1、關于動物基因工程關于動物基因工程現在學習的是第一頁，共38頁第一節第一節 基因工程概述基因工程概述 基因工程基因工程(Genetic engineering)是一種是一種DNA重組技術，它是重組技術，它是在分子水平上進行的遺傳操作，即把供體細胞中的基因在分子水平上進行的遺傳操作，即把供體細胞中的基因或基因組提取出來，按照預先設計的藍圖，經過體外加或基因組提取出來，按照預先設計的藍圖，經過體外加工重組，或者把人工合成的基因轉移到受體細胞并獲得工重組，或者把人工合成的基因轉移到受體細胞并獲得新的遺傳特性的技術。由于被轉移的基因必須與載體新的遺傳特性的技術。由于被轉移的基因必須與載體DNA重組后才能

2、實現轉移，所以基因工程也叫做重組重組后才能實現轉移，所以基因工程也叫做重組DNA技技術。術。基因工程的基本操作程序包括：基因工程的基本操作程序包括：(1) 目的基因的分離或合成；目的基因的分離或合成；(2)用工具酶對目的基因和載體（用工具酶對目的基因和載體（Vector）進行加工處理，）進行加工處理，把目的基因與載體結合成重組把目的基因與載體結合成重組DNA分子；分子；(3)把重組把重組DNA分分子引入受體細胞，并使目的基因和載體上其他基因得以表達；子引入受體細胞，并使目的基因和載體上其他基因得以表達；（4）轉化體細胞的擴增；（）轉化體細胞的擴增；（5）重組體細胞的鑒定與篩選。）重組體細胞的鑒

3、定與篩選。現在學習的是第二頁，共38頁基因克隆示意圖現在學習的是第三頁，共38頁第二節第二節 工具酶工具酶限制性核酸內切酶切割DNADNA連接酶生成3- 5磷酸二酯鍵DNA聚合酶探針標記、補平3末端反轉錄酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5磷酸化、探針標記末端轉移酶3末端多聚尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基常用的工具酶常用的工具酶現在學習的是第四頁，共38頁限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶細菌限制修飾體系細菌限制修飾體系 限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶 甲基化酶甲基化酶識別特異的位點識別特異的位點酶切位點酶切位點回文結構回文結構 46 bp出現兩種末端出現兩種末端粘性末端粘性末端 粘端粘端 平頭末端平頭

4、末端 平端平端 配伍末端配伍末端現在學習的是第五頁，共38頁二、二、DNA聚合酶聚合酶 （一）（一）DNA聚合酶聚合酶I (全酶全酶) (E. coli DNA Polymease)（二）（二）K1enow片段片段(E.co1i) （三）（三）T4 DNA聚合酶聚合酶 (T4噬茵體感染的噬茵體感染的Eco1i) （四）（四）Taq DNA聚合酶聚合酶(Thermusaqraticus) （五）逆轉錄酶（五）逆轉錄酶（reverse transcriptase） （六）末端轉移酶（六）末端轉移酶 現在學習的是第六頁，共38頁三、三、DNA連接酶連接酶 在大腸桿菌和動物細胞中都發現了在大腸桿菌和動

5、物細胞中都發現了DNA連接酶，這種酶能夠催化連接酶，這種酶能夠催化DNA中相鄰的中相鄰的 3一一OH和和5一磷酸基末端之間形成磷酸二酯鍵。連接反應一磷酸基末端之間形成磷酸二酯鍵。連接反應的最適溫度是的最適溫度是37，但在此溫度下粘性末端之間氫鍵結合很不穩定。，但在此溫度下粘性末端之間氫鍵結合很不穩定。實驗表明，實驗表明，15對于連接反應和粘性末端氫鍵結合的穩定性都是合適的。對于連接反應和粘性末端氫鍵結合的穩定性都是合適的。四四、甲基化酶、甲基化酶 細胞的限制一修飾系統中的修飾作用是由甲基化酶細胞的限制一修飾系統中的修飾作用是由甲基化酶(methylase)(methylase)米完米完成的。甲

