1、菌種保藏和菌種保藏和使用技術(shù)使用技術(shù)菌種傳代與保藏的意義 菌種從事微生物學(xué)及生命科學(xué)研究的基本材料，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，診斷制品的制備，菌苗的生產(chǎn)、微生物致病性研究，藥物的抑菌試驗(yàn)及藥品微生物檢驗(yàn)等都有一套完整的菌種。 微生物具有生命活力，在傳代過程中易發(fā)生變異甚至死亡，因此菌種傳代與保藏是一項(xiàng)重要的基礎(chǔ)工作。2 標(biāo)準(zhǔn)菌株：由國(guó)內(nèi)或國(guó)際菌種保藏機(jī)構(gòu)保藏的，遺傳學(xué)特性得到確認(rèn)和保證并可追溯的菌株。 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株：由標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)一次傳代得到的培養(yǎng)物。 商業(yè)派生菌株：由供應(yīng)商提供的所有特性與標(biāo)準(zhǔn)菌株等效的菌株。 代：將活的微生物接種到新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并希望獲取新的微生物培養(yǎng)物。這種操作方式，新培養(yǎng)物對(duì)

2、接種培養(yǎng)物而言就稱為一代。 工作菌株：由標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株經(jīng)傳代得到的培養(yǎng)物。3 概念 菌種泛指從自然界獲取的各種微生物的不同的種。 醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究菌種主要考慮其致病機(jī)理 工業(yè)生產(chǎn)研究菌種主要考慮其發(fā)酵機(jī)理 藥品微生物檢驗(yàn)主要考慮其標(biāo)準(zhǔn)性 4菌種的定義及其與各應(yīng)用領(lǐng)域的關(guān)系 標(biāo)準(zhǔn)菌種是指由國(guó)家授權(quán)機(jī)構(gòu)制備的具有穩(wěn)定的生物學(xué)特性并用妥善方法保藏的菌種。 我國(guó)的標(biāo)準(zhǔn)菌種統(tǒng)一由中國(guó)菌種保藏管理委員會(huì)（CCCCMCCCCM）管理，涉及藥品微生物檢驗(yàn)的菌種由醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心（CMCCCMCC）提供5標(biāo)準(zhǔn)菌種的概念及其管理菌種代號(hào)菌種代號(hào)國(guó)內(nèi)藥品微生物檢驗(yàn)所用的菌種代號(hào)是CMCC（F）或CMCC（B）C

3、MCC 中國(guó)醫(yī)學(xué)菌種保藏中心B 代表細(xì)菌， F 代表真菌。 金黃色葡萄球菌 CMCC(B)26003 大腸桿菌 CMCC(B) 44102 枯草芽孢桿菌 CMCC(B) 63501 白色念珠菌 CMCC(F)98001 黑曲霉CMCC(F) 980036 我國(guó)提供的標(biāo)準(zhǔn)菌種通常是以凍干粉的形式包裝于熔封的厚玻璃容器中。在這種容器中，微生物通常與賦形劑共存，由于缺乏生長(zhǎng)必須的環(huán)境條件，一般呈休眠狀態(tài)。7標(biāo)準(zhǔn)菌種的保藏形式8 中國(guó)醫(yī)學(xué)菌種保藏中心提供中國(guó)醫(yī)學(xué)菌種保藏中心提供的標(biāo)準(zhǔn)菌株9 ATCC菌種保藏中心提供的標(biāo)準(zhǔn)菌株菌種保藏中心提供的標(biāo)準(zhǔn)菌株 甘油冷凍管：1011 藥檢所購(gòu)買的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株藥檢

4、所購(gòu)買的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株干粉溶解培養(yǎng)復(fù)壯穿刺半固體培養(yǎng)封裝冷藏12菌種傳代保存流程（1）甘油穿刺半固體培養(yǎng)封裝冷藏13菌種傳代保存流程（2）接種 將微生物接到適于它生長(zhǎng)繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過程叫做接種。 在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中的各種接種必須是無菌操作。 培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，用經(jīng)過滅菌的工具（如接種針和吸管等）在無菌條件下接種含菌材料（如樣品、菌苔或菌懸液等）于培養(yǎng)基上，這個(gè)過程叫做無菌接種操作。 141、接種環(huán)2、接種針3、接種鏟4、接種鉤5、其他玻璃器械15接種工具接種工具1接種針 2.接種環(huán) 3.接種鉤 4.5.玻璃涂棒 6.接種圈 7.接種鋤 8.小解剖刀 接種和分離工具 一般步驟為：

