1、Oct. 200836現(xiàn)代化工M odern Chemical Industry 第28卷增刊(2 2008年10月制備生物柴油用小球藻的油脂富集培養(yǎng)研究齊沛沛, 王飛(南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院, 江蘇南京210037摘要:研究了培養(yǎng)溫度、光照強(qiáng)度、氮源及其氮含量對(duì)小球藻Chlorella spp 的生長、油脂含量及脂肪酸的影響, 以期獲得最為適宜的富含油脂微藻的培養(yǎng)條件。采用比生長速率評(píng)價(jià)微藻的生長狀況, 以溶劑浸提法提取微藻中的油脂, 并采用氣質(zhì)聯(lián)用和氣相色譜分析微藻的脂肪酸組成。研究結(jié)果表明, 既能使微藻Chlorella spp 良好生長又可提高其油脂含量的培養(yǎng)條件為:溫度25、光照強(qiáng)

2、度3500lux 、添加氮源硝酸鈉并使其含氮質(zhì)量濃度為0125g/L , 此時(shí)的油脂含量可達(dá)4317%。微藻脂肪酸的組成以C160、C180、C182為主, 表明小球藻的主要脂肪酸組成為C16和C18脂肪酸。關(guān)鍵詞:Chlorella spp ; 微藻油脂; 脂肪酸組成中圖分類號(hào):Q945;Q949193文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A:0253-( -04Study on oil spp for biodiesel production2pei , WANG Fei(Engineering , Nanjing F orestry University , Nanjing 210037, China Abstr

3、act :The factors that affecting the growth ,lipid content and the fatty acid composition of microalgae Chlorella spp , are investigated in this paper to determine the optimum culture condition. These factors include culture temperature , light intensity and nitrogen s ources. G rowth rate is used to

4、 evaluate the growth of Chlorella spp ,microalgae oil is extracted by s olvent extraction method ,and the fatty acid composition is analyzed by G C 2MS and G C. The results show that the optimum culture conditions of Chlorella spp are :temperatureof 25,light intensity of 3500lux ,and NaNO 3as nitrog

5、en s ource and N content of 0125g/L. Under the optimum conditions ,the lipid content of microalgae is up to 4317%.The major components of fatty acids in Chlorella spp are C16and C18fatty acids.K ey w ords :Chlorella spp ; microalgae oil ; fatty acid composition生物柴油生產(chǎn)的最大瓶頸是原料問題, 因此尋找新的資源, 開發(fā)潛在的生物柴油生產(chǎn)

6、新原料成為生物柴油產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要途徑。微藻尤其是海洋微藻, 不僅資源豐富, 而且細(xì)胞內(nèi)一般富含油脂, 是一種具有較好應(yīng)用前景的生物柴油生產(chǎn)潛在新原料。利用微藻加工制備生物柴油的關(guān)鍵是如何通過優(yōu)化培養(yǎng)盡可能提高微藻細(xì)胞的油脂含量。在單細(xì)胞微藻的培養(yǎng)過程中, 培養(yǎng)基成分、溫度、光照強(qiáng)度、pH 、培養(yǎng)方式、通氣量、鹽度等均會(huì)影響微藻的生長以及其脂肪酸的含量與組成。溫度、光強(qiáng)能影響微藻的光合作用和呼吸作用, 從而對(duì)其生長及體內(nèi)生化成分產(chǎn)生影響1-4, 在極端高溫或低溫條件下, 微藻合成油脂的量都會(huì)減少5-6, 可能是相關(guān)的酶發(fā)生不可逆損傷所致, 文獻(xiàn)7-10報(bào)道證實(shí)了這一點(diǎn); 培養(yǎng)基中氮源對(duì)微藻的生長

