1、Western Blot 原理和操作方法（詳細）$5V工作原理Y|-_2IU蛋白質的電泳分離是重要的生物化學分離純化技術之一,電泳是指帶電粒子在電場作用下,向著與其電荷相反的電極移動的現象.根據所采用的支持物不同,有瓊脂糖凝膠電泳,淀粉凝膠電泳,聚丙烯酰胺凝膠電泳等.其中,聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)由于無電滲作用,樣品用量少(1-100g),分辨率高,可檢出10-9-10-12mol的樣品,凝膠機械強度大,重復性好以及可以通過調節單體濃度或單體與交聯劑的比例而得到孔徑不同的凝膠等優點而受到廣泛的應用.-O?Q%9vSDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白質的電泳方式,特別是用于蛋白質純度檢測

2、和測定蛋白質分子量. &A另外樣品處理液中也可加入適量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加樣時樣品溶液可以沉入樣品加樣槽底部.T&ZpP_重要參數(iLo=fd78聚丙烯酰胺凝膠(PAG)制備原則:由于孔徑的大小取決于單體和雙體丙烯酰胺在凝膠中的總濃度(T)以及雙體占總濃度的百分含量即交聯度(C)決定的,因而制膠之前必須首先知道這兩個參數.一般可以由下述公式計算:2l# 6T%=(a+b)/m*100%; 和 C%=a/(a+b)*100%&*xjs其中: a=雙體(bis)的重量 ;b=單體(arc)的重量 ;m=溶液的體積(ml)uUo!kl HL0#p36e當分析一個未知樣品時,常常先用7.

3、5%的標準凝膠制成4-10的梯度凝膠進行試驗,以便選擇理想的膠濃度.如果蛋白質的分子量已知,可參考下表選擇所需凝膠濃度:RKB6&r5k2OJxLmEc蛋白質分子量范圍(Da) 適宜的凝膠濃度(%)rQ9+x6104 20-30(pga1104-4104 15-20tuv7?0:F4104-1105 10-15ywj 5105 2-5LpS)D: xN_#28fOo分離膠:N% k4電泳凝膠濃度hR7z|dx*試劑 10% 12% 15% 10% 12% 15%G9,r$EH2O(ml) 4.0 3.3 2.3 5.9 4.9 3.4zHVI2 w30%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml

4、) 3.3 4.0 5.0 5.0 6.0 7.5ngl88w1.5mol/lTris.cl(PH8.8) (ml) 2.5 2.5 2.5 3.8 3.8 3.8Dj3*=510%SDS(ml) 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.155 HHU.kmp10%AP(ml) 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.15t9tNkiTEMED(l) 4 4 4 6 6 6TA.xIK9O*總體積(ml) 10 15%1KSKCAGVzr濃縮膠z!bT*E Q.總體積(ml) 6 30d,F0,=v,#N*RNP蛋白質的樣品制備：FqeRI$P蛋白質的樣品制備是Western

5、Blotting的第一步，樣品制備是關鍵步驟，要求盡可能的獲得所有蛋白質，應注意以下問題：Fg8 q1：在合適的鹽濃度下，應保持蛋白質的最大溶解性和可重復性。5pQb8TH%2：選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價結合的蛋白質復合物和共價鍵二硫鍵，使其形成一個各自多肽的溶液。t n84：防止蛋白質在樣品處理過程中的人為的修飾，制備過程應在低溫下進行，以避免細胞破碎釋放出的各種酶類的修飾（建議加入合適的蛋白酶抑制劑）SxPvLa5：樣品建議分裝成合適的量，然后冷凍干燥或直接以液體狀態置-80中保存，但要注意不要反復凍融。iZm. XQL二：需要的溶液：cGKLdZ裂解液 Laemmli樣

6、品緩沖液0TGJD$ 5|O三：操作步驟：u:,O|a71)培養細胞蛋白質樣品的制備：Go-Wc21：胰酶酶解后裂解：/%+r0uE細胞培養至80%左右密度時，以含0.05%胰蛋白酶消化，細胞經預冷的PBS漂洗3次，離心收集在離心管中，加入450l裂解液反復吹打。i2g_4 D2：皿上直接裂解：X(tt?EiBW細胞培養至80%左右密度時，細胞經預冷的PBS漂洗3次，加入450l裂解液，細胞刮刀收集，用移液器轉移至離心管中，反復吹打。8U/$Ce2以上所得的樣品最終用超聲細胞破碎儀超聲處理，超聲時為5S，間歇時間為10S，功率為100-120W至溶液清澈無粘稠為止，處理過程在水浴中進行，后42