6、基化酶同限制性內切酶具有完全相同的識別順序。甲基化酶成的。甲基化酶同限制性內切酶具有完全相同的識別順序。甲基化酶使識別順序中的某個堿基發生甲基化，保護使識別順序中的某個堿基發生甲基化，保護DNADNA不被限制性內切酶切不被限制性內切酶切開。真核生物中目前只發現開。真核生物中目前只發現5 5甲基胞嘧啶甲基胞嘧啶(M5C)(M5C)。 現在學習的是第七頁，共38頁 五、核酸酶五、核酸酶 （一）核酸酶（一）核酸酶S1 (Nuclease S1) 核酸酶核酸酶S1主要用于：主要用于：(1)分析分析DNA：RNA雜交體結構。通過降解成熟雜交體結構。通過降解成熟mRNA與放與放射性標記基因組、射性標記基因

7、組、DNA的雜交體確定內含子部位。的雜交體確定內含子部位。 (2)切除切除DNA片段上的單鏈片段上的單鏈末端，形成平末端。末端，形成平末端。(3)切開切開cDNA合成過程中形成的發夾環。合成過程中形成的發夾環。 (4)在限制酶位點上在限制酶位點上產生小缺失。產生小缺失。 (二二)核酸外切酶核酸外切酶III （三）核酸外切酶（三）核酸外切酶VII（四）（四）DNA酶酶I （五）（五）RNA酶酶A (牛胰牛胰) （六）（六）RNA酶酶TI （七）（七）RNA酶酶H 現在學習的是第八頁，共38頁第三節基因工程的載體第三節基因工程的載體（Vector） 到目前為止，用于基因工程的載體有到目前為止，用于

8、基因工程的載體有8類：類： 細菌質粒載體；包括大腸桿菌和枯草桿菌質粒載體。細菌質粒載體；包括大腸桿菌和枯草桿菌質粒載體。 噬菌體衍生載體。噬菌體衍生載體。 柯斯質粒柯斯質粒(Cosmid)載體：一種由質粒和載體：一種由質粒和A噬菌體噬菌體cos尾巴構建尾巴構建 的復合載體。的復合載體。 噬菌體噬菌體M13衍生載體一類專門用于衍生載體一類專門用于Sanger法測序的載體。法測序的載體。 Phag9m5d載體：一類由噬菌體功能片段和質粒構建的復合載體：一類由噬菌體功能片段和質粒構建的復合 載體。載體。 酵母質粒載體：由酵母酵母質粒載體：由酵母2u質粒構建的酵母基因工程載體。質粒構建的酵母基因工程載

9、體。 真核病毒載體：包括動物病毒、植物病毒衍生載體。真核病毒載體：包括動物病毒、植物病毒衍生載體。 桿狀病毒和桿狀病毒和Bacmid載體；載體； 現在學習的是第九頁，共38頁作為基因工程的載體它們都具備以下一些作為基因工程的載體它們都具備以下一些共同的基本特點：共同的基本特點：作為基因工程的載體它們都具備以下一些共同的基本作為基因工程的載體它們都具備以下一些共同的基本特點：特點： 在宿主細胞中能獨立自主地復制。在宿主細胞中能獨立自主地復制。 表達載體含有強啟動于，能驅動靶基因在宿表達載體含有強啟動于，能驅動靶基因在宿 主細胞中表達。主細胞中表達。 容易從宿主細胞中分離純化。容易從宿主細胞中分離

10、純化。 載體載體DNA基因組中有一段不影響它們復制的非基因組中有一段不影響它們復制的非必需區域，插在其中的靶片段能被動地跟著載必需區域，插在其中的靶片段能被動地跟著載體體DNA一起復制，就像載體的正常成分一樣。一起復制，就像載體的正常成分一樣。現在學習的是第十頁，共38頁一、質粒載體一、質粒載體(plasmid vector) （1）質粒的一般性質）質粒的一般性質 1質粒的概念質粒的概念 質粒是細菌細胞染色體外存在于細質粒是細菌細胞染色體外存在于細胞質中能進行自我復制的一類小型胞質中能進行自我復制的一類小型DNA分子，大分子，大部分質粒為雙鏈環狀。部分質粒為雙鏈環狀。 2質粒的大小質粒的大小

