1、第四章第四章 毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)一、毒理學(xué)實驗的原則一、毒理學(xué)實驗的原則二、毒理學(xué)實驗的目的二、毒理學(xué)實驗的目的三、實驗動物的選擇和處置三、實驗動物的選擇和處置四、劑量設(shè)置和對照四、劑量設(shè)置和對照五、結(jié)果處理五、結(jié)果處理一、毒理學(xué)實驗的原則一、毒理學(xué)實驗的原則化學(xué)物在實驗動物中產(chǎn)生的作用可以化學(xué)物在實驗動物中產(chǎn)生的作用可以外推于人：（外推于人：（1 1人是最敏感的動物；人是最敏感的動物；（2 2人和實驗動物的生物學(xué)過程包人和實驗動物的生物學(xué)過程包括化學(xué)物的代謝，與體重或體表面積括化學(xué)物的代謝，與體重或體表面積相關(guān)。相關(guān)。實驗動物必須暴露于高劑量，這是發(fā)實驗動物必須暴露于高劑量，這是發(fā)

2、現(xiàn)對人造成潛在危害的可靠方法。現(xiàn)對人造成潛在危害的可靠方法。成年的健康動物和人可能的暴露途徑成年的健康動物和人可能的暴露途徑是基本的選擇。是基本的選擇。毒理學(xué)實驗的局限性毒理學(xué)實驗的局限性-動物實驗結(jié)果外推到人的不確定性動物實驗結(jié)果外推到人的不確定性動物與人對外源化學(xué)物的反應(yīng)敏感性可能不同，動物與人對外源化學(xué)物的反應(yīng)敏感性可能不同，甚至存在質(zhì)的差別；甚至存在質(zhì)的差別；使用少量動物、采用較大劑量，使對群體的代表使用少量動物、采用較大劑量，使對群體的代表性較差，可能造成高劑量與低劑量的差異；性較差，可能造成高劑量與低劑量的差異；動物數(shù)量較少，對低概率毒效應(yīng)難以發(fā)現(xiàn)；動物數(shù)量較少，對低概率毒效應(yīng)難以

3、發(fā)現(xiàn)；實驗動物為純系，成年動物，反應(yīng)較單一，與接實驗動物為純系，成年動物，反應(yīng)較單一，與接觸人群的復(fù)雜性不匹配，對外源化學(xué)物的易感性觸人群的復(fù)雜性不匹配，對外源化學(xué)物的易感性存在差異。存在差異。二、毒理學(xué)實驗的目的二、毒理學(xué)實驗的目的受試物毒作用的表現(xiàn)和性質(zhì)描述毒理學(xué)）受試物毒作用的表現(xiàn)和性質(zhì)描述毒理學(xué)） 在急性或慢性實驗中觀察動物異常，發(fā)在急性或慢性實驗中觀察動物異常，發(fā)現(xiàn)有害作用現(xiàn)有害作用劑量劑量- -反響效應(yīng)研討反響效應(yīng)研討 毒性評價和安全性評價的基礎(chǔ)；得到多毒性評價和安全性評價的基礎(chǔ)；得到多種毒性參數(shù)和劑量種毒性參數(shù)和劑量- -反響效應(yīng)線的斜率反響效應(yīng)線的斜率確定毒作用的器官確定毒作用

4、的器官 闡明毒作用特點，為機制研究和毒性闡明毒作用特點，為機制研究和毒性防治提供線索防治提供線索確定損傷的可逆性確定損傷的可逆性通過動物對外源化學(xué)物的毒性反應(yīng)，向人外推，通過動物對外源化學(xué)物的毒性反應(yīng)，向人外推，以期評價化學(xué)物對人的危害和危險性以期評價化學(xué)物對人的危害和危險性三、動物實驗的職業(yè)道德三、動物實驗的職業(yè)道德一般原則一般原則人道主義的管理人道主義的管理和處理和處理使痛覺和不適感使痛覺和不適感減到最小減到最小避免不必要的使避免不必要的使用動物用動物3R 準繩準繩replacement替代：用替代：用無知覺材料的科學(xué)方無知覺材料的科學(xué)方法替代有知覺脊椎動法替代有知覺脊椎動物的方法物的方法