7、及脂肪酸的影響也收稿日期:2008-10-10極為顯著, 單胞藻對(duì)不同氮源的吸收速度與利用程度是有差別的11-12, 可能是酶功能的差異造成了各種微藻利用氮能力的差異, 結(jié)果也支持了藻類對(duì)氮鹽喜好和利用能力存在差異的觀點(diǎn) 13-18。為了探討用于生物柴油生產(chǎn)的微藻油脂富集培養(yǎng), 本文對(duì)小球藻Chlorella spp 在不同培養(yǎng)溫度、光照強(qiáng)度、氮源及氮含量條件下的生長狀況和其油脂含量及脂肪酸組成進(jìn)行了研究, 以得到富含油脂的微藻藻株及其培養(yǎng)條件。1實(shí)驗(yàn)部分111實(shí)驗(yàn)用菌種小球藻Chlor ella spp 購自中國科學(xué)院海洋研究所。112微藻的培養(yǎng)與采收接種前, 為防止藻種污染, 培養(yǎng)用的工具

8、與器皿基金項(xiàng)目:國家“948”重大引進(jìn)創(chuàng)新項(xiàng)目(2006-4-C05 ; 南京林業(yè)大學(xué)科研創(chuàng)新基金項(xiàng)目作者簡介:齊沛沛(1983- , 女, 碩士生; 王飛(1962- , 男, 博士, 教授, 博士生導(dǎo)師, 主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)、生物質(zhì)能源與化學(xué)品研究, 通訊聯(lián)系人hgw f . cn 。2008年10月齊沛沛等:制備生物柴油用小球藻的油脂富集培養(yǎng)研究37都經(jīng)過嚴(yán)格的滅菌。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的微藻于Allegra X-22R 離心機(jī)中離心, 棄去上清液后, 在濃縮藻液中加入少量新鮮培養(yǎng)基, 混勻后量取一定量的藻液轉(zhuǎn)接至新鮮配置的培養(yǎng)基, 培養(yǎng)基采用

9、BG 11培養(yǎng)基, 并通過測定其吸光值來調(diào)控其初始接種密度。將新鮮藻液置于光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng), 每天振搖34次, 光暗周期為12h 12h , 培養(yǎng)溫度有20、25、30、354個(gè)水平, 光照強(qiáng)度分2500、3500、4500lux 3個(gè)水平, 并分別添加氮源NaNO 3或NH 2C ONH 2, 使培養(yǎng)基的氮質(zhì)量濃度分別為010625、01125、01250、01375g/L , 以探討不同培養(yǎng)溫度、光照250, 離子源溫度為250, 載氣為氦氣, 流速018m L/min , 分流比為1/10, 進(jìn)樣量1L 。(2 氣相色譜定量分析采用氫氧化鉀-甲醇法進(jìn)行油脂甲酯化后, 利用氣相色譜法定

10、量分析脂肪酸組成百分含量。氣相色譜儀為SHI M ADZ U G C-14B , 采用色譜柱為DB -5毛細(xì)管柱(30m ×0132mm , 0125m , 程序升溫:150恒溫1min , 以3/min 升溫速率升至250并保留2min 。進(jìn)樣口溫度為250, 氫火焰離子檢測器(FI D , 載氣為高純氮, 氮?dú)鈮毫?kg/cm 2; 氫氣流量50m L/min , 空氣流量50m L/min , 分流比為1/10, 進(jìn)樣量1L 。強(qiáng)度及氮源添加量對(duì)微藻生長、油脂含量及脂肪酸組成的影響。采用離心法采收微藻,3500r/min 5min , 30h , 取出后保存于4113211微藻

11、脂肪酸組成的確定氣相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)用于確定微藻脂肪酸組成, 將微藻進(jìn)行油脂提取后的樣品, 采用氫氧化鉀-甲醇室溫甲酯化法進(jìn)行油脂甲酯化, 所得樣品進(jìn)行氣質(zhì)聯(lián)用分析, 結(jié)果如圖1所示, 各個(gè)色譜峰的保留時(shí)間與其所對(duì)應(yīng)的脂肪酸種類如表1所示。采用紫外可見分光光度儀測定微藻溶液在540nm 處的吸光值(OD 540 。比生長速率可用來評(píng)價(jià)微藻在一定時(shí)期內(nèi)的總體生長情況。該指標(biāo)的計(jì)算以濁度法測定的吸光值為基礎(chǔ), 如公式:=(ln N T -ln N 0 /T其中為比生長速率, N 0為接種時(shí)藻液在540nm 處的吸光值, N T 為培養(yǎng)T 天后藻液在540nm 處的吸光值。在該研究中, 平均生長速率以