7、5000g離心1小時取上清或以最大強度超聲4次，每次15-30S，在每次超聲步驟之間將樣品轉置水浴中15S，加入Laemmli 樣品緩沖液（視蛋白樣品濃度，以1：1或1：2的比例混合），強力混勻，樣品置100水浴箱里水浴加熱3-5分鐘，10000g離心10分鐘，取出清液，將其移入另一潔凈試管中，至此，電泳樣品已準備就緒。（樣品可立即使用也可以分裝凍存，-20存放的樣品可穩定保持數月）QY2)組織樣品的制備：cer.$VW手術切除的組織塊迅速置于預冷的0.95生理鹽水中，漂洗數次，以清潔表面的血跡，將組織稱量后切成幾個較小的組織塊放入機戒組織勻漿器中，按組織凈重，裂解液=1：10的比例，加入相應

8、體積的裂解液進行勻漿，離心收集上清（如有粘稠物可超聲處理，具體方法見細胞培養的樣品制備，也可以冷凍干燥降解核酸后，將凍干的蛋白質樣品溶解在適當的上樣 buffer中，混勻后靜置3小時使樣品中的蛋白質充分的溶解，有5分鐘即可，4度離心收集。）加入Laemmli樣品緩沖液（視蛋白樣品濃度，以1：1或1：2的比例混合）強力混勻，樣品置100度的水浴箱水浴加熱3-5分鐘，10000g離心10分鐘，取上清液，將其轉入另一潔凈的試管中，至此，電泳樣品已準備就緒（樣品即可立即使用也可也可以分裝凍存，-20存放的樣品可穩定保持數月。）=KDbWt#mLqr5附：SKe2x 0一：裂解液的制備：vV|Yw1組織

9、裂解液（全細胞蛋提取）：1：Tris-HCL 50mmoL/L PH 7.4!: 1fL56： PMSF 1 mmoL/LgoG:W7： Aprotinin 1g/mlyCxV68: leupeptin 1g/mlzkCJTa#pt9: pepstain 1g/ml79 f|k=其中:7,8,9作用不持久，要使用前加入。#Gl6dajdj50 mmoL/L Tris(PH8.0)IJquXhc2：RIPA裂解體系：150 mmoL/L NaclIOosZZ+51.0%NP-40或Triton-x-100fh? 6+0.5%脫氧膽酸鈉(ca1 &B9V0.1%SDS_&;)YBBP50 mmoL

10、/L Tris( ph8.0)r xbL4z!%Pfoep二：Laemmli 樣品緩沖液配置（1*SDS樣品緩沖液）bohCEK50 mmoL/L Tris-HCL （PH8.0）WTw8F100 mmoL/L DTTBGDu.K2% SDS,nh?60.1% 溴酚藍9v,hI ?G010% 甘油qBq!oV此液可以配置成不同的儲存液，根據蛋白濃度而定，40C長期保存，用時臨時與蛋白液按比例混合，其中DTT應臨時加入，以防降解。NBf8蛋白質定量Vj/ 76Ab=,?WA.D1)Bradford法:e0z.9SB檢測原理: Bradford與蛋白質四級結構,特殊氨基酸結合,由棕色變成藍色,59

11、5nm檢測.該方法用于大多數蛋白質的定量是比較精確的,但不使用于小分子堿性多肽的定量,如核糖核酸酶或溶菌酶,去污劑的濃度超過0.2%影響測定結果,如TritonX-100,SDS,NP-40等.n I$k5GBradford法濃染液的配制:將100mg考馬斯亮藍G-250溶于50ml 95%乙醇,加入100ml濃磷酸;然后,用蒸餾水補充至200ml;此染液放4至少6個月保持穩定. ;_,(h5標準曲線蛋白質樣本的制備:盡量使用與待測樣本性質相近的蛋白質作為標準品,例如測定抗體,可用純化的抗體作為標準,如果待測樣品是未知的,也可用抗體作為標準蛋白,通常在20g -150g/100l之間繪制標準曲

12、線.e&6+r&將待測樣本溶于100l緩沖溶液中,該緩沖溶液相同(最好用PBS)Xxn:nB按照1:5用水稀釋濃燃料結合溶液,如果出現沉淀,過濾除去.(&%+qa每個樣品家5ml稀釋的燃料結合溶液,作用5-30分鐘,燃料與蛋白結合,將由紅色變為蘭色,在595nm波長下測定其吸光度,注意顯色反應不超過30分鐘.c)H($?+首先,將20g碳酸鈉溶于500ml水中;再將1g CuSO4.5H2O和2g酒石酸鈉溶于500ml蒸餾水中;將銅/酒石酸鈉溶液放在磁力攪拌器上攪拌緩緩加碳酸鈉溶液,儲存于冰箱中,可穩定保存1年以上.Folin-ciocalteu酚試劑? u5dyr按體積比1:2:1將銅/酒石