5、reduction減少：保證減少：保證數(shù)據(jù)信息前提下，盡數(shù)據(jù)信息前提下，盡量減少動物使用數(shù)量量減少動物使用數(shù)量refinement優(yōu)化：必須優(yōu)化：必須使用動物時，減少非使用動物時，減少非人道程序的影響人道程序的影響實驗動物：指經(jīng)人工培育，對其攜帶微實驗動物：指經(jīng)人工培育，對其攜帶微生物實行控制，遺傳背景明確，來源生物實行控制，遺傳背景明確，來源清楚，可用于科學(xué)研究的動物。清楚，可用于科學(xué)研究的動物。四、實驗動物的選擇四、實驗動物的選擇（一物種選擇（一物種選擇基本原則：基本原則：對外源化學(xué)物的毒性反應(yīng)及代謝特點與人對外源化學(xué)物的毒性反應(yīng)及代謝特點與人類接近的物種很難滿足）；類接近的物種很難滿足）

6、；自然壽命不太長的物種；自然壽命不太長的物種；易于飼養(yǎng)和實驗操作的物種；易于飼養(yǎng)和實驗操作的物種；經(jīng)濟并易于獲得的物種。經(jīng)濟并易于獲得的物種。常規(guī)實驗選擇兩個物種，分屬：常規(guī)實驗選擇兩個物種，分屬：嚙齒類嚙齒類非嚙齒類非嚙齒類 豚鼠：特點是毛短而光滑，生長快，抗病力強，繁殖性能好。廣泛用于藥物學(xué)、傳染病學(xué)、免疫學(xué)、營養(yǎng)學(xué)、耳科學(xué)等各項醫(yī)學(xué)及生物學(xué)的研究中。 C57BL/6J小鼠：黑色，對放射物質(zhì)耐受性強，但照射后肝癌發(fā)生率高。眼畸形，對結(jié)核桿菌有耐受性嗜酒精性高，是腫瘤學(xué)、生理學(xué)、遺傳學(xué)研究常用品系。 SD大鼠：白色，產(chǎn)仔多，生長發(fā)育較Wistar大鼠為快，對疾病的抵抗力尤以呼吸道疾病的抵抗力

7、強。自發(fā)腫瘤發(fā)生率較低，對性激素感受性高。 Lewise大鼠：近交系大鼠，白化，對誘發(fā)自身免疫心肌炎高度敏感，可誘發(fā)過敏性腦脊髓炎、過敏性關(guān)節(jié)炎和自身免疫復(fù)合物血管球性腎炎等立刻移植多種腫瘤，高脂肪食物容易引起肥胖癥。 BALB/c小鼠：對致癌因子敏感，對放射性照射極為敏感。生產(chǎn)性能良好，繁殖期長，廣泛應(yīng)用于腫瘤學(xué)、生理學(xué)、免疫學(xué)、核醫(yī)學(xué)和單克隆抗體等研究。 BN大鼠：近交系大鼠，棕色，對實驗過敏性腦脊髓炎有抗力。對自家免疫性復(fù)合性腎小球腎炎也具抗力。平均31月齡大鼠心內(nèi)膜疾病的發(fā)生率為7%，先天性高血壓為30%。 長爪沙鼠：被毛棕灰色，對許多需氧及厭氧菌敏感，對多種病毒、寄生蟲等敏感，也常用

8、于腦神經(jīng)病、內(nèi)分泌學(xué)、代謝病、腫瘤學(xué)等方面的研究。 品系：指用計劃交配的方法獲得的起源于共同品系：指用計劃交配的方法獲得的起源于共同祖先的一群動物。祖先的一群動物。同一品系的動物具有共同的遺傳來源、相似的同一品系的動物具有共同的遺傳來源、相似的外貌特征、獨特的生物學(xué)特性、穩(wěn)定的遺傳外貌特征、獨特的生物學(xué)特性、穩(wěn)定的遺傳性能性能（二品系選擇（二品系選擇（1近交系動物：指采用連續(xù)20代以上兄妹交配或親子交配而培育的純品系動物。 基因純合度98.6%99.8% 適用于涉及組織或腫瘤移植的實驗. 津白、津白、615、BALB/c、C3H小鼠突變系動物：動物在生長繁殖過程中，通過突變系動物：動物在生長繁

