1、RNAI和SIRNA轉染內 容第一部分第一部分 RNAi實驗基本概念實驗基本概念第二部分第二部分 RNAi實驗具體設計實驗具體設計第三部分第三部分 siRNA轉染過程相關問題及解答轉染過程相關問題及解答第一部分RNAI實驗基本概念主要內容1.RNAi的概念的概念2.RNAi的啟動途徑的啟動途徑3.非哺乳動物系統的非哺乳動物系統的RNAi實驗實驗4.哺乳動物系統的哺乳動物系統的RNAi實驗實驗5.RNAi效應表現效應表現1.RNAI的概念RNA干擾干擾(RNA interference)是雙鏈是雙鏈RNA（dsRNA)特異性地結合到與之序列互補的特異性地結合到與之序列互補的mRNA上，導致上，導

2、致mRNA降解，從而介導的轉錄降解，從而介導的轉錄水平基因表達抑制。水平基因表達抑制。2006年度諾貝爾生理學或醫學獎共同授予安德年度諾貝爾生理學或醫學獎共同授予安德魯魯菲爾和克雷格菲爾和克雷格梅洛梅洛，他們，他們發現了發現了“RNA干擾機干擾機制制雙鏈雙鏈RNA沉默基因沉默基因”。2.RNAI的啟動途徑(1) dsRNA途徑途徑(2) siRNA途徑途徑(3) shRNA表達載體途徑表達載體途徑(1) DSRNA途徑dsRNA:在非哺乳動物系統中，大于在非哺乳動物系統中，大于30bp的長的長雙鏈雙鏈RNA(dsRNA)進入細胞后，經過胞質內雙進入細胞后，經過胞質內雙鏈特異性核酸酶鏈特異性核酸

3、酶Dicer水解成水解成21-23bp的的siRNA，進一步導致進一步導致RNAi的發生。的發生。但在絕大多數哺乳動物系統中，超過但在絕大多數哺乳動物系統中，超過30bp的的dsRNA會引起細胞潛在的抗病毒機制（干擾素會引起細胞潛在的抗病毒機制（干擾素效應效應）降解）降解dsRNA。(2) SIRNA途徑小干擾小干擾RNA，長，長21-23bp，雙鏈。，雙鏈。作用機制：雙鏈的作用機制：雙鏈的siRNA解鏈并裝配入解鏈并裝配入RNA介介導導的的沉沉默默復合物復合物(RISC)，siRNA的反義鏈引導的反義鏈引導RISC與與mRNA分子互補結合，并降解分子互補結合，并降解mRNA，最終導致特定基因

4、表達的抑制。最終導致特定基因表達的抑制。(3) SHRNA表達載體途徑shRNA（short hairpin RNA）表達載體）表達載體在細在細胞內表達胞內表達shRNA后，在后，在Dicer作用下形成作用下形成siRNA分子，導致分子，導致RNAi的發生的發生。可能具有細胞毒性。可能具有細胞毒性。shRNA可能通過可能通過競爭競爭Exportin-5造成致命毒性造成致命毒性3.非哺乳動物系統的RNAI實驗如線蟲、果蠅如線蟲、果蠅等不涉及抗病毒免疫應答反應，等不涉及抗病毒免疫應答反應，可可通過與靶基因序列互補的長鏈通過與靶基因序列互補的長鏈dsRNA（通常（通常200bp）介導）介導RNAi的

5、發生的發生 。長鏈長鏈dsRNA通常可以通過體外轉錄獲得。通常可以通過體外轉錄獲得。長鏈長鏈dsRNA進入細胞后可被進入細胞后可被Dicer酶水解為多個酶水解為多個混合的混合的siRNA，敲除效果更好。，敲除效果更好。4.哺乳動物系統的RNAI實驗通過轉染通過轉染siRNA：通常在：通常在3-7天可以維持較高的基天可以維持較高的基因表達抑制效應，效應期的長短主要取決于因表達抑制效應，效應期的長短主要取決于細胞細胞的增殖速度的增殖速度和和siRNA的有效性的有效性。大部分。大部分RNAi實驗實驗可以在此時間段獲得結果，而且可以通過再次轉可以在此時間段獲得結果，而且可以通過再次轉染獲得超過染獲得超