12、微藻在8天內(nèi)的平均比生長速率計(jì), 即T =8。114油脂的提取采用溶劑浸提法, 提取溶劑為石油醚、乙醚混合溶液(體積比為21 ,40條件下浸提5h 。將充分研磨的干燥粉加入提取溶劑, 期間適當(dāng)振蕩混勻, 待提取結(jié)束后, 加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的氫氧化鉀溶液沉淀微藻細(xì)胞, 搖勻靜止一段時(shí)間后, 將混合溶液在6000r/min 轉(zhuǎn)速下離心10min , 收集上清液于已恒重的離心管中, 于60水浴中迅速蒸去多余的溶劑, 稱量, 計(jì)算油脂含量。115脂肪酸組成分析(1 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用定性分析圖1微藻甲酯化產(chǎn)品, 脂肪酸甲酯的氣質(zhì)聯(lián)用氣相色譜圖從圖1可以看出, 微藻的脂肪酸組成很復(fù)雜, 但主要的脂肪酸組

13、成有10種, 由表1可知, 主要的飽(和脂肪酸有C140,C160,C180“”前的數(shù)字是脂肪酸的碳數(shù), 之后的數(shù)字為含的碳碳雙鍵數(shù), 下同 , 其中還有極其微量的C150,C170; 不飽和脂肪酸主要為C161,C162,C163,C181,C182,C183,C205。據(jù)研究報(bào)道(W ood 1988, Dunstan 1992, Zhukova &Aizdaicher 1995 , 綠藻綱微藻常含有表1氣相色譜中主要脂肪酸所對(duì)應(yīng)的相對(duì)保留時(shí)間脂肪酸種類相對(duì)保留時(shí)間/min 脂肪酸種類相對(duì)保留時(shí)間/minC1408134C18 018188C16013136C18118109C16

14、112175C18217188C1621214C18318104C16312153C20522145微藻樣品經(jīng)提取油脂后, 采用氫氧化鉀-甲醇室溫甲酯化法進(jìn)行油脂甲酯化, 所得脂肪酸甲酯進(jìn)行氣-質(zhì)聯(lián)用分析, 以確定微藻中主要脂肪酸組成。采用Finnigan G C-MS Trace DC Q 進(jìn)行分析, 色譜柱為DB -5(0125mm ×30m ×0125m , 程序升溫:150恒溫1min , 以3/min 升溫速率升至250并保留2min 。進(jìn)樣口溫度為250, 氣化室溫度為38現(xiàn)代化工第28卷增刊(2由表2可知, 藻株Chlorella spp 的油脂含量受溫高濃度

15、的C16和C18脂肪酸, 而C20和C22不飽和脂肪酸則缺乏, 本研究的結(jié)果與之相一致。212溫度和光照強(qiáng)度對(duì)微藻生長、油脂含量與脂肪酸組成的影響溫度和光照強(qiáng)度是影響微藻生長的極為重要的環(huán)境因子, 不同的培養(yǎng)溫度和光照強(qiáng)度下所得到的微藻平均生長速率、油脂含量和其脂肪酸組成如圖2和表2所示。度的影響是極其顯著的。相同光照強(qiáng)度下, 在2035的范圍內(nèi), 都呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢, 在25時(shí)微藻的油脂含量最高。早期研究報(bào)道6,19,在極端高溫或低溫的情況下, 微藻油脂的合成量會(huì)減少, 研究指出極端溫度下合成受限可能是相關(guān)的酶發(fā)生不可逆損傷所致。在微藻油脂含量最高的培養(yǎng)溫度25下, 藻株Chlore