5、準(zhǔn)備液體石蠟并滅菌去水備用。獲得需要保藏菌種的純培養(yǎng)，將液體石蠟注入培養(yǎng)容器中，并完全覆蓋培養(yǎng)基。 液體石蠟液面以高出培養(yǎng)基上端0.51cm為宜 28冰箱保藏17液體石蠟保藏法實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)保藏半固體菌種18 細(xì)菌置28保藏，芽孢桿菌每36個(gè)月移植一次，其他細(xì)菌每月移植一次。 放線菌于28保藏，每3個(gè)月移植一次。 酵母菌于28保藏，每46個(gè)月移植一次。 絲狀真菌于28保藏，每4個(gè)月移植一次。 擔(dān)子菌于28保藏，每3個(gè)月移植一次。 保藏的濕度通常在5070為宜。 19瓊脂斜面低溫保藏法實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)保藏斜面菌種20 干燥保藏法 液氮保藏法 真空干燥保藏法 冷凍干燥保藏法 甘油冷凍保藏法 沙土保藏法其它保藏方

6、法211、菌種“代”的確定：以干燥菌種管為第“0”代，由此得到的第一批子代為第一代，以此類推。2、菌種傳代次數(shù)規(guī)定：不超過5代。3、菌種應(yīng)專人保藏、專柜貯藏，認(rèn)真做好登記，統(tǒng)一編號(hào)，按期傳代。4、保存菌種傳代或凍干均應(yīng)填寫專用記錄，菌種管上應(yīng)有標(biāo)簽，表明菌種編號(hào)、代次、批號(hào)、日期。5、過期菌種應(yīng)及時(shí)處理、登記，經(jīng)121 30分鐘滅菌消毒。22菌種保藏的一般規(guī)定 1、標(biāo)準(zhǔn)菌種必須從認(rèn)可的菌種收集途經(jīng)獲得；實(shí)驗(yàn)室必須建立和保存所有菌種的收集、貯藏、保存、確認(rèn)試驗(yàn)的記錄。 2、實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有文件管理標(biāo)準(zhǔn)菌種（從原始菌種到工作用菌種）。該程序應(yīng)包括：a:標(biāo)準(zhǔn)菌種必須定期傳代，并做確認(rèn)試驗(yàn)。b：每一子菌種都

7、應(yīng)以適當(dāng)標(biāo)簽、標(biāo)記來表示名稱、標(biāo)準(zhǔn)號(hào)、接種日期和傳代日期。C:每一子菌種都應(yīng)以標(biāo)記從原始菌種傳代到工作用菌種的代數(shù)；記錄菌種生長(zhǎng)的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件；菌種生存條件等。23菌種管理 過期菌種應(yīng)及時(shí)清理、登記，并經(jīng)121 、30分鐘高壓消毒滅菌。24過期菌種處理 包括以下幾個(gè)方面：1、菌落生長(zhǎng)情況：目測(cè)2、染色鏡檢：3、生化試驗(yàn)； (1) 糖醇代謝試驗(yàn) （2）氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗(yàn) （3）碳源和氮源利用試驗(yàn) （4）酶類試驗(yàn) （5）其他試驗(yàn)25菌種確認(rèn)試驗(yàn)26 標(biāo)準(zhǔn)菌種是指由國(guó)家授權(quán)機(jī)構(gòu)制備的具有穩(wěn)定的生物學(xué)特性并用妥善方法保藏的菌種。 我國(guó)的標(biāo)準(zhǔn)菌種統(tǒng)一由中國(guó)菌種保藏管理委員會(huì)（CCCCMCCCCM

8、）管理，涉及藥品微生物檢驗(yàn)的菌種由醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心（CMCCCMCC）提供27標(biāo)準(zhǔn)菌種的概念及其管理28 ATCC菌種保藏中心提供的標(biāo)準(zhǔn)菌株菌種保藏中心提供的標(biāo)準(zhǔn)菌株29 藥檢所購(gòu)買的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株藥檢所購(gòu)買的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株 一般步驟為：準(zhǔn)備液體石蠟并滅菌去水備用。獲得需要保藏菌種的純培養(yǎng)，將液體石蠟注入培養(yǎng)容器中，并完全覆蓋培養(yǎng)基。 液體石蠟液面以高出培養(yǎng)基上端0.51cm為宜 28冰箱保藏30液體石蠟保藏法 細(xì)菌置28保藏，芽孢桿菌每36個(gè)月移植一次，其他細(xì)菌每月移植一次。 放線菌于28保藏，每3個(gè)月移植一次。 酵母菌于28保藏，每46個(gè)月移植一次。 絲狀真菌于28保藏，每4個(gè)月移植一次。 擔(dān)子菌于28保藏，每3個(gè)月移植一次