1、第三章滅活劑、保護劑與免疫佐 劑2007-11-25第一節滅活劑 一、滅活與滅活劑獸醫生物制品生產中，滅活(inactivation)是 指破壞微生物的生物學活性、繁殖能力和致病 性，但盡可能不影響其免疫原性。被滅活的微 生物主要用于生產滅活疫苗；或指破壞診斷血 清或待檢血清中的補休活性，以避免補體對診 斷試驗的干擾作用。滅活的對象不同，采用的 方法也不盡相同。本節主要講解微生物的滅活方法及其作用機 理。研制滅活生物制品，選癢合適的滅活劑 和滅活方法十分重要。滅活的主要方法有兩類，即物理學方法 和化學方法。1物理學滅活方法：有加熱及射線照射等方法，過去用加熱 滅活方法者較多。該法簡單易行，但加

2、 熱殺死微生物的方法比較粗糙，容易造 成菌體蛋白質變性，因而免疫原性受到 明顯影響，所以，該滅活方法已基本不 用。射線照射則主要通過破壞核酸來達到滅活微生物體的目的，而微生物的蛋 白質、脂類和多糖等有機化合物的一般 不受影響。因此，射線照射不破壞微生 物的祜痔直悴.力昭対卜壬電肩的ifii60Co照射(rad拉德)倆翩勰翩卷物的容量大小選擇照射物用60L犬玻瓶裝6L的血清或血液， 吸收60Co量200萬rad/h能完全殺死芽ffe桿菌， 150萬rad/hr可使非芽抱菌完全滅活。含雞新城疫病毒的雞胚尿囊液，吸收60Co劑量 達50萬rad/h,病毒可完全被滅活。豬瘟病毒強毒吸收量達到300萬r

3、ad/h完全失去 致病力。被60Co照射處理的血清用于細胞培養，與未照 射的血清比較，病毒培養效果一致；被照射處 理的裂解全血，不影響牛出敗菌及禽霍亂菌的 生上，制山的菌畜菟菠政力於好。用于滅活微生物的化學試劑或藥物稱為 滅活劑(inactivator)?；瘜W滅活劑的種類很多，作用的機理也不同， 而且滅活的效果受多種因素 影響。2（一）甲醛溶液甲醛是最占典的滅活劑，至今仍是牛物制品研究與制 造中最主要的滅活劑。我國農業部發布的獸醫生物 制品制造及檢驗規程（2000） |的 26 種火活疫苗， 均以甲醛作為滅活劑。甲醛溶液是甲醛氣體的水溶液，又稱福爾馬林。常用的甲醛溶液約含 37%甲醛氣體（重量

4、計），為無 色透明液體，有辛辣窒息味，對眼、鼻粘膜有強烈刺 激性，較冷溫度下久貯易變混濁，形成三聚甲醛沉淀, 雖加熱可變清，但會降低其滅活性能，故一般商品甲 醛溶液加 10%15%甲醇，以防止其聚合。甲醛的滅活作用機理是甲醛的醛基作用于微生物蛋白質的氨基產生 輕甲基胺，作用于竣基形成亞甲基二醇單酯， 作用于輕基生成輕基甲酚，作用于疏基形成亞 甲基二醇。甲醛還可與微生物核糖體中的氨基結合,鱷酬鵲間形成交聯鏈亦可抑制微生物作矗獵輜冊缺總婕化滅活劑甲醛的濃度及處理時間適當濃度的甲醛可傳微生物喪失增殖力或毒性, 保持抗原性和免疫itteo針對不同類型的微生物，使用甲醛滅活的 濃度一般為：需氧細菌0.1

5、%0.2%,厭氧菌0.4%05%。 病毒0.05%0.4%（多數為0.1%0.3%）o不論是殺菌或脫毒，使用甲醛或其他滅活 齊|，滅活劑的濃度及處理時間都要根據試驗結 果來確定。 通常以用低濃度、處理時間短而 又能達到徹底滅活目的為原則，必要時可在滅 活后加入硫代硫酸鈉，以中斷其反應。右 滅活疫苗/甲醛濃度/時間/溫度氣腫疽明磯0.5%甲醛3738C7296h氣腫疽甲醛0.5%甲醛3738 C7296h肉毒梭菌（C 型）0.8%甲醛37C10d羊快疫猝疽腸毒血癥三聯 0.5%-0.8%甲醛 37-38C 3-7d家兔魏氏梭菌氫氧化鋁0.8%甲醛36-37C 5d羊大腸桿菌病0.3%甲醛37C2