6、過1周的基因表達抑制時間。周的基因表達抑制時間。通過轉染通過轉染shRNA表達載體，可以獲得超過表達載體，可以獲得超過2周的周的基因表達抑制時間，在長效基因表達抑制時間，在長效RNAi實驗時，選擇實驗時，選擇shRNA表達載體較為合適。表達載體較為合適。5.RNAI效應表現RNAi效應導致的靶基因下調可在效應導致的靶基因下調可在mRNA水平和水平和蛋白水平表現，也可能會在細胞形態等生理學蛋白水平表現，也可能會在細胞形態等生理學方面表現。方面表現。第二部分哺乳動物系統的RNAI實驗設計主要內容1. 需要短期抑制還是長效抑制需要短期抑制還是長效抑制?2. 采用采用siRNA進行實驗的途徑進行實驗的

7、途徑3. 構建構建shRNA表達載體進行實驗表達載體進行實驗4. siRNA設計需要注意的問題設計需要注意的問題5. 脫靶效應脫靶效應6. 轉染是轉染是RNAi實驗的瓶頸實驗的瓶頸1.需要短期抑制還是長效抑制?1周以內，采用周以內，采用siRNA較好，無需構建載體，節省較好，無需構建載體，節省時間，還可以采用時間，還可以采用2次轉染的方法，延長次轉染的方法，延長RNAi作作用的時間到用的時間到2周周。2周以上長效周以上長效RNAi實驗，采用實驗，采用shRNA表達載體較表達載體較好，效應持續時間長。好，效應持續時間長。2. 采用SIRNA進行實驗的途徑(1) 化學化學合成：首選的合成：首選的s

8、iRNA制備方法，最快、最制備方法，最快、最方便，成本高，適用于長期使用特定方便，成本高，適用于長期使用特定siRNA(2) 體外轉錄：費時，成本低，所需有效濃度低，體外轉錄：費時，成本低，所需有效濃度低，適用于大量篩選適用于大量篩選siRNASilencer siRNA Construction Kit（ThermoFisher）(3) Dicer/RNase酶解非哺乳動物系統的酶解非哺乳動物系統的RNAi三三種方法均可做熒光標記，可及時得知轉染效率種方法均可做熒光標記，可及時得知轉染效率3.構建SHRNA表達載體進行實驗需要構建相關質粒需要構建相關質粒可利用載體上的抗生素等標記篩選，做長效

9、表可利用載體上的抗生素等標記篩選，做長效表達達不能做熒光標記，無法直觀知道轉染效率不能做熒光標記，無法直觀知道轉染效率4.SIRNA設計需要注意的問題(1) siRNA序列設計序列設計(2) 陰性對照的作用陰性對照的作用(3) 陽性對照的重要性陽性對照的重要性(4) siRNA熒光標記的問題熒光標記的問題(1) SIRNA的設計理想的理想的siRNA序列是特異性強，抑制效率高。序列是特異性強，抑制效率高。可通過檢索相關基因的文獻報道序列，或者通過可通過檢索相關基因的文獻報道序列，或者通過在線設計軟件進行，一些技術力量較強的化學合在線設計軟件進行，一些技術力量較強的化學合成公司可提供免費設計。成

10、公司可提供免費設計。如果有可能，多設計幾條如果有可能，多設計幾條siRNA 序列，以篩選最序列，以篩選最特異、最有效的特異、最有效的siRNA序列。序列。(2) 陰性對照SIRNA的作用陰性對照陰性對照siRNA通常在進入細胞后不會引起任通常在進入細胞后不會引起任何基因表達的改變，從而反映出小分子何基因表達的改變，從而反映出小分子RNA片片段進入細胞后對基因表達的段進入細胞后對基因表達的非特異影響非特異影響。(3) 陽性對照SIRNA的重要性陽性對照陽性對照siRNA采用確認有效的采用確認有效的siRNA，針對，針對某些較容易檢測基因，如甘油醛某些較容易檢測基因，如甘油醛3-磷酸脫氫磷酸脫氫酶

