1、紅細胞凝集及紅細胞凝集抑制試驗流感病毒表面的血凝素（HA）蛋白，含有識別和結合宿主細胞表面受體的結構，能使一些特定的紅細胞發生凝集現象。當紅細胞和病毒按適當的比例混合后，由于病毒的作用使紅細胞發生凝集，此為凝集現象。含有特異的抗流感病毒HA蛋白的抗血清，能抑制紅細胞凝集現象的出現，即抗體與病毒結合后，可以使血凝素不能吸附于紅細胞表面的受體上，此為紅細胞凝集抑制（HAI）。微量紅細胞凝集抑制試驗是目前最常用的一種鑒定流感病毒型/亞型及分析流感病毒HA抗原性變異的試驗方法，也可以用于對一般人群抗體水平的檢測和疫苗效果的評價等方面。用于HAI試驗的標準參照血清必須及時更新，用于鑒定流感病毒型/亞型應

2、包括當年的國際疫苗株或國內流行代表株的抗血清，可以用羊、雞、雪貂、兔等實驗動物的抗血清；用于抗原分析的抗血清建議包括同一型別和亞型不同毒株免疫的標準參考抗血清，由于用雪貂制備的抗流感病毒血清特異性高，易將不同毒株間抗原性差異顯示出來，因此常用免疫雪貂的抗血清進行抗原分析。HAI試驗中所用的血清必須經特殊處理以去除非特異性抑制素及非特異性凝集素。（一）生物安全要求所有有關試驗操作都應在相應生物安全級別的實驗室中進行，必須遵守生物安全規定，嚴格執行標準操作規程和廢棄物管理規定，做好個人防護要求。季節性流感病毒病毒或經完全滅活的高致病性禽流感病毒操作可以在BSL-2實驗室里進行，高致病性禽流感病毒的

3、操作在BSL-3級實驗室中進行。（二）實驗所用試劑1標準參考抗原：以國際疫苗株和國內流行株作為標準參考抗原，新分離的毒株作為待測抗原。2. 標準參考抗血清：以國際疫苗株和國內流行株制備的抗血清作為標準參考血清。血清要經RDE處理。（三）其他試劑/材料/儀器1. 紅細胞懸液2. PH7.4的PBS緩沖液3. RDE（日本生研）4. 水浴箱（37，56）5. 臺式離心機6. 多道可調加樣器、單道可調加樣器7. 離心管8. 96孔微量血凝板（使用豚鼠和人紅細胞進行實驗須用“U”底板，使用火雞紅細胞進行實驗用“V”底板）9. 200µL、1000µLTIP頭、水槽表1. 流感病毒紅

4、細胞凝集試驗各項條件比較紅細胞火雞豚鼠人“O”型血終濃度0.50.50.5孔底部形狀V型U型U型孵育時間25-30min45-60min45-60min紅細胞沉積形狀細胞沉積成點狀，傾斜時細胞向下流成淚滴狀細胞沉積成環狀細胞沉積成環狀（四）流感病毒鑒定和抗原分析步驟1. 實驗前準備（1） 標準參考抗血清的處理1） 去除血清中的非特異性抑制素 a） 所謂抑制素是指各種動物血清、體液、組織液中所含與紅細胞表面受體相似的物質，它們能與紅細胞受體一起競爭性地被病毒表面血凝素所識別和結合。目前所知道的非特異性抑制素，除大白鼠血清中對丙型流感病毒特殊的非特異性抑制素，還有三種：、和。在HAI試驗中，必須將

5、非特異性抑制素從抗血清中去除干凈，才能準確地測定出HAI的抗體效價。常用的清除非特異性血凝抑制素的方法有霍亂濾液（RDE，受體破壞酶的一種）清除法，過碘酸鉀清除法等。b） RDE處理步驟：用25mL生理鹽水稀釋RDE；在1體積血清中加入3體積RDE（如0.1mL血清+0.3mLRDE），37水浴16-18h；56水浴30 min；加入6體積生理鹽水（在0.4mL RDE和血清混合物中加入0.6mL生理鹽水）。2） 去除非特異性凝集素 a） 向20體積RDE處理后的血清中加入1體積的純血球。 b） 完全/徹底混勻，在2-8孵育，每15 min重新混勻一次。 c） 1h后，2000轉離心5min。