11、3質粒的拷貝數質粒的拷貝數 4質粒的不親和性質粒的不親和性 5質粒的宿主范圍質粒的宿主范圍 現在學習的是第十一頁，共38頁質粒質粒存在于細菌染色體外的小型環狀雙存在于細菌染色體外的小型環狀雙鏈鏈DNA分子分子理想的質粒理想的質粒 1.拷貝數多拷貝數多; 2.兩三個抗藥性基因兩三個抗藥性基因 terr ampr 篩選標志篩選標志3.合適的限制性內切酶酶切位點（單一）合適的限制性內切酶酶切位點（單一）現在學習的是第十二頁，共38頁現在學習的是第十三頁，共38頁（二）（二） 噬菌體載體噬菌體載體( Phage vector) 噬菌體是一種溫和噬菌體，由于它的遺傳結構噬菌體是一種溫和噬菌體，由于它的遺

12、傳結構和宿主大腸桿菌的遺傳結構研究得比較清楚，并能在和宿主大腸桿菌的遺傳結構研究得比較清楚，并能在細菌中大量繁殖，所以成為廣泛采用的載體。細菌中大量繁殖，所以成為廣泛采用的載體。 噬菌噬菌體還有一大優點，即使它的體還有一大優點，即使它的DNA丟失丟失25仍不失活，仍不失活，這部分丟失的空檔正好可以裝載外源這部分丟失的空檔正好可以裝載外源DNA。 與質粒載體相比，與質粒載體相比，噬菌體作為載體可以克隆更噬菌體作為載體可以克隆更大一些的大一些的DNA片段，欲構件一個基因文庫，往往片段，欲構件一個基因文庫，往往可以減少文庫中克隆的數量。可以減少文庫中克隆的數量。現在學習的是第十四頁，共38頁（三）柯

13、斯質粒載體（三）柯斯質粒載體（Cosmid vector） 柯斯質粒載體又叫粘粒載體，這是柯斯質粒載體又叫粘粒載體，這是一種由人工構建的含有一種由人工構建的含有DNA的的cos序列和序列和質粒復制子的特殊類型的質粒載體。柯質粒復制子的特殊類型的質粒載體。柯斯質粒在結構組成上具有斯質粒在結構組成上具有 噬菌體的特性、噬菌體的特性、也具有質粒載體的特性和高容量的克隆也具有質粒載體的特性和高容量的克隆能力，一般可插入能力，一般可插入3540kb的外源基因，的外源基因，這是構建真核生物基因文庫的主要載體。這是構建真核生物基因文庫的主要載體。柯斯質粒適用于作基因簇和大基因的克柯斯質粒適用于作基因簇和大基

14、因的克隆。隆。 現在學習的是第十五頁，共38頁（四）（四）YAC載體載體 YAC YAC是酵母人工染色體（是酵母人工染色體（Yeast artificial chromosomeYeast artificial chromosome）的）的縮寫，是目前能容納最大外源縮寫，是目前能容納最大外源DNADNA片段的載體。簡單地說，酵片段的載體。簡單地說，酵母人工染色體載體有兩個臂，之間有著絲粒，每個臂的末端有母人工染色體載體有兩個臂，之間有著絲粒，每個臂的末端有一個端粒，另外，染色體上還有供選擇的標記基因；當外源一個端粒，另外，染色體上還有供選擇的標記基因；當外源DNADNA片段連接進兩個臂中以后，

