醇或聚乙二醇結(jié)構(gòu)相似的含兩個(gè)醚鍵的三甘醇的微生物，再?gòu)闹泻Y選能降解聚乙二醇的菌株，也能 達(dá)到較好的效果。除尋找能夠降解廢舊塑料的微生物外，根治白色污染的最好方法是用降解塑料替代現(xiàn)有塑料。目前降解塑料有光降解、光-生物降解、纖 維素類生物降解塑料等。有些生物降解塑料是以簡(jiǎn)單的物理共混工藝，將淀粉填充到聚乙烯等樹脂內(nèi)

47、，淀粉可以被微生物分解，但樹脂分子骨架在很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)仍分解 不了，反而為廢棄塑料的回收增加了困難。而一些聚脂類高分子由于具有和微生物本身可合成的聚-羥基丁酯（PHB）相類似的結(jié)構(gòu)，無毒，且能在酸、堿和微 生物條件下完全降解，同時(shí)具有良好的塑性，用途寬廣的多。用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的聚-羥基脂肪酸（polyhydroxyalkanoic acid,PHAs）也成為研究生物降解塑料的熱點(diǎn)，其中利用真氧產(chǎn)堿桿菌（Alcaligtnes eutrophus）合成PHB的研究最多。另外，還有固氮菌（Azotobacter）、假單胞菌（Pseudomonas）、生絲微菌 （Hyphomicrobium X）、菌

48、宿根瘤菌（Rhizobium meliloti）、嗜鹽桿菌（Halobacteria）等。目前人們已經(jīng)克隆到PHAs 合成途徑的關(guān)鍵酶基因，包括：phbA(酮硫裂解酶基因)、phbB(依賴NADPH的乙酰CoA還原基因)、phbC（PHB合成酶基因）。許多實(shí)驗(yàn) 室已在進(jìn)行酶基因?qū)隕.coli的工作，期望利用E.coli大批量合成PHB。總之，利用廉價(jià)碳源的高產(chǎn)菌株的發(fā)現(xiàn)與選育是降解塑料領(lǐng)域中最有意義的 研究之一。生物谷網(wǎng)站 二、通過控制培養(yǎng)和培養(yǎng)條件進(jìn)行分離各種微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求和培養(yǎng)條件是不同的，在分離篩選時(shí)若在這兩個(gè)方面加以調(diào)節(jié)控制，就能獲得更好的分離效果。1.培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分各種微生物對(duì)

49、碳源、氮源要求各異，有的對(duì)營(yíng)養(yǎng)還有特殊的要求，事先了解被分離微生物的營(yíng)養(yǎng)要求，從而設(shè)計(jì)一個(gè)合理快速的分離培養(yǎng)基，能夠收到事半功倍的效果。放 線菌是生產(chǎn)抗生素和酶制劑的重要來源。在選擇分離放線菌時(shí)，通常采用改良的HV瓊脂培養(yǎng)基、土豆-胡蘿卜水汁液培養(yǎng)基和淀粉瓊脂培養(yǎng)基能取得較好的效果。 但不同菌種對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求差別很大，如奴卡氏菌在有氧條件下用普通培養(yǎng)基即可分離到，而以色列放線菌則在有CO2存在且有適宜培養(yǎng)基的情況下才能正常生長(zhǎng)繁 殖。篩選水解酶產(chǎn)生菌時(shí)，通常利用以底物為惟一碳、氮源的平板進(jìn)行分離，如以淀粉為碳源的培養(yǎng)基可鑒定菌落能否產(chǎn)生淀粉酶；一種含纖維素粉為碳源 的分離培養(yǎng)基，可以鑒別纖維素酶產(chǎn)

50、生菌；用含有酪蛋白為有機(jī)氮源的平板培養(yǎng)基，可以鑒別蛋白酶的產(chǎn)生菌。純種分離時(shí)，把以上瓊脂平板置于適宜的溫度培養(yǎng)一 定的時(shí)間，如具有產(chǎn)生水解酶能力的菌株，便在菌落四周形成水解圈或呈色圈，根據(jù)圈的大小可初步判斷酶活力強(qiáng)弱。測(cè)定水解圈直徑與菌落直徑之比，把比例大的 菌落移入斜面保藏，供進(jìn)一步篩選。2.培養(yǎng)基的pH細(xì)菌、放線菌的生長(zhǎng)繁殖對(duì)pH一般要求偏堿，霉菌和酵母菌 要求偏酸。因此，分離培養(yǎng)基的pH應(yīng)該調(diào)節(jié)到被分離微生物要求范圍。這不僅有利于自身生長(zhǎng)，也可排除一部分不需要的菌類。例如，分離檸檬酸產(chǎn)生菌的黑曲 霉，就是利用調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的酸堿度獲得成功的。其分離方法是：取紅芋粉醪20%、檸檬酸10%20%

51、配成培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)pH2.02.5，以一定量的培養(yǎng) 基和土樣均勻混合，用毛細(xì)吸管點(diǎn)種在平皿內(nèi)事先覆蓋的無菌濾紙上（23層），于30培養(yǎng)，這樣可以分離到產(chǎn)生檸檬酸的黑曲霉。分離堿性蛋白酶和堿性脂肪酶產(chǎn)生菌時(shí)，可以把培養(yǎng)基調(diào)到pH911，在此范圍內(nèi)不宜生長(zhǎng)的微生物被抑制，這對(duì)分離本身起到濃縮作用。大多數(shù)水解酶的生長(zhǎng)最適pH基本相近，而酶的作用pH未必與產(chǎn)酶pH相同。培 養(yǎng)基的pH要結(jié)合營(yíng)養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件來考慮。因?yàn)槲⑸镌谏L(zhǎng)繁殖過程中，由于代謝作用會(huì)產(chǎn)生酸性或堿性產(chǎn)物，pH發(fā)生變化，微生物生長(zhǎng)受到抑制。一般培 養(yǎng)基中碳氮比（C/N）高者，培養(yǎng)后傾向于酸性，反之則傾向于堿性。無機(jī)鹽的性質(zhì)也會(huì)影響pH變化，（NH4）2SO4是生理酸性無機(jī)氮源，其中NH4+ 被菌體利用，留下SO42，培養(yǎng)液變成酸性。而NaNO3是生理堿性氮源，其中NO3被菌體分解利用后，剩余Na+，使培養(yǎng)液變成堿性。如發(fā)酵過程缺 氧，則代謝向有機(jī)酸合成方向進(jìn)行，pH下降。為了維持培養(yǎng)基的ph，一般要加磷酸鹽，如K2HPO4、KH2PO4，使培養(yǎng)基具有一定的緩沖能力。如果培 養(yǎng)液中的酸堿變化很大，磷酸鹽的緩沖容量不足以調(diào)節(jié)pH變化，則可適當(dāng)加入碳酸鈣，以不斷中和菌體代謝