13、酸/碳酸鈉,5%SDS和0.8mmol/l NaOH溶液混合,室溫下儲藏,可穩定保存2周,標明為試劑Ae 9P#r按體積比1:5將Folin-ciocalteu酚試劑和H2O混合,室溫下儲存于琥珀色試劑瓶中,可穩定保存1個月,表明為時機B-hF:Wb%用蒸餾水將樣本(5-100g)稀釋為1ml,并準備100,50,25,12.5g /ml,4個濃度的BSA作為標準蛋白.2dp8UP每個蛋白樣品家1.0ml試劑A,混合均勻,在室溫下孵育10分鐘.42wwNS加入0.5 ml試劑B并立即混合, 在室溫下孵育30分鐘.0X+BV-在750nm光波長下測定吸光度;根據標準曲線計算樣本蛋白質的濃度.J

14、cgc:7#Jw23)紫外分光光度法:MH43Rw4檢測原理:是因蛋白質樣品在280nm波長下有最大吸光率,最大吸光率主要取決于酪氨酸和色氨酸的存在.zfUbIjjSZ純化蛋白質濃度的測定:在280nm波長下讀取與適當對照相比較的吸光值.tN)(pmRb對于抗體和BSA,可按照下述標準計算其濃度,對其他蛋白質粗略地估計:1單位吸光值相當于1mg/mlLvrW%(zc蛋白質 A280(1mg/ml)yM|QcIgG 1.35=tdj電泳裝置（垂直板電泳槽）為北京六一儀器廠生產的DYCZ-24D型電泳裝置。fY v5RT電泳儀（電源）為北京六一儀器廠生產的DYY-8B型。&)#AbT振蕩器7fvk

15、KL-I-Oac$2）試劑l/,MJ(丙烯酰胺（電泳級）Y) w_|N,N-甲叉雙丙烯酰胺（bis）cDid;SDS9w* pKTEMED-,?N=XZTrisvJfH9j過硫酸銨8k4Ket)-巰基乙醇或DTT1T/f6$YNc甘油 moDVP7x甘氨酸KWg7#a溴酚藍rb&p*b(11)鹽酸Rx6 CH5:gkGr3）聚膠前準備：k&s%?配制凝膠儲液： T%=30% C%=1% arc:bis=29:1過濾后4避光保存。B:4 bl-配制濃縮膠緩沖液： 1.0mol/L TrisHCl Ph6.8, 過濾后4避光保存。?8 8SAt配制分離膠緩沖液： 1.5mol/L TrisHCl

16、Ph8.8, 過濾后4避光保存。B*jM.U配制10%SDSDa/ewvo配制10%過硫酸銨（AP）DXNgAxTEMED原溶液0,FQ*電泳緩沖液（5）：Tris 15g+甘氨酸72g+SDS 5g+H2O至1L,臨用時稀釋5倍至1SDS電泳緩沖液加入電泳槽中。;oAsf(g6&i.8)染色和脫色f=tdsY電泳完畢需通過染色和脫色評定其結果的優劣.對凝膠中分離成不同條帶的蛋白進行檢測.此外,根據不同的研究目的,也可將凝膠電印跡f:p:sj2TT考馬斯亮藍染色:將凝膠取出放入培養皿中到如少量的染色液,以浸沒凝膠為宜,在搖床上震蕩,直到凝膠上出現明顯的條帶為止,一般5-6小時或者4過夜;然后傾

17、去染色液，用脫色液洗滌震蕩,其間要不斷換脫色液,直至脫色液顏色稍清亮.,凝膠背景清楚為止.+ kE3+染色液配制:YV(ZCm/90ml甲醇和H20混合溶液(甲醇:水=1:1,V/V)和10ml冰乙酸的混合溶液中溶解0.25g考馬斯亮藍R250用濾紙過濾染液以除去顆粒不溶性物質.;Y8LGY脫色液的配制: j/q(8?90mL(甲醇):H20(1:1 V/V)和10ml冰乙酸溶液.pkP,E?YeD .bYD附：yF4qnDX一、蛋白標準品的選擇 zvacL凝膠電泳中一個關鍵的指示系統，即蛋白標準品（Molecular Weight Marker），電泳的分離效率，轉膜效率以及電泳泳動情況等，

