1、1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序非編碼區非編碼區非編碼區非編碼區編碼區編碼區RNA聚合酶聚合酶結合位點結合位點外顯子外顯子內含子內含子終止子終止子啟動子啟動子原原核核真真核核補充知識補充知識: : 基因的結構基因的結構原核細胞原核細胞真核細胞真核細胞不同點不同點編碼區是編碼區是_ _的的編碼區是間隔的、編碼區是間隔的、_的的相同點相同點都由能夠編碼蛋白質的都由能夠編碼蛋白質的_和具和具有調控作用的有調控作用的_區組成的區組成的 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 1 1、 目的基因主要是指目的基因主要是指_編碼蛋白質的基因編碼蛋白質的基因 2 2、 目的基因的來源

2、目的基因的來源目前被廣泛提取使用的目的基因有：目前被廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、植物抗病基因蘇云金桿菌抗蟲基因、植物抗病基因人胰島素基因等。人胰島素基因等。也可以是一些具有調控作用的因子也可以是一些具有調控作用的因子 從已有的物種中分離從已有的物種中分離 人工的方法合成人工的方法合成(1)(1)從基因文庫中獲取目的基因從基因文庫中獲取目的基因基因文庫的概念及種類基因文庫的概念及種類從基因文庫中得到目的基因的方法從基因文庫中得到目的基因的方法（2 2）利用）利用PCRPCR技術擴增目的基因技術擴增目的基因（3 3）人工合成）人工合成 3、目前獲取目的基因的常用方法、目前獲取目的

3、基因的常用方法：構建基因文庫構建基因文庫基因文庫中不是直接保管相應基因，而是保存受體菌，菌中含基因。基因組文庫基因組文庫: 基因文庫中包含了一種生物所有的基因基因文庫中包含了一種生物所有的基因,這這種基因文庫叫做基因組文庫種基因文庫叫做基因組文庫.部分基因文庫部分基因文庫: 基因文庫中包含了一種生物的一部分基因基因文庫中包含了一種生物的一部分基因,這種基因文庫叫做部分基因文庫這種基因文庫叫做部分基因文庫.(如如cDNA文庫文庫)種類種類關系關系供體細胞中的供體細胞中的DNADNA許多許多DNADNA片段片段重組重組DNADNA多種限制酶多種限制酶分別與運載體連接分別與運載體連接受體菌群細胞受體

4、菌群細胞分別分別 導入導入（供體生物的基因組文庫）（供體生物的基因組文庫）基因組文庫基因組文庫構建構建(鳥槍法鳥槍法)mRNA 反轉錄反轉錄cDNA(互補互補DNA） DNA聚合酶聚合酶雙鏈雙鏈DNA反轉錄法：反轉錄法：部分基因文庫部分基因文庫（如如cDNAcDNA文庫）文庫）的構建的構建限制酶處理限制酶處理分別與運載體連接分別與運載體連接重組重組DNADNA分別分別 導入導入受體菌群細胞受體菌群細胞（cDNAcDNA文庫）文庫） 如果用某種生物發育的如果用某種生物發育的某個時期的某個時期的mRNA 反轉錄產生的多種互補反轉錄產生的多種互補DNA（也叫（也叫cDNA）片）片段，與載體連接后儲存

5、在一個受體菌群中，段，與載體連接后儲存在一個受體菌群中，那么，這個受體菌群體就構成了這種生物的那么，這個受體菌群體就構成了這種生物的cDNA文庫文庫。這種方法稱。這種方法稱反轉錄法反轉錄法文庫類型文庫類型cDNAcDNA文庫文庫基因組文庫基因組文庫文庫大小文庫大小小小大大基因種類基因種類某種生物的部分基因某種生物的部分基因某種生物的全部基因某種生物的全部基因基因中基因中啟動子啟動子無無有有基因中基因中內含子內含子無無有有說明說明基因文庫的組建過程就包含基因工程的基本操基因文庫的組建過程就包含基因工程的基本操作步驟作步驟。從基因文庫中獲取目的基因的優點是。從基因文庫中獲取目的基因的優點是操作簡便