9、殖過程中，通過自然突變或人工定向突變的方法，使其某自然突變或人工定向突變的方法，使其某基因發(fā)生突變并喪失原有的正常功能，該基因發(fā)生突變并喪失原有的正常功能，該突變基因可以世代相傳并保持遺傳基因特突變基因可以世代相傳并保持遺傳基因特性的品系動物。性的品系動物。無胸腺裸鼠：免疫系統(tǒng)缺陷可接受人類多種無胸腺裸鼠：免疫系統(tǒng)缺陷可接受人類多種癌細胞移植。癌細胞移植。免疫毒理學(xué)、化學(xué)致癌作用等研究領(lǐng)域免疫毒理學(xué)、化學(xué)致癌作用等研究領(lǐng)域(2)雜交群動物：指兩個不同近交系之間有目雜交群動物：指兩個不同近交系之間有目的地進行交配所產(chǎn)生的第一代動物，即雜交的地進行交配所產(chǎn)生的第一代動物，即雜交第一代動物。第一代動

10、物。具兩系雙親所有的遺傳特性，雜合程度一致，具兩系雙親所有的遺傳特性，雜合程度一致，個體差異小；具備雜交優(yōu)勢，生命力強，無個體差異小；具備雜交優(yōu)勢，生命力強，無近親衰退現(xiàn)象。近親衰退現(xiàn)象。不能繼續(xù)繁殖育種，因在子二代會發(fā)生遺傳性不能繼續(xù)繁殖育種，因在子二代會發(fā)生遺傳性狀分離。狀分離。(3)封閉群動物：指在封閉群動物：指在5年以上不從外部引進年以上不從外部引進新血緣，僅由同一品系的動物在固定場所新血緣，僅由同一品系的動物在固定場所保存繁殖的動物群保存繁殖的動物群. 具有一定程度的遺傳學(xué)差異具有一定程度的遺傳學(xué)差異. 昆明種小鼠、昆明種小鼠、NIH小鼠、小鼠、LACA小鼠、小鼠、SD大鼠、青紫藍兔

11、、新西蘭兔等均屬封閉群大鼠、青紫藍兔、新西蘭兔等均屬封閉群動物動物.動物品系的遺傳均一性動物品系的遺傳均一性 遺傳均一性排序：近交系雜交群遺傳均一性排序：近交系雜交群封閉群封閉群 實驗動物選擇：適宜品系、固定品實驗動物選擇：適宜品系、固定品系系無菌動物無菌動物GF：指體內(nèi)外均無任何微生物和寄生蟲的：指體內(nèi)外均無任何微生物和寄生蟲的動物。是經(jīng)人工剖腹產(chǎn)凈化培育。動物。是經(jīng)人工剖腹產(chǎn)凈化培育。悉生動物悉生動物GN：已知菌動物，指體內(nèi)帶有已知微生物：已知菌動物，指體內(nèi)帶有已知微生物的動物。經(jīng)人工有計劃地將已知菌投入動物體內(nèi)。的動物。經(jīng)人工有計劃地將已知菌投入動物體內(nèi)。（三實驗動物微生物控制的選擇（三

12、實驗動物微生物控制的選擇按照微生物控制分類，實驗動物分為四級按照微生物控制分類，實驗動物分為四級無特定病原體動物無特定病原體動物SPF：指體內(nèi)無特定的：指體內(nèi)無特定的微生物和寄生蟲存在的動物。來源于微生物和寄生蟲存在的動物。來源于GF和和GN，飼養(yǎng)于封閉的系統(tǒng)中。，飼養(yǎng)于封閉的系統(tǒng)中。 SPF已成為國際上進行毒理學(xué)試驗的標已成為國際上進行毒理學(xué)試驗的標準實驗動物。準實驗動物。清潔動物清潔動物CL：即最低限度無疾病動物，動：即最低限度無疾病動物，動物體內(nèi)外不攜帶人畜共患疾病的病原體物體內(nèi)外不攜帶人畜共患疾病的病原體或動物傳染病病原體。飼養(yǎng)于半屏蔽系或動物傳染病病原體。飼養(yǎng)于半屏蔽系統(tǒng)。統(tǒng)。（四）