16、lla spp 亦隨光照強(qiáng)度的變化而改變, 當(dāng)光照強(qiáng)度為3500lux 時(shí), 其油脂含量達(dá)到了最大值, 在2500lux 處的油脂含量也略大于其在4500lux 處的油脂含量spp 的脂肪酸00, 即以飽和脂肪酸為主。, 主要脂肪酸的種類不變, 而含量會(huì)圖2Chlorella 有所增減。隨著溫度的升高, 飽和脂肪酸的百分含量略有減小, 而不飽和脂肪酸C162、C182、C183所占的比例則略有增加。隨著光照強(qiáng)度的增加, 飽和脂肪酸C160和C180的含量均有明顯的增加, 而不飽和脂肪酸C182、C161、C162、 C163、C205等的比例都有減小, 這與李荷芳等的報(bào)道相一致20。213氮源

17、及其含量對(duì)微藻生長、油脂含量與脂肪酸小球藻Chlorella spp 在培養(yǎng)溫度為25時(shí), 達(dá)到了最大的平均生長速率。由圖2可知, 小球藻在2035均能夠正常生長, 在同一光照強(qiáng)度下, 小球藻的平均生長速率隨著溫度的升高而先增加后降低, 在25得到了最大的平均生長速率, 即為其生長的適宜溫度。在培養(yǎng)溫度為25時(shí), 小球藻Chlorella spp 的平均生長速率均隨光照強(qiáng)度的增加而增大, 適宜的微藻Chlorella spp 生長的光照強(qiáng)度為35004500lux 。表2溫度和光照強(qiáng)度對(duì)微藻Chlorella spp 油脂含量和脂肪酸組成的影響2500lux3500lux4500lux組成的影

18、響氮元素是單細(xì)胞微藻生長發(fā)育必需的元素之一, 微藻通常可以利用銨鹽、硝酸鹽及尿素等作為其氮源。單胞藻雖對(duì)這些鹽類都能吸收與利用, 但在吸收的速度與利用的程度上是有差別的11-12。在該研究中, 首先選取NaNO 3和NH 2C ONH 2作為氮源來考察其對(duì)小球藻Chlorella spp 生長和油脂含量、脂肪酸組成的影響, 結(jié)果如圖3和表3所示。202530352025303520253035C140318811210212310019217417注:表中“”表示脂肪酸含量極微或未檢測出, 下表同。圖3氮源及其氮含量對(duì)小球藻Chlorella spp生長的影響2008年10月齊沛沛等:制備生物

19、柴油用小球藻的油脂富集培養(yǎng)研究39由圖3可以看出, 添加氮源的小球藻Chlorella spp 的平均生長速率均大于不添加氮源的藻液。以NaNO 3為氮源時(shí), 小球藻Chlorella spp 的平均生長速率隨著氮含量的增加而減小, 而在含氮質(zhì)量濃度為010625g/L 與01125g/L 時(shí), 微藻的平均生長速率基本相當(dāng); 以NH 2C ONH 2為氮源時(shí), 小球藻Chlorellaspp 的平均生長速率隨著氮含量的增加而先增大后脂肪酸為C160和C180, 即以飽和脂肪酸為主, 而不飽和脂肪酸以C161、C182為主; 而以尿素為氮源時(shí), 其主要脂肪酸亦為C160和C180, 但其C180

20、的比例有所下降, 而不飽和脂肪酸中C181所占的比例有所增加。而在所有考察的條件中, C205所占的比例均很小, 但隨著添加氮量的增加而會(huì)略有增加。減小, 在氮質(zhì)量濃度為01125g/L 時(shí)達(dá)到最大值。在同一氮含量的條件下, 小球藻Chlorella spp 在以NH 2C ONH 2為氮源時(shí)的生長速率更大, 這也說明NH 2C ONH 2是更為適宜的氮源, 其最適宜的氮質(zhì)量3結(jié)論(1 將微藻生長的最適條件與富集油脂的最佳濃度為01125g/L 。表3氮源及其氮含量對(duì)小球藻Chlorella spp 的油脂含量及脂肪酸組成的影響L -1脂肪酸無添加硝酸鈉尿素氮源01062501125油脂含量/