15、通過選擇標記人們可以從酵母片段連接進兩個臂中以后，通過選擇標記人們可以從酵母宿主細胞中篩選出重組的人工染色體。宿主細胞中篩選出重組的人工染色體。 實驗結果證明，每個實驗結果證明，每個YACYAC都可以裝進都可以裝進100100萬堿基以上的萬堿基以上的DNADNA片段，這種大小比柯斯質粒的裝載能力要大數倍，所片段，這種大小比柯斯質粒的裝載能力要大數倍，所以可以保證基因結構的完整性。以可以保證基因結構的完整性。現在學習的是第十六頁，共38頁(五五) 動物病毒動物病毒 動物病毒作為載體可用于外源基因向真核細胞的動物病毒作為載體可用于外源基因向真核細胞的轉入。作為基因介導的動物轉入。作為基因介導的動物

16、DNA載體，必須具備以下條載體，必須具備以下條件：件：(1)具有動物病毒的復制起始部位及啟動子，以便外具有動物病毒的復制起始部位及啟動子，以便外源基因能有效的轉染動物細胞，以及提供必要的轉錄信源基因能有效的轉染動物細胞，以及提供必要的轉錄信號：號：(2)具有可供選擇的標志基因，因為重建的病毒轉染具有可供選擇的標志基因，因為重建的病毒轉染力很低，一般僅為力很低，一般僅為105107，只有利用標志基因才能選出轉，只有利用標志基因才能選出轉化細胞株；化細胞株；(3)具有適當的多種單一內切酶位點供外源基具有適當的多種單一內切酶位點供外源基因插入。因插入。 目前常用的基因轉移載體有：目前常用的基因轉移載

17、體有：(1)猴空泡病毒猴空泡病毒(Simian virus 40簡稱簡稱SV40)；(2)腺病毒腺病毒(Adenovirus)；(3)乳頭狀病乳頭狀病毒毒(Papilloma virus)；(4)逆轉錄病毒逆轉錄病毒(Retrovirus); (5) 牛痘牛痘(Vaccinia)病毒病毒; (6) 牛疣病毒牛疣病毒(Bovine papilloma virus)等。等。現在學習的是第十七頁，共38頁 三、獲得目的基因的方法三、獲得目的基因的方法 ( (一一) )利用理化方法分離基因利用理化方法分離基因 理化方法分離基因是依據理化方法分離基因是依據DNADNA雙鏈結構雙鏈結構的特點和四種堿基互補

18、的氫鍵差異，其的特點和四種堿基互補的氫鍵差異，其方法有以下四種：方法有以下四種： 1 1密度梯度超速離心法密度梯度超速離心法 2 2單鏈酶法單鏈酶法 3 3多聚賴氨酸法多聚賴氨酸法 4 4分子雜交法分子雜交法現在學習的是第十八頁，共38頁( (二二) )利用生物學方法分離基因利用生物學方法分離基因 利用噬菌體轉染或質粒轉化等微生物學技術利用噬菌體轉染或質粒轉化等微生物學技術分離基因的方法，我們把它叫做生物學方法。分離基因的方法，我們把它叫做生物學方法。這種方法應用于原核基因的分離提取。這種方法應用于原核基因的分離提取。 用 適 當 的 限 制 性 內 切 酶用 適 當 的 限 制 性 內 切

19、酶 ( R e s t r i c t i o n ( R e s t r i c t i o n endonuclease )endonuclease )將整個染色體或將整個染色體或DNADNA分子切成許多相分子切成許多相當于一個或略大于一個基因的片段，然后把全部當于一個或略大于一個基因的片段，然后把全部DNADNA片段與質粒組成重組片段與質粒組成重組DNADNA分子，并轉化到某特定基因分子，并轉化到某特定基因營養缺陷型受體菌內，進行純系繁殖，再經分離鑒定，營養缺陷型受體菌內，進行純系繁殖，再經分離鑒定，選出所需基因。選出所需基因。現在學習的是第十九頁，共38頁 ( (三三) )基因的人工合