6、，缺點是工作量大，具有一定的盲目操作簡便，缺點是工作量大，具有一定的盲目性性. .依據：目的基因的有關信息。依據：目的基因的有關信息。如：根據如：根據基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列基因的功能、基因在染色體上的位置基因的功能、基因在染色體上的位置基因的轉錄產物基因的轉錄產物mRNAmRNA基因的表達產物蛋白質等特性。基因的表達產物蛋白質等特性。如何從基因文庫中得到所需要的基因？如何從基因文庫中得到所需要的基因？質粒質粒DNADNA分子分子限制酶處理限制酶處理一個切口一個切口兩個黏性末端兩個黏性末端兩個切口兩個切口獲得目的基因獲得目的基因DNADNA連接酶連接酶重組重組DNADNA分子（重組質粒

7、）分子（重組質粒） 核心核心同一種同一種二、基因表達載體的構建二、基因表達載體的構建1 1、過程、過程: :2、目的：、目的：使目的基因在受體細胞中穩定存在，使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發揮作用。表達和發揮作用。 科學家在培育抗蟲棉時，經過了許多復雜的科學家在培育抗蟲棉時，經過了許多復雜的過程和不懈的努力，才獲得成功。過程和不懈的努力，才獲得成功。 起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質粒中，然后導入棉花的受精卵中，結果抗蟲基質粒中，然后導入棉花的受精卵中，結果抗蟲

8、基因在棉花體內沒有表達。因在棉花體內沒有表達。 然后在插入抗蟲基因的質粒中插入啟動子然后在插入抗蟲基因的質粒中插入啟動子( (抗抗蟲基因首端蟲基因首端) )，導入棉花受精卵，長成的棉花植株，導入棉花受精卵，長成的棉花植株還是沒有抗蟲能力。科學家又在有啟動子、抗蟲還是沒有抗蟲能力。科學家又在有啟動子、抗蟲基因的質粒中插入終止子基因的質粒中插入終止子( (抗蟲基因末端抗蟲基因末端) )，導入，導入棉花受精卵，結果成長的植株，有了抗蟲能力。棉花受精卵，結果成長的植株，有了抗蟲能力。 位于基因的首端位于基因的首端,是是RNA聚合酶結合位點聚合酶結合位點位于基因的末端位于基因的末端,終終止轉錄止轉錄檢測

9、目的基因是否導入受體細胞檢測目的基因是否導入受體細胞a、目的基因、目的基因b、啟動子、啟動子c、終止子、終止子d、標記基因、標記基因e、復制原點、復制原點它們有什么作用？它們有什么作用？DNA聚合酶結合位點聚合酶結合位點表達特定性狀表達特定性狀（2）利用PCR技術擴增目的基因PCR聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應 是一項生物是一項生物體外復制體外復制特定特定DNA片片段的核酸合成段的核酸合成技術技術。通過此技術，可。通過此技術，可獲取大量的目的基因。獲取大量的目的基因。（2）利用PCR技術擴增目的基因圖像解讀：引物：一小段可以和目的基因互補配對的脫氧核苷酸鏈模板DNA:含有目的基因的一段DNA片段

10、原料:四種脫氧核苷酸（dCTPdCTP、dATPdATP、dGTPdGTP、dTTPdTTP）Taq酶：具有熱穩定性的DNA聚合酶過程：分變性、退火、延伸三步驟變性變性退火退火延伸延伸模板DNAPCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點50引物1引物2DNA引物95PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72第1輪結束第2輪開始PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點955072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72第2輪結束

11、 過程：過程：a a、DNADNA變性（變性（90-9590-95）：雙鏈）：雙鏈DNADNA模板模板 在熱作用下，在熱作用下，_斷裂，形成斷裂，形成_b b、退火（、退火（復性復性55-6555-65）：系統溫度降低，引）：系統溫度降低，引 物與物與DNADNA模板結合，形成局部模板結合，形成局部_。 c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下進行酶的作用下進行延伸，合成與模板互補的延伸，合成與模板互補的_ _。 氫鍵氫鍵單鏈單鏈DNADNA雙鏈雙鏈DNADNA鏈鏈 概念：概念：PCRPCR全稱為全稱為_，是一項，是一項 在生物在生物_復制復制_的核酸合成技