21、%C140C160C161C162C163C180C181C182C183C2055144510421034101254317條件綜合考慮, Chlorella spp 適宜的培養(yǎng)條件為:溫度25、光照強(qiáng)度3lux L 1的研究發(fā)現(xiàn), 培養(yǎng)條件對(duì)脂肪酸主要組成成分的種類沒有明顯影響, 但是各個(gè)主要組分的百分含量會(huì)隨培養(yǎng)條件的改變而有相應(yīng)的改變。Chlorella spp 的主要脂肪酸為C160、C180、C182, 表明小球藻的主要脂肪酸組成為C16和C18脂肪酸。參考文獻(xiàn)1Renaud S M ,Zhou H C ,Parry D L , et al . E ffect of tem per

22、ature on thegrowth ,to tallipid content and fatty acid com position of recently is olated tropical microalgae 7:595-602.2Zhu C J ,Lee Y K,Chao T M , et al. Diurnal changes in gross chemicalcom position and fatty acid profiles of Isochrysis galbana in outdoor closed tubular photobioreactors J.J M ar

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25、 on fat accumulation in Nitzschia palea J.Ann Bot ,1974,38:889-892.7M ortens on S H ,Borsheim K Y,Rainuzz o J K. Fatty acid and elementalcom position of the marine diatom Chaetoceros gracilis Schutt. E ffects of silicate deprivation ,tem perature and light intensity J.Exp M ar. Biol Ecol ,1988,122:1

26、73-185.Isochrysis sp. , Nitzschiaclosterium , Nitzschia 2paleacea ,and commercial species Isochrysis sp J.Appl Phycol ,1995,813019013211117117616由表3可知, 在不添加氮源的情況下, 微藻的油脂含量均最大, 且達(dá)到了45%, 在曹春暉等21關(guān)于小球藻的油脂含量研究中小球藻的油脂含量一般為8%27%, 而該研究出現(xiàn)的高脂肪含量可能正是由于低氮培養(yǎng)條件造成的脂肪積累現(xiàn)象。微藻Chlorella spp 以硝酸鈉為氮源的油脂含量均高于以尿素為氮源的油脂含量,

27、 其中當(dāng)硝酸鈉的添加質(zhì)量濃度為0125g/L 時(shí), 微藻的油脂含量最高; 而添加尿素為氮源的4個(gè)水平中, 以添加量為01125g/L 時(shí)的油脂含量最高。故與其適宜的生長條件相結(jié)合, 選擇添加硝酸鈉, 氮質(zhì)量濃度為0125g/L 。同時(shí), 由表3可知, 藻株Chlorella spp 的主要脂肪酸組成為C160、C182、C180、C161。當(dāng)不添加氮源時(shí), 其主要脂肪酸為C160和C182, 兩者所占總脂肪酸的70%以上; 以硝酸鈉為氮源時(shí), 其主要(下轉(zhuǎn)第41頁2008年10月劉錦超等: 紅薯淀粉漿在水解過程中的黏度41體, 其分子量在5萬20萬之間, 相當(dāng)于2001200個(gè)葡萄糖分子聚合而

28、成。支鏈淀粉是以-1,4糖苷鍵連接為主, 同時(shí)還有2%4%通過-1, 6糖苷鍵連接而成的D -葡萄糖的聚合體, 其中-1, 4糖苷鍵連成的鏈作主鏈, 在主鏈上通過-1,6糖苷鍵形成眾多的側(cè)鏈。支鏈淀粉的分子量在20萬60萬之間, 相當(dāng)于130036000個(gè)葡萄糖聚合而成。直鏈淀粉分子和支鏈淀粉分子的側(cè)鏈趨向平行排列, 相鄰羥基間經(jīng)氫鍵結(jié)合成散射狀結(jié)晶性“束”(micelles 的結(jié)構(gòu), 稱為雙螺旋結(jié)構(gòu)。顆粒中水分子也參與氫鍵結(jié)合, 淀粉分子間有的是由水分子氫鍵結(jié)合, 水分子介于中間, 有如架橋。氫鍵的強(qiáng)度雖然不高, 但數(shù)量眾多, 結(jié)晶束具有一定強(qiáng)度, 故淀粉具有較強(qiáng)的顆粒結(jié)構(gòu)。結(jié)晶束間區(qū)域分子