18、皆需通過蛋白標準品來顯示，目前普遍采用的幾種蛋白標準品有：p 5M te9/(Cg5 *y Blue RangerTM prestained protein Molecular Weight Marker Mixo=K|ju Trichrom RangerTM prestained protein Molecular Weight Marker#vCBWRMixGZOw$E My7以上兩種Marker均為PIERCE公司的產品，貨號為：prod# 26681; prod# 26691;該標準蛋白不需染色，在電泳凝膠中隨著蛋白質的遷移，各種分子質量的標準蛋白逐漸分開，而顯示出非常漂亮的多色條帶，

19、可通過電泳槽直接肉眼觀察各電泳帶的凝膠中的泳動情況，當相對于目的蛋白大小的標準蛋白與相鄰兩條標準蛋白達到所需分辨距離時，即可停止電泳，取出凝膠做進一步的轉膜工作。i#76ex Chemiluminescent BlueRangerR peroxidase-Labled protein0.s?0MKMolecular Weight Marker Mix( SC oe+以上也為PIERCE產品，貨號為：prod# 26651，該標準蛋白同上也具有以上作用外，同時在使用化學發光時，和樣品一起顯色經膠片曝光后，在膠片上可出現漂亮的條帶。p7m?ugvs?&Q293V Blotinylated SDS

20、Molecular Weight Marker Mix&c%IP以上為Sigma公司產品，貨號為B2787,作用效果同Leo8+%NBp2h.Z二、對照的設置yae$bHAV一般需要設立:ej%mMv&內參照, 提示系統的穩定性,一般是一些管家蛋白cP?h*5S陽性對照, 即肯定可以表達你的目的蛋白的組織或者細胞,同時可以提示你一抗的質量/04 陰性對照: 即肯定不會表達你的目的蛋白的組織或者細胞.在實驗中r|hJ&根據你的需要選擇r &PP!D免疫印跡Tz7KSiT+蛋白質印跡法是將蛋白質混合樣品經SDS-PAGE后,分離為不同條帶,其中含有能與特異性抗體(或McAb)相應的待檢測的蛋白質(

21、抗原蛋白),將PAGE膠上的蛋白條帶轉移到NC膜上此過程稱為blotting,以利于隨后的檢測能夠的進行,隨后,將NC膜與抗血清一起孵育,使第一抗體與待檢的抗原決定簇結合(特異大蛋白條帶),再與酶標的第二抗體反應,即檢測樣品的待測抗原并可對其定量.W4paf一、 設備和材料G4g?QM轉移電泳槽和轉移電泳儀(電源)+ #-震蕩器xzG#XV冰箱GZ= 7XKL(濾紙Ls_k-3#NC膜a p X膠片;&aXp2rnys暗室Npx+ MC二、 試劑dyQ% 7yN(#顯影液u s定影液GgNBS)三、 試劑的配制;wD-s,R?Y封閉液: 5g的脫脂牛奶+100ml的TBS-Tv*s.0y k漂

22、洗液(TBS-T): 0.01M TBS-T為Tris 1.21g+ NaCl5.84g+800ml H2O用HCl調節PH到7.5,假如0.05%或者0.1%Tween-20用H2O定溶至1000ml$ +/ 7:轉印緩沖液: 同5SDS電泳緩沖液,不含SDS,如果采用PVD干膜或NC膜加20%甲醇,不加甲醇也可以YoT&E*Tris 15g+甘氨酸72g加水定容到1000ml,一般不需調節PH值 ,用時稀釋5倍到1轉印緩沖液.riJkh3sso顯影液：H2O-750mlj ,J$?米土爾-3gu-%OLo4D無水亞硫酸鈉-100gp+TiY對苯二酚-3gsoGFHUW溴化鉀-3gehvIR

23、BvmS無水碳酸鈉：先加5gPH10.0不夠時再加5gh(6k)Ir注：以上配定加H2o定容至1000mlU X&A定影液：起始水溫：60 H2o 700ml_cXcA硫代硫酸鈉：240gd ? /無水亞硫酸鈉：25gJ =v!)ix冰醋酸：48ml* rS(%oSq2. 將NC膜和濾紙切出與凝膠一樣大小，置轉移緩沖液中濕潤5-10min.OWl_; _y:e3. 按照以下順序放置濾紙，凝膠和NC膜到半干槽中。G%_KDs-wf)Hl%jT% gr|o4. 每層之間的氣泡要全部去除。可以用10ml吸管輕輕在上一層滾動去除氣泡，然后用一絕緣的塑料片中間挖空與凝膠一樣大小或略小一點，以防電流直接從