11、（酶（GAPDH）基因；）基因；用于確認用于確認RNAi實驗過程的有效性實驗過程的有效性，包括轉染條，包括轉染條件、檢測方法是否可行等；件、檢測方法是否可行等；陽性對照陽性對照siRNA在在RNAi實驗初期或在新的轉染實驗初期或在新的轉染體系進行體系進行RNAi實驗時很重要，容易被忽視，缺實驗時很重要，容易被忽視，缺乏陽性對照乏陽性對照siRNA，實驗出問題無法找原因，實驗出問題無法找原因，耽誤時間。耽誤時間。(4) SIRNA熒光標記的問題采用熒光標記的采用熒光標記的siRNA可以用來確定轉染效率可以用來確定轉染效率和優化轉染條件，這種方法操作快速，實驗費和優化轉染條件，這種方法操作快速，實

12、驗費用也不高，但由于熒光標記的用也不高，但由于熒光標記的siRNA攝入與攝入與siRNA導致的抑制效果時常會出現不相關性，導致的抑制效果時常會出現不相關性，這種情況在某些細胞系和應用某些轉染試劑時，這種情況在某些細胞系和應用某些轉染試劑時，如脂質體時更為嚴重。因此在應用脂質體轉染如脂質體時更為嚴重。因此在應用脂質體轉染試劑優化轉染條件時，不推薦使用熒光標記的試劑優化轉染條件時，不推薦使用熒光標記的siRNA。5.RNAI OFF-TARGET(脫靶效應)(1) 什么是什么是RNAi Off-target(脫靶效應脫靶效應)?(2) 脫靶效應如何檢測？脫靶效應如何檢測？(3) siRNA濃度是否

13、和脫靶效應相關？濃度是否和脫靶效應相關？(4) 轉染試劑是否也會造成脫靶效應？轉染試劑是否也會造成脫靶效應？(5) 如何避免脫靶效應？如何避免脫靶效應？(1) RNAI OFF-TARGET(脫靶效應)是什么？RNAi Off-target(脫靶效應脫靶效應)：簡單地說，就是：簡單地說，就是siRNA轉染中的非特異反應轉染中的非特異反應，這不僅包括，這不僅包括siRNA序列，還包括轉染試劑本身或其他相關序列，還包括轉染試劑本身或其他相關因素對轉染細胞的其他相關基因發生非特異性因素對轉染細胞的其他相關基因發生非特異性的表達變化，從而導致假陽性和假陰性。目前的表達變化，從而導致假陽性和假陰性。目前

14、已廣泛引起研究者重視。已廣泛引起研究者重視。(2) 脫靶效應如何檢測？多種方法可以用于預測和檢測脫靶效應，最常多種方法可以用于預測和檢測脫靶效應，最常見的方法是基因表達譜芯片的方法。見的方法是基因表達譜芯片的方法。(3) SIRNA濃度是否和脫靶效應相關？以前認為高濃度會產生脫靶效應，實際上低濃以前認為高濃度會產生脫靶效應，實際上低濃度同樣會產生脫靶效應。度同樣會產生脫靶效應。(4) 轉染試劑是否也會造成脫靶效應？有人采用基因芯片檢測對轉染試劑造成的細胞有人采用基因芯片檢測對轉染試劑造成的細胞基因表達影響發現，某脂質體基因表達影響發現，某脂質體L2K可以引發可以引發1908個基因的表達變化，既

15、包括下調，也包括個基因的表達變化，既包括下調，也包括上調。上調。如果恰好轉染試劑本身會導致某基因表如果恰好轉染試劑本身會導致某基因表達上調，可能出現轉染達上調，可能出現轉染siRNA后該基因可能會后該基因可能會出現表達不變甚至增強的現象出現表達不變甚至增強的現象，從而出現假陰，從而出現假陰性現象，如果恰好轉染試劑本身會導致某基因性現象，如果恰好轉染試劑本身會導致某基因表達下調，則會出現假陽性現象。表達下調，則會出現假陽性現象。(5) 如何避免脫靶效應？脫靶效應并不能絕對避免，但可以采取措施減脫靶效應并不能絕對避免，但可以采取措施減少脫靶效應的發生，如針對同一靶基因設計少脫靶效應的發生，如針對同