13、、個體選擇（四）、個體選擇性別：初次試驗雌雄同用；存在差異分開統(tǒng)性別：初次試驗雌雄同用；存在差異分開統(tǒng)計；選敏感性別。計；選敏感性別。年齡和體重：動物年齡依實驗類型選擇，取年齡和體重：動物年齡依實驗類型選擇，取成年期數(shù)據(jù)。體重可作為判斷年齡的指標。成年期數(shù)據(jù)。體重可作為判斷年齡的指標。生理狀態(tài)：避免激素影響，雌雄分開飼養(yǎng)；生理狀態(tài)：避免激素影響，雌雄分開飼養(yǎng)；繁殖實驗、致畸試驗適時合籠交配。繁殖實驗、致畸試驗適時合籠交配。健康狀況：用健康動物，提前觀察確認。健康狀況：用健康動物，提前觀察確認。（五實驗動物管理（五實驗動物管理 動物管理：動物的接受、順應(yīng)、豢養(yǎng)、鑒動物管理：動物的接受、順應(yīng)、豢養(yǎng)

14、、鑒別和記錄動物來源、處置、其它資料）別和記錄動物來源、處置、其它資料）. 環(huán)境條件管理：氣候溫度、濕度、通風(fēng)、環(huán)境條件管理：氣候溫度、濕度、通風(fēng)、光照）、其它條件噪音、氣味、墊料、光照）、其它條件噪音、氣味、墊料、群體密度、空間限制）、飼料、飲水等群體密度、空間限制）、飼料、飲水等. 設(shè)施管理：清潔衛(wèi)生、廢棄物處理、害蟲設(shè)施管理：清潔衛(wèi)生、廢棄物處理、害蟲控制、突發(fā)事件管理控制、突發(fā)事件管理.五、受試物樣品的準備五、受試物樣品的準備 了解其化學(xué)結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)：揮發(fā)性、了解其化學(xué)結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)：揮發(fā)性、溶解性、穩(wěn)定性；溶解性、穩(wěn)定性； 純度及雜質(zhì)成分；純度及雜質(zhì)成分； 采用同一種同一批號受試物

15、采用同一種同一批號受試物; 毒性資料查閱形似化學(xué)物）毒性資料查閱形似化學(xué)物）; 制備成一定劑型：水溶液、油溶液、混制備成一定劑型：水溶液、油溶液、混懸液懸液.一、體內(nèi)毒理學(xué)試驗設(shè)計一、體內(nèi)毒理學(xué)試驗設(shè)計劑量分組劑量分組以獲得劑量以獲得劑量-反應(yīng)關(guān)系，確認受試物反應(yīng)關(guān)系，確認受試物與毒作用的關(guān)系：至少三個劑量組高、中、與毒作用的關(guān)系：至少三個劑量組高、中、低）；設(shè)對照組陽性、陰性、未處理對照、低）；設(shè)對照組陽性、陰性、未處理對照、歷史性對照）歷史性對照）各組動物數(shù)：實驗?zāi)康暮驮O(shè)計、統(tǒng)計學(xué)要求各組動物數(shù)：實驗?zāi)康暮驮O(shè)計、統(tǒng)計學(xué)要求試驗期限：由實驗?zāi)康暮退脛游锓N或品系決試驗期限：由實驗?zāi)康暮退脛?/p>

16、物種或品系決定：急毒為一次或定：急毒為一次或24h內(nèi)多次染毒觀察內(nèi)多次染毒觀察14天，天，亞慢性規(guī)定持續(xù)至動物壽命的亞慢性規(guī)定持續(xù)至動物壽命的10%，慢性實驗、，慢性實驗、致癌實驗為持續(xù)至動物壽命的大部分。致癌實驗為持續(xù)至動物壽命的大部分。六、毒理學(xué)實驗設(shè)計要點六、毒理學(xué)實驗設(shè)計要點二、體外毒理學(xué)試驗設(shè)計二、體外毒理學(xué)試驗設(shè)計 溶解性測試：在實驗測試期間，受試物溶解性可溶解性測試：在實驗測試期間，受試物溶解性可能改變，起始和結(jié)束時評價溶解性具有意義；能改變，起始和結(jié)束時評價溶解性具有意義； 最高劑量推薦：高劑量會影響滲透壓引發(fā)損傷，最高劑量推薦：高劑量會影響滲透壓引發(fā)損傷，上限為：動物細胞上限