12、術的核酸合成技術原理：原理：_條件：條件：_、 _、_ _ 、 _. _.前提條件：前提條件：方式：以方式：以_方式擴增，即方式擴增，即_ _（n n為擴增循為擴增循 環的次數）環的次數）結果：結果：聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應體外體外特定特定DNADNA片段片段DNADNA雙鏈復制雙鏈復制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸一對引物一對引物DNADNA聚合酶聚合酶指數指數2 2n n使目的基因的片段在短時間內成百萬倍地擴增使目的基因的片段在短時間內成百萬倍地擴增利用利用PCRPCR技術擴增目的基因技術擴增目的基因PCRPCR技術技術DNADNA復制復制過程過程

13、DNADNA變性（變性（90909595）退火退火（復性（復性55556060）子鏈延伸子鏈延伸（70707575）重復循環重復循環DNADNA復制起始，復制起始，解旋酶解旋解旋酶解旋邊邊解旋邊復制解旋邊復制子鏈與母鏈互相盤子鏈與母鏈互相盤繞繞形成完整的形成完整的DNADNA分子分子相同相同點點原則原則堿基互補配對堿基互補配對條件條件模板、原料（模板、原料（dCTPdCTP、dATPdATP、dGTPdGTP、dTTPdTTP）、能量、酶、引物等）、能量、酶、引物等不同不同點點解旋方解旋方式式氫鍵在高溫下斷裂，雙鏈全氫鍵在高溫下斷裂，雙鏈全部解開部解開解旋酶催化氫鍵逐步斷裂解旋酶催化氫鍵逐步斷

14、裂場所場所體外體外主要在細胞核中主要在細胞核中引物引物DNADNARNARNA酶酶熱穩定熱穩定DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq酶）酶）解旋酶、解旋酶、DNADNA聚合酶、聚合酶、DNADNA連接酶連接酶等等結果結果在短時間內形成大量的在短時間內形成大量的DNADNA片片段段形成完整的形成完整的DNADNA分子分子2 2、下列屬于獲取目的基因的方法的是、下列屬于獲取目的基因的方法的是( )( )利用利用mRNAmRNA反轉錄形成從基因組文庫中提取反轉錄形成從基因組文庫中提取從受體細胞中提取從受體細胞中提取 利用利用PCRPCR技術技術 利用利用DNADNA轉錄轉錄 人工合成人工合成A.A

15、. B. B. C. C. D. D.1 1、 在基因工程中，把選出的目的基在基因工程中，把選出的目的基因（共因（共10001000個脫氧核苷酸對，其中腺嘌嶺個脫氧核苷酸對，其中腺嘌嶺脫氧核苷酸是脫氧核苷酸是460460個）放入個）放入DNADNA擴增儀中擴擴增儀中擴增增4 4代，那么，在擴增儀中應放入胞嘧啶代，那么，在擴增儀中應放入胞嘧啶脫氧核苷酸的個數是（脫氧核苷酸的個數是（ ）個）個A. 540 B. 8100 C. 17280 D. 75603.細菌的質粒分子帶有一個抗菌素抗性基因，該抗細菌的質粒分子帶有一個抗菌素抗性基因，該抗性基因在基因工程中的主要作用是性基因在基因工程中的主要作用

16、是 A提高受體細胞在自然環境中的耐藥性提高受體細胞在自然環境中的耐藥性 B B有利于對目的基因是否導入進行檢測有利于對目的基因是否導入進行檢測C C增加質粒分子的分子量增加質粒分子的分子量D D便于與外源基因連接便于與外源基因連接4.4. 有關基因工程的敘述正確的是有關基因工程的敘述正確的是A A限制酶只在獲得目的基因時才用限制酶只在獲得目的基因時才用B B重組質粒的形成是在細胞內完成的重組質粒的形成是在細胞內完成的C C質粒都可作為運載體質粒都可作為運載體 D D蛋白質的結構可為合成目的基因提供資料蛋白質的結構可為合成目的基因提供資料5.哪項不是基因表達載體的組成部分哪項不是基因表達載體的組成部分( ) A.啟動子啟動子 B.終止密碼終止密碼 C.標記基因標記基因 D.目的基因目的基因6.6.已知某種限制酶在一線性已知某種限制酶在一線性DNADNA分子上有分子上有3 3個酶切位個酶切位點。如果該線性