16、一靶基因設計2條條以上抑制效率在以上抑制效率在70以上的以上的不同不同siRNA序列，序列，分別進行實驗分別進行實驗，可避免，可避免siRNA造成的脫靶效應；造成的脫靶效應；采用采用不同轉染試劑不同轉染試劑進行實驗可避免轉染試劑造進行實驗可避免轉染試劑造成的脫靶效應等。成的脫靶效應等。6.轉染是RNAI實驗的瓶頸轉染轉染是是siRNA實驗的瓶頸，轉染質量的好壞直實驗的瓶頸，轉染質量的好壞直接關系接關系RNAi實驗的成敗。實驗的成敗。(1) 選擇轉染方法的原則選擇轉染方法的原則(2) siRNA轉染的方法轉染的方法(3) siRNA轉染試劑的主要種類轉染試劑的主要種類(4) 脂質體脂質體(5)

17、非脂質體聚合物類非脂質體聚合物類(1) 選擇轉染方法的原則高轉染效率高轉染效率：較高的轉染效率可以取得更好的抑制效果，：較高的轉染效率可以取得更好的抑制效果，更有利于實驗結果的觀察；更有利于實驗結果的觀察；低細胞毒性低細胞毒性：因為：因為RNAi是抑制性實驗，轉染試劑的毒性是抑制性實驗，轉染試劑的毒性多導致細胞凋亡等結果，這種結果是對細胞正常生理功能多導致細胞凋亡等結果，這種結果是對細胞正常生理功能嚴重干擾（主要表現為抑制），細胞無法進行正常轉錄表嚴重干擾（主要表現為抑制），細胞無法進行正常轉錄表達而出現凋亡。轉染試劑的毒性不僅干擾細胞正常的生理達而出現凋亡。轉染試劑的毒性不僅干擾細胞正常的生

18、理狀態，甚至還可能影響實驗結果；狀態，甚至還可能影響實驗結果；方法簡單、操作簡單方法簡單、操作簡單：越簡單，操作越少的實驗過程，自：越簡單，操作越少的實驗過程，自然出錯的機會就少，重復性就好，工作量也少；然出錯的機會就少，重復性就好，工作量也少；成本較低成本較低：由于：由于siRNA轉染需要篩選有效的轉染需要篩選有效的siRNA，有效，有效siRNA后續大量研究還需要不斷進行后續大量研究還需要不斷進行siRNA轉染，轉染，siRNA轉染的成本尤其是轉染試劑的成本在實驗開始之初就需要轉染的成本尤其是轉染試劑的成本在實驗開始之初就需要充分考慮。充分考慮。(2) SIRNA轉染的方法到目前為止，轉染

19、的方法主要采用化學方法，到目前為止，轉染的方法主要采用化學方法，化學方法不能轉染的采用電轉化等物理方法。化學方法不能轉染的采用電轉化等物理方法。(3) SIRNA轉染試劑的主要種類脂質體類脂質體類非脂質體聚合物類非脂質體聚合物類(4) 脂質體開發較早，主要針對轉染質粒開發較早，主要針對轉染質粒DNA等大分子開發，等大分子開發，現在也被改良用于現在也被改良用于siRNA的轉染；的轉染；適合適合siRNA與質粒的共轉以及一些對毒性要求不與質粒的共轉以及一些對毒性要求不高的高的siRNA轉染；轉染；代表產品有代表產品有invitrogen公司的公司的lipofectamineTM 2000/3000

20、和和RNAiMAX。(5) 非脂質體聚合物類為克服脂質體轉染試劑的毒性，并提高轉染為克服脂質體轉染試劑的毒性，并提高轉染效率，效率，現在已從現在已從高分子聚合物高分子聚合物類轉染試劑發展類轉染試劑發展到納米到納米聚合物類轉染試劑。聚合物類轉染試劑。代表產品有：代表產品有：Merck公司的公司的NanoJuice Transfection Kit（Caco-2）；）；Qiagen公司的公司的HiperFect；Clontech公司的公司的XfectTM；Micropoly公司的公司的Micropoly-transfecterTM cell reagent；Engreen Biosystem公司公

21、司的的EntransterTM-R等。等。第三部分SIRNA轉染過程相關問題及解答1.siRNA轉染過程相關問題轉染過程相關問題2.siRNA轉染疑問解答轉染疑問解答1.SIRNA轉染過程相關問題(1) 轉染細胞數量的問題轉染細胞數量的問題(2) 轉染時轉染時siRNA工作濃度工作濃度(3) 轉染時血清的問題轉染時血清的問題(4) 轉染時抗生素的問題轉染時抗生素的問題(5) 轉染過程轉染過程(6) 轉染后換液的問題轉染后換液的問題(7) 轉染條件優化的問題轉染條件優化的問題(8) RNAi效應檢測方法效應檢測方法(1) 轉染細胞數量的問題細胞數量：以轉染時，細胞的匯合度在細胞數量：以轉染時，細