6、吸出血清上清液。 d） 取出一塊96孔血凝板，在第一列每孔加入50uLPBS緩沖液,吸出50uL處理好的血清，做2倍稀釋，加入50uL紅細胞懸液，室溫靜置30-60min,觀察試驗結果，如果紅細胞沉積，證明血清中非特異性凝集素去除干凈（去除非特異性凝集用紅細胞類型與下一步試驗用紅細胞類型一致）。（2） 紅細胞懸液配制1） A.S液全稱為Alsever氏液。配制方法為葡萄糖2.05g、檸檬酸鈉0.8g、檸檬酸0.055g、氯化鈉0.42g、去離子水加至100mL，微熱溶解，將pH值調到6.1，8磅20min高壓滅菌，4貯存備用。2） 將含有紅細胞的A.S液，離心5min（火雞/雞紅細胞1800r

7、pm；人“O”型、豚鼠紅細胞2000rpm，不同離心機轉速稍有不同），棄上清。3） 加入等量的PBS緩沖液洗滌，充分混勻，離心5min（轉速同上），棄上清。 PBS緩沖液洗滌三次。最后一次洗滌后，離心10min（轉速同上），棄上清。4） 吸出適當體積的紅細胞，用PBS緩沖液配制成工作濃度為1%紅細胞懸液。2. 流感毒株HA滴度的測定（1） 在微量血凝板的第212列加入50µL PBS緩沖液。（2） 在第一列（A1G1）中加入100µL病毒懸液。（3） H1加入100µL PBS，作為紅細胞陰性對照。（4） 從第一列各孔吸50µL病毒液，由第1列至第12列

8、做2倍系列稀釋，最后一列每孔棄去50µL。（5） 在每孔中加入50µL紅細胞懸液，輕拍血凝板，充分混勻。（6） 室溫孵育，雞和火雞紅細胞靜置25-30min后觀察結果，人“O”型和豚鼠紅細胞45-60min后觀察結果，并記錄。3. HA試驗結果判斷引起全部紅細胞凝集為完全凝集，以“+”記錄；只有部分紅細胞凝集記錄為“+/-”；無凝集記錄“-”。血凝滴度的判定以出現完全凝集的最高稀釋度為終點，其稀釋度的倒數即為病毒的血凝滴度。表2. HA滴度判定舉例病毒稀釋度HA滴度1:11:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:20481234

9、56789101112A+-2B+-8C+-16D+-32E+-64F+-128G+2048H-14. 制備用于紅細胞凝集抑制試驗的4個血凝單位的抗原（1） 一個凝集單位指能引起等量的標準化的紅細胞凝集的病毒量。進行紅細胞凝集抑制試驗時一般用4個血凝單位的病毒量。（2） 制備4個單位血凝抗原時，首先計算出紅細胞凝集抑制試驗所需的病毒抗原的總量。如每種血清做8孔稀釋，每孔用抗原25µL，則測定一份血清需0.2mL抗原。根據標準抗血清的份數計算出實驗所需病毒抗原總量。（3） 其次，計算出病毒稀釋度。用病毒的HA滴度除以8，得到的商即為配置4個血凝單位所需的稀釋度。如，某病毒的HA滴度為6

10、4，除以8等于8，則1:8（1mL病毒液加7mLPBS緩沖液）稀釋該病毒即可得到4個血凝單位的抗原。注：紅細胞凝集抑制試驗中所用的4個血凝單位是指每25µL病毒液中含有4個血凝單位（等于50µL病毒液中含有8個血凝單位）。表3. 所需抗原總量為1600µL時，4個血凝單位配置對照表HA滴度病毒液(µL)PBS(µL)168008003240012006420014001281001500256501550512251575102412.51587.520486.251593.755. 4個血凝單位抗原的復核滴定（1） 為了保證紅細胞凝集抑制試驗

11、中抗原用量一致并且準確無誤，新配置的4個血凝單位抗原需復核滴定。操作方法同HA實驗步驟。（2） 如果只有前4孔出現凝集，表明每50µL病毒含有8個血凝單位，該病毒稀釋準確，可以用于紅細胞凝集抑制試驗。如第5孔也出現凝集，說明每50µL病毒含有16個血凝單位，該抗原必須等量稀釋。如只有前3孔凝集，表明每50µL病毒僅含4個血凝單位，病毒量需加倍。此外，4個血凝單位抗原必須每次現用現配。6. 紅細胞凝集抑制試驗（HAI）（1） 利用HAI方法進行流感病毒的鑒定紅細胞凝集抑制試驗（HAI）鑒定未知病毒，每塊96孔血凝板可以檢測兩株未知病毒。1） 在血凝板的第1- 5、7