20、成基因的人工合成 化學合成法化學合成法 逆轉錄法逆轉錄法(Reverse transcription)(Reverse transcription) 逆轉錄法也叫逆轉錄法也叫cDNAcDNA法，它是一種酶促合法，它是一種酶促合成法，即以成法，即以mRNAmRNA為模板，在反轉錄酶的作為模板，在反轉錄酶的作用下，以四種脫氧核苷三磷酸為材料合成用下，以四種脫氧核苷三磷酸為材料合成DNA(cDNA)DNA(cDNA)，再經復制后即成雙鏈，再經復制后即成雙鏈DNADNA。3. 聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應 (PCR)現在學習的是第二十頁，共38頁四、重組四、重組DNADNA分子分子 1. 粘性末端連接

21、粘性末端連接 連接效率高連接效率高相同酶切末端相同酶切末端配伍末端配伍末端2.平端連接平端連接 連接效率低連接效率低3.同聚物接尾法同聚物接尾法4.人工接頭法人工接頭法現在學習的是第二十一頁，共38頁現在學習的是第二十二頁，共38頁五、基因的轉移五、基因的轉移(Gene transfer) (一一)、重組、重組DNA向細菌細胞轉入向細菌細胞轉入 把以質粒為載體的重組把以質粒為載體的重組DNA分子引入受體細胞的分子引入受體細胞的過程叫做轉化過程叫做轉化(Transformation)；把以噬菌體或；把以噬菌體或病毒為載體的重組病毒為載體的重組DNA分子引入受體細胞的過程分子引入受體細胞的過程叫做

22、轉染叫做轉染(Transfetion)。 對細菌細胞進行轉化或轉染的關鍵是細胞處在感受對細菌細胞進行轉化或轉染的關鍵是細胞處在感受態，所謂感受態細胞，就是受體細胞處于攝入外源態，所謂感受態細胞，就是受體細胞處于攝入外源DNA的狀態。一般用的狀態。一般用0.010.05 M/L氯化鈣處理受氯化鈣處理受體細胞，可以引起細胞膨脹，增大細胞的通透性，體細胞，可以引起細胞膨脹，增大細胞的通透性，使重組使重組DNA進入細胞，提高轉化效率。進入細胞，提高轉化效率。現在學習的是第二十三頁，共38頁轉導作用轉導作用 transduction病毒、噬菌體介導病毒、噬菌體介導溶菌途徑溶菌途徑溶原菌途徑溶原菌途徑現在

23、學習的是第二十四頁，共38頁(二二)、外源目的基因向真核細、外源目的基因向真核細胞轉入胞轉入 向真核細胞中轉移基因的方法可分為向真核細胞中轉移基因的方法可分為兩大類，兩大類，類需借助于載體，另類需借助于載體，另類不類不需借助于載體。需借助于載體。 1 借助于載體的基因轉移借助于載體的基因轉移 2不需載體的基因轉移不需載體的基因轉移 磷酸鈣沉淀法磷酸鈣沉淀法 脂質體介導法脂質體介導法 血影細胞血影細胞(Blood shadow cell)介導法介導法 現在學習的是第二十五頁，共38頁六、轉化細胞的篩選與鑒定六、轉化細胞的篩選與鑒定 轉化或轉染的效率是很低的轉化或轉染的效率是很低的(一般為一般為1

24、05106)，也就是說，只有極少數細胞接受到，也就是說，只有極少數細胞接受到重組重組DNA分子，能實現基因的轉移。所分子，能實現基因的轉移。所以必須從大量的培養細胞中篩選出已被以必須從大量的培養細胞中篩選出已被外源外源DNA轉化了的細胞，然后建立無性轉化了的細胞，然后建立無性繁殖系，使所需基因大量擴增和表達。繁殖系，使所需基因大量擴增和表達。 現在學習的是第二十六頁，共38頁重組體的篩選重組體的篩選 screening/selection 1. 直接選擇法直接選擇法 抗藥性標志選擇抗藥性標志選擇 標志補救標志補救 表達產物與營養缺陷互補表達產物與營養缺陷互補 互補互補 藍白斑篩選藍白斑篩選 分