24、沒有凝膠處通過造成短路，蓋好加上陽極電極板。lUGBjp PS81&二濕式電轉印,+z4v0-1. Tris/甘氨酸-SDS-PAGE結束后，取出凝膠，在Tris/甘氨酸緩沖液中漂洗數秒。取出凝膠方法同半干式電轉印。p;u /neX_hl#2V1)麗春紅溶液的配制:$SB| 2b(O儲存液(10)： 0.1g麗春紅溶于5ml冰乙酸,加入H2O定容至100ml,臨用前稀釋10倍為應用液.9| IY1uX/S$ ftVA2)操作步驟|B7nn$轉印結束后取出印跡膜至于麗春紅S應用液中,并在室溫下攪動5-10分鐘Q/DDJ)rx將膜放入PBS洗數次,每次1-2分鐘,并且更換PBS#jF=Yj根據需要

25、將轉印部位和分子量標準位置進行標記eZl3kfg至此膜可以用于封閉和加入抗體far y1x ?5? /六、膜的封閉kcog(Sd 5M在進行抗體雜交之前，需要先對轉印膜進行封閉，以防止免疫試劑的非特異性吸附。封閉一般采用異源性蛋白質或去污劑，常用的有0.2%Tween-20，20%BSA，10%馬血清以及5% No-fat milk等，至于選擇哪一類封閉液，首先應考慮與檢測試劑相適應，如采用葡萄球蛋白A（SPA）作用檢測試劑，就不能用全血清封閉，其次是盡可能使非特異著色背靜淺，封閉液以20%BSA效果較好，其次是5%N-fat milk.=yW8NQca封閉過程：xtUTOV1) 洗轉印膜：室

26、溫漂洗3次x10min,以盡量洗去轉印膜上的SDS，防止影響后面的抗體結合。PjKSX0+k2) 取漂洗的轉印膜，放入5% No-fat milk的封閉液內，搖床震動，室溫封閉2h，也可在4度過夜。AGjRc3) 用1xTBS-T ，PH7.6洗液，室溫漂洗3次x10min.tAxdtBuf#q2Bv:七、抗體雜交8 OJ_Ei抗體表面主要采用間接法。即先加入未標記特異性抗體（Ab1）與膜上抗原結合，再加入標記的抗抗體（Ab2）進行雜交檢測，標記Ab2 物質有放射性核素，酶，以及生物素等。;gq5M,=$雜交過程：I?3/d,z）封閉后的雜交膜放入雜交袋中，加入抗體稀釋液稀釋的Ab1濃度為1u

27、g/ml，封口，4孵育過夜或室溫（22-25）搖動孵育2h.H0$q0h） 液洗膜3次x10min(Bv15）標記的Ab2（羊抗兔-HRP）室溫1h，洗膜3x10minGYD&xJ-8 6+)2/八、檢測|#Y2sM根據標記Ab2的標記物不同,其雜交的結果檢測方法也不同,較常用的檢測系統有HRP標記 Ab2的的增強化學發光(ECL)和DAB檢測系統.?NSZiM1) 辣根過氧化物酶-DAB法:?KIXDAB顯色液的配制:按照1mlH2O加顯色劑A,B,C各1滴,混勻.b5irtE=Y顯色:將適量DAB顯色液平鋪在Ab2雜交后的印跡膜上,室溫放置觀察,可出現明顯的棕褐色蛋白顯色帶kzUMyY9R

28、K終止:用Tris-HCl緩沖液或水漂洗雜交膜即可終止反應.HAn2) 辣根過氧化物酶-ECL法:jB BZR#增強化學發光(ECL)檢測是利用辣根過氧化物酶催化化學發光物質,生成一種不穩定的中間物質,其衰變時在暗室內形成明顯的肉眼可見的化學發光帶,利用X線膠片感光原理,將結果記錄下來:hxn24=+ECM顯色劑配制:按mlH2O加顯色劑A、B各1滴,混勻.Rp&To=Yy6D在暗室將雜交后印跡膜放入顯色盒中,加上混合好的顯色液,月1-5分鐘$O,+DGj)用紙巾吸去印跡膜邊緣或者邊角部分多余的顯色液,將一透明的玻璃紙蓋住撫平,并確定干的表面與膠片接觸.-Qrm)prw將印跡膜在暗室中使膠片暴光1-5分鐘,沖洗膠片以確定所測抗原的正確暴光時間,暴光時間可短至幾秒也可以長到數小時.8y 7XG沖洗膠片步驟:先在顯影液中