29、排列沒有平行規(guī)律, 較雜亂, 為無定形區(qū), , 骨架作用。淀粉顆晶顆粒體積的25%50%, 其余為無定形區(qū)。結(jié)晶區(qū)和無定形區(qū)并沒有明確的界限, 變化是漸進(jìn)的。1895年Meyer 最早提出的淀粉顆粒模型。1969年Nikuni 7根據(jù)直鏈淀粉是和支鏈淀粉結(jié)合而存在的設(shè)想提出淀粉粒的單分子主張。1984年Lineback 8在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn), 主要是基于支鏈淀粉分子為“簇”的概念, 而直鏈淀粉則隨機(jī)或呈螺旋結(jié)構(gòu)而存在, 這取決與顆粒中脂類物質(zhì), 因?yàn)榇蠖鄶?shù)谷類淀粉存在著這類物質(zhì)。而Ostergetel 和van (上接第39頁8Seto A ,W ang H L ,Hesseltine C W

30、 , et al. Culture conditions affect e 2icosapentaenoic acid content of Chlorella minutissima J.Jaocs ,1984, 61(5 :892-894.9Renaud S M ,Zhou H C ,Parry D L , et al. E ffect of tem perature on thegrowth ,total lipid content and fatty acid com position of recently is olated tropical microalgae Isochrys

31、is sp. et al J.Applied Phycology ,1995,7:595-602.10周洪琪,Renaud S M ,Parry D L , 等. 溫度對(duì)新月菱形藻、鏟狀菱形Bruggen 9認(rèn)為, 結(jié)晶區(qū)是由連續(xù)的超分子螺旋結(jié)構(gòu)的支鏈淀粉組成, 螺旋結(jié)構(gòu)中有許多空隙, 可以容納直鏈淀粉分子。盡管直鏈淀粉的分支有時(shí)出現(xiàn)在無定形區(qū), 但科學(xué)家發(fā)現(xiàn)支鏈之間極易形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。1997年G allant 等10提出淀粉顆粒中有晶體(堅(jiān)固的殼體 顆粒狀結(jié)構(gòu)物(blocklets , 根據(jù)不同的淀粉類型及在顆粒中的定位, 其直徑范圍為20500nm , 這種結(jié)構(gòu)與半晶體(軟殼體 小顆粒狀

32、結(jié)構(gòu)物(2050nm 交替出現(xiàn)。小顆粒(約9nm 厚 又由交替出現(xiàn)的晶型和非晶型層組成。筆者認(rèn)為, 淀粉顆粒內(nèi)存在兩種組成及性質(zhì)不, , , 它們?cè)赬 射線衍。這對(duì)DSC 曲線上出現(xiàn)的雙峰熔融現(xiàn)象作出很好的解釋。當(dāng)?shù)矸垲w粒含水量在平衡水分以下時(shí), 隨著含水量的改變, 鏈鏈衍射晶峰的強(qiáng)度和面積基本保持不變, 而鏈水衍射晶峰的強(qiáng)度和面積則隨著含水量的增減而增減。另外當(dāng)?shù)矸垲w粒分散在常溫水分散系中時(shí)含水量在平衡水分以上時(shí), 盡管只發(fā)生了輕度的可逆溶脹, 其分子團(tuán)簇的能量結(jié)構(gòu)性質(zhì)發(fā)生了根本性質(zhì)變化, 導(dǎo)致但淀粉顆粒原有的結(jié)晶結(jié)構(gòu)已收到很大程度的破壞, 而且這種破壞作用對(duì)鏈鏈結(jié)晶結(jié)構(gòu)和鏈水結(jié)晶結(jié)構(gòu)的影響基本上是一致的。因此如果在特定的酶作用而無勢壘的情況下可以進(jìn)行常溫下的水解。logical consequences of brown tides in U. S. mid 2Atlantic coastal waters J.Limnol Oceanogr ,1997,42(5 :1023-1038.15沈頌東. 氮素對(duì)小球藻生長的影響J.水利漁業(yè),2003,23(2 :55-57.16Y ongmanitchai W ,W ard O P. Omega 23fatty acids :Alternatives ourcesof productionJ.Process Biochem ,1