25、子雜交分子雜交 探針探針原位雜交原位雜交 /Southern印跡法印跡法 限制性酶切圖譜限制性酶切圖譜/PCR 2.非直接選擇法非直接選擇法 免疫學方法免疫學方法現在學習的是第二十七頁，共38頁七七 克隆基因的表達克隆基因的表達 載體有轉錄、翻譯的元件載體有轉錄、翻譯的元件 密碼子通用密碼子通用1 、 原核表達體系原核表達體系 原核表達載體的標準原核表達載體的標準 合適的篩選標志合適的篩選標志 強啟動子強啟動子 翻譯控制序列翻譯控制序列 多克隆位點多克隆位點現在學習的是第二十八頁，共38頁融合蛋白融合蛋白 包涵體包涵體大腸桿菌表達體系的不足大腸桿菌表達體系的不足缺乏轉錄后加工機制，只能表達缺乏

26、轉錄后加工機制，只能表達cDNA缺乏翻譯后加工機制，不能折疊和糖基缺乏翻譯后加工機制，不能折疊和糖基化化融合蛋白形成包涵體，復性后才有活融合蛋白形成包涵體，復性后才有活性性1. 很難表達大量的可容性蛋白很難表達大量的可容性蛋白現在學習的是第二十九頁，共38頁現在學習的是第三十頁，共38頁真核表達體系真核表達體系 篩選標志篩選標志 Neor G418轉染方法轉染方法磷酸鈣沉淀磷酸鈣沉淀DEAE葡聚糖介導轉染葡聚糖介導轉染電穿孔電穿孔脂質體轉染脂質體轉染顯微注射顯微注射瞬時轉染瞬時轉染 目的基因不整合進宿主基因組目的基因不整合進宿主基因組穩定轉染穩定轉染 目的基因整合進宿主基因組目的基因整合進宿主

27、基因組 現在學習的是第三十一頁，共38頁第三節第三節 轉基因動物技術轉基因動物技術 一、轉基因動物的概念一、轉基因動物的概念 轉基因技術是將外源轉基因技術是將外源DNA導入細胞的一種技導入細胞的一種技術。它是在術。它是在DNA重組技術的基礎上發展起來的。重組技術的基礎上發展起來的。1981年年Gordon和和Ruddle首次用顯微注射法首次用顯微注射法(Microinjection)把外源基因導入小鼠受精卵的雄把外源基因導入小鼠受精卵的雄核，并將注射后的受精卵植入假孕母鼠子宮，產核，并將注射后的受精卵植入假孕母鼠子宮，產生了的生了的78只小鼠，其中有只小鼠，其中有2只的所有細胞中只的所有細胞中

28、(包括包括生殖細胞生殖細胞)都含有外源基因，但因缺乏啟動子而都含有外源基因，但因缺乏啟動子而不能表達，他們把出生后帶外源基因的小鼠叫不能表達，他們把出生后帶外源基因的小鼠叫做轉基因小鼠做轉基因小鼠(Transgenic Mice)，自此以后，凡帶，自此以后，凡帶有外源基因的動物都叫做轉基因動物有外源基因的動物都叫做轉基因動物(Transgenic animal)。現在學習的是第三十二頁，共38頁二、轉基因動物技術的一般步驟二、轉基因動物技術的一般步驟 (1)選擇能有效表達的蛋白質；選擇能有效表達的蛋白質；(2)克隆與分離編碼這些蛋白質的基因；克隆與分離編碼這些蛋白質的基因；(3)選擇能與所需組織特異性表達方式相適應的基因選擇能與所需組織特異性表達方式相適應的基因調節序列；調節序列；(4)把調節序列與結構基因重組拼接，并在培養細胞把調節序列與結構基因重組拼接，并在培養細胞或小鼠中預先檢驗其表達情況；或小鼠中預先檢驗其表達情況；(5)把拼接的基因注射到受精卵的細胞核中；把拼接的基因注射到受精卵的細胞核中；(6)把注射后的受精卵移植到子宮，完成胚胎發把注射后的受精卵移植到子宮，完成胚胎發(7) 檢測幼畜是否整合外源基因