12、-11列每孔加入25µL PBS緩沖液，第6和12列每孔加入50µLPBS。然后在A1-A4、A7-A10各孔分別加入：抗A(H1N1)pdm09流感病毒標準參考血清、抗季節性A(H3N2)流感病毒標準參考血清、抗B-Yamagata系流感病毒標準參考血清、抗B-Victoria系流感病毒標準參考血清25µL，用多道移液器從A1-A4、A7-A10行每個孔分別取25µL，由A至H行做2倍稀釋血清，最后一行棄去25µL。2） 第1至4各列每孔加入25µL4血凝單位待檢抗原1, A7至A10各列每孔加入25µL4血凝單位待檢抗原

13、2。第5和第11列加入25µLPBS緩沖液，作為紅細胞對照。第6和第12列第一孔分別加入50µL8血凝單位待檢抗原1和2，由A至H行做2倍稀釋，最后一行棄去50µL，此處做法的目的是HAI實驗同時驗證所配置4單位抗原的準確性,確保實驗結果準確。a） 陽性對照：將試劑盒中的各型/亞型流感病毒標準參考抗原按照上述步驟進行檢測。3） 輕拍，混勻，室溫孵育30min。4） 每孔加入50µL配置好的紅細胞懸液，輕拍混勻，室溫靜置30-60min，觀察血凝抑制實驗結果（具體孵育時間根據使用的不同種類血球來定，詳見表1）。（2） 利用HAI方法進行流感病毒的抗原分析1

14、） 驗證4血凝單位抗原步驟同以上，如果4血凝單位結果不準確需重新配置，直至回滴結果準確為止，在進行抗原分析時4血凝單位抗原一定要配制準確，保證病毒之間抗原分析結果有可比性。2） 在微量血凝板的第1-11列每孔加入25µLPBS緩沖液， 第12列每孔加入50µLPBS緩沖液。在第一行（A1-A11）每孔加入25µL對應待檢流感病毒型/亞型的抗原分析用參考抗血清及陰性對照血清。 3） 從第一行（A1-A11）各孔混勻之后吸取25µL血清，由第1行至第8行做2倍系列稀釋，最后一行每孔棄去25µL液體。4） 在微量板的第1-11列每孔加入25L配制好的

15、4血凝單位抗原，第12列A12孔加入50µL配置好的8血凝單位抗原，由第1行至第4行做2倍系列稀釋，最后一行每孔棄去50µL液體。第12列的E、F、G、H孔做紅細胞對照，輕拍微量板，室溫孵育30min。 5） 在微量板的每孔加入50µL的紅細胞懸液，輕拍微量板，使紅細胞與病毒充分混合。6） 室溫靜置30-60min（具體孵育時間根據使用的不同種類血球來定，詳見表1）。觀察血凝抑制實驗結果。7. 結果判讀紅細胞凝集抑制效價是指血凝現象完全被抑制時血清的最高稀釋度的倒數。如1:80稀釋的血清孔不出現凝集（凝集現象完全被抑制），1:160稀釋的血清孔出現凝集（凝集現象沒

16、有被完全抑制），該血清對測定病毒的紅細胞凝集抑制效價為80。（1） 利用HAI方法進行流感病毒鑒定的結果判斷1） 標準參照抗血清對待檢抗原的抑制效價20才可以算為陽性。2） 待檢抗原與標準參照抗血清有交叉抑制，但與一種型/亞型的標準參照抗血清抑制效價大于其他型/亞型參照抗血清4倍以上時，便可以判定為此種亞型的流感病毒。（2） 利用HAI方法進行流感病毒抗原分析的結果判斷1） 當待檢病毒與參考雪貂抗血清的HAI效價低于參考病毒與參考抗血清自身HAI效價的8倍（含8倍）或以上時，則認為待檢病毒是該參考抗血清檢測到的低反應株；反之，當相差8倍以內時（不含8倍），則認為待檢病毒是參考病毒的類似株。2） 抗原分析試驗時，每次都必須同時加入標準參考抗原進行檢測，它既是結果判讀的依據，也是試驗的質控。確保實驗結果準確，結果更具有可比性。每次陽性對照的血凝抑制效價上下一孔浮動