22、胞的匯合度在20-40為宜，這個匯合度比通常為宜，這個匯合度比通常DNA轉染的匯合度要小，轉染的匯合度要小，這是因為轉染后需要培養的時間通常比這是因為轉染后需要培養的時間通常比DNA轉染轉染的時間要長，同時較低的細胞數量也有利于提高的時間要長，同時較低的細胞數量也有利于提高抑制效率。抑制效率。需要注意的是：轉染時細胞的匯合度（細胞數量）需要注意的是：轉染時細胞的匯合度（細胞數量）會對會對RNAi結果產生一定的影響。一些轉染試劑，結果產生一定的影響。一些轉染試劑，如脂質體，需要的匯合度會高一些，這是為了減如脂質體，需要的匯合度會高一些，這是為了減輕轉染試劑的毒性，一般來說，輕轉染試劑的毒性，一般

23、來說，細胞數量較少更細胞數量較少更能提高抑制效率能提高抑制效率。(2) 轉染時SIRNA工作濃度siRNA濃度：需要根據具體的實驗進行相關的優化。過低濃度：需要根據具體的實驗進行相關的優化。過低的的siRNA濃度達不到相應的抑制效果，過高的濃度達不到相應的抑制效果，過高的siRNA濃度濃度可能會引起一些非特異的改變。需要注意的是這里可能會引起一些非特異的改變。需要注意的是這里siRNA濃度指濃度指siRNA在反應時的終濃度，也就是以轉染時細胞的在反應時的終濃度，也就是以轉染時細胞的總體積來計算的。總體積來計算的。一般一般siRNA的有效反應濃度在的有效反應濃度在10nM-200nM，選擇最低有

24、效濃度，選擇最低有效濃度。需要注意的是：需要注意的是：siRNA的分子量，對的分子量，對21nt雙鏈雙鏈siRNA oligo來說，平均分子量約為來說，平均分子量約為13300g/mol，合成，合成siRNA其其OD值和值和nmol換算關系由于換算關系由于OD值受產物中其他成分影響，值受產物中其他成分影響，如熒光標記、純度等，具體請詢問合成公司，一般如熒光標記、純度等，具體請詢問合成公司，一般1OD duplex2.5-5 nmols33-66 ug。 (3) 轉染時血清的問題一些轉染試劑要求在轉染前換無血清培養基，轉一些轉染試劑要求在轉染前換無血清培養基，轉染后染后4-6h再更換成有血清培養

25、基，這其實是為了再更換成有血清培養基，這其實是為了減輕轉染造成的細胞毒性減輕轉染造成的細胞毒性。現在較好。現在較好的轉染的轉染試劑試劑也能在血清存在下轉染。也能在血清存在下轉染。(4) 轉染時抗生素的問題一些轉染試劑，如脂質體，需要在轉染時采用無一些轉染試劑，如脂質體，需要在轉染時采用無抗生素培養基，這是由于抗生素培養基，這是由于脂質體轉染會同時將培脂質體轉染會同時將培養基的一些成份包括抗生素也帶進細胞，造成細養基的一些成份包括抗生素也帶進細胞，造成細胞毒性胞毒性。現在。現在較好較好的轉染的轉染試劑也不要求去除抗生試劑也不要求去除抗生素。素。(5) 轉染過程轉染過程：轉染的過程其實很簡單。一般是分轉染過程：轉染的過程其實很簡單。一般是分別稀釋轉染試劑和別稀釋轉染試劑和siRNA，然后二者混合，滴，然后二者混合，滴加到細胞表面，然后細胞繼續培養。這點根據加到細胞表面，然后細胞繼續培養。這點根據不同轉染試劑的不同轉染試劑的Protocol操作即可。操作即可。(6) 轉染后換液的問題一些轉染試劑要求在轉染后一些轉染試劑要求在轉染后4-6h換液，其目的就換液，其