17、為：動物細胞10mmol/L或或5mg/ml;細菌實驗細菌實驗5mg/平板。毒性物應(yīng)有毒效應(yīng)和致死率。平板。毒性物應(yīng)有毒效應(yīng)和致死率。 代謝活化：大鼠預(yù)處理后，取肝組織勻漿為代謝代謝活化：大鼠預(yù)處理后，取肝組織勻漿為代謝活化系統(tǒng)活化系統(tǒng)-S9p124） 陽性對照：劑量反應(yīng)的直線部分陽性對照：劑量反應(yīng)的直線部分 反復(fù)：可疑結(jié)果要重復(fù)，但非簡單重復(fù)反復(fù)：可疑結(jié)果要重復(fù)，但非簡單重復(fù)六、毒理學(xué)實驗設(shè)計要點六、毒理學(xué)實驗設(shè)計要點七、實驗動物染毒和處置七、實驗動物染毒和處置 盡可能模擬人接觸毒物的方式盡可能模擬人接觸毒物的方式 不同途徑的吸收速率為：靜注吸入不同途徑的吸收速率為：靜注吸入 肌注肌注 腹腔

18、注射腹腔注射 皮下注射皮下注射 經(jīng)經(jīng)口口 皮內(nèi)注射皮內(nèi)注射 其他其他一、染毒一、染毒 經(jīng)口染毒：（經(jīng)口染毒：（1喂飼、（喂飼、（2灌胃、（灌胃、（3吞咽膠囊；吞咽膠囊； 經(jīng)呼吸道染毒：（經(jīng)呼吸道染毒：（1靜式吸入染毒、（靜式吸入染毒、（2動式吸入染毒動式吸入染毒 經(jīng)皮膚染毒：經(jīng)皮膚染毒： 注射染毒：尾靜脈、肌注、皮下、腹腔注射染毒：尾靜脈、肌注、皮下、腹腔實驗動物染毒和處置實驗動物染毒和處置針對一種外源化學(xué)物，如何選擇染毒方式針對一種外源化學(xué)物，如何選擇染毒方式?二、生物標本采集二、生物標本采集 生物標本采集：（生物標本采集：（1血液終末、非終末血液終末、非終末采血）、（采血）、（2尿液采集、

19、（尿液采集、（3膽汁采集、膽汁采集、（4糞便采集糞便采集. 麻醉：短效、中效、長效麻醉劑使用麻醉：短效、中效、長效麻醉劑使用-；麻；麻醉過程觀察醉過程觀察. 安死術(shù)：安死術(shù)：p129. 病理解剖和樣標本留取：病理解剖和樣標本留取：(1大體解剖、大體解剖、（2組織病理學(xué)檢測組織病理學(xué)檢測.實驗動物染毒和處置實驗動物染毒和處置八、毒理學(xué)實驗的統(tǒng)計學(xué)基礎(chǔ)八、毒理學(xué)實驗的統(tǒng)計學(xué)基礎(chǔ) 統(tǒng)計學(xué)要點：統(tǒng)計學(xué)要點： 實驗設(shè)計遵循原則：隨機、反復(fù)、對照實驗設(shè)計遵循原則：隨機、反復(fù)、對照. 包括：包括： （1劑量水平數(shù)目及間隔；劑量水平數(shù)目及間隔； （2每個劑量點的實驗單位數(shù)，實驗單位確定每個劑量點的實驗單位數(shù)，實驗單位確定要保證樣本的獨立性、代表性；要保證樣本的獨立性、代表性； （3對照設(shè)置；對照設(shè)置； （4非實驗因素條件的均一性：樣本足夠數(shù)量、非實驗因素條件的均一性：樣本足夠數(shù)量、適當(dāng)重復(fù)、盲法觀察等。適當(dāng)重復(fù)、盲法觀察等。 結(jié)果統(tǒng)計分析：方法選擇，可用不同方法處理結(jié)果統(tǒng)計分析：方