6、448h豬丹毒、豬肺疫氧氧化鋁二聯 0.25%甲醛 37CI824h豬川毒氫氧化鋁滅活疫苗 0 2%0 25%甲醛 37C 1824h牛出血性敗血病氫氧化鋁 0 1%0 2%甲醛 37C 7-18h豬肺疫氫氧化鋁滅活疫苗0.1%甲醛 37C712h禽霍亂氫氧化鋁滅活疫苗 0.1%甲醛 37C712h禽霍亂汕乳劑滅活疫苗0.1%甲醛 37C 12h山羊傳染性胸膜肺炎氫氧化鋁 0.1%甲醛 1618C 48h兔出熱組織滅活疫苗0 4。滄甲醛 37C1224h牛、羊偽狂大病滅活疫苗 0.15%甲醛 410C 7d破傷風明磯沉降類毒素 0.4%甲醛 38C21-31d 口蹄疫滅活疫苗 0.05%AEI

7、 或 0 02%BEI(二)烷化劑(alkylating age nt)-含有烷基的分子中去掉一個氫原子基團的化合物，它 能與另種化合物作用，將烷基引入，形成烷基取代 物。這類化合物的化學性質活潑，其火活機制主要在 丁烷化DNA 分了屮的鳥嚓吟或腺喋吟等，引起單鏈斷 裂或雙螺旋鏈交聯，因改變 DNA 的結構而破壞其功能, 妨礙 RNA 的合成，從而抑制細胞的有絲分裂。也町與 酶系統和核蛋白起作用而干擾核酸代謝。因此，這類滅活劑能破壞病毒的核酸芯髓，使病 毒完全喪失感染力，而又不損害其螢白衣殼，得以保 留耳保護性抗原。常川的烷化劑類的滅活劑冇乙?；?乙熔亞胺、二乙烯亞胺和縮水甘油醛。滅720h1

8、、乙?；蚁﹣啺稪 (N-acetyl ethylenimine, AEI):為淡黃色澄明液體，有輕微氨臭味，能與水或 醇任意混合。在04C可保存1年，在20C可 保存2年，但在常溫下由于分子聚合，外觀顏 色及流動性均發生變化，從而導致滅活作用的 改變。 AEI功能基團是乙烯亞胺基，可用于滅活口蹄 疫病毒。 在口蹄疫病毒培養液中加入最終濃度 為0.05%,30C 8h后達到滅活目的，滅活終 末需加2 %硫代硫酸鈉阻斷滅活。2、二乙烯亞胺(binary ethylenimine, BEI):市購商品為0.2%的BEI溶液，在04C可保存1個月。按1/10 (V/V)(終濃度為0.02%)加 入口

9、蹄疫病毒懸液中，37C滅活速率對 口蹄疫病毒A24毒株為每小時lOloglO左 右。當滅活結束吋，加入2%硫代硫酸鈉 中斷滅活。3、縮水甘油醛(glycidaldchyde, GDA):本品易揮發，水溶液含量為1531mg/mL保存于04C 3個月含量漸下降，約半年失效;20C只能保存10d。其作用機理是環氧烷基與病毒蛋白或核酸發生 反應。1964年Martinsen將其用于生物制品滅 活劑，對人腸桿菌、噬菌體、新城疫病毒和口 蹄疫病毒等有滅活作用，據報告GDA的滅活效 果優于甲醛。法國梅里厄研究所曾用本品生產牛和豬的口蹄 疫滅活苗。又名石炭酸(Carbolic acid)。為無色結晶或白色熔

10、塊，有特殊氣味，有毒及 腐蝕性，暴露在空氣中和陽光下易變紅色，在 堿性條件下更易促進這種變化。 當不含水及甲 酚時， 在4C凝固，43C溶解。一般商品含有 雜質，使熔點升高；與80%水混合能溶化。易 溶于乙醇、乙瞇、氯仿、甘油及二硫化碳，不 溶干石油瞇。密封避光保存。三)苯酚(phenol)1苯酚（phenol）為徑基與芳桂族（苯環或稠苯環）直接 連接的化合物，是苯的一部分被酚取代 的化合物。對微生物的滅活機制是使其蛋白質變性和抑制特異酶系統（如脫氫酶和氧 化酶等），失去活性。生物制品的常用 量為0.3%05%。（四）結晶紫別名甲基青蓮或甲紫（Methyl violet）。是一 種堿性染料，

11、為綠色帶有金屬光澤結晶或深綠 色結晶狀粉未，易溶于醇，能溶于氯仿，不溶于水和悩，有的商品為五甲基與六甲基玫瑰苯 胺的混合物。對微生物的滅活機制與其它堿性染料一樣,主要是它的陽離子與微生物蛋白質帶陰電的輕 基形成弱電力的化合物（女UCOOH、P03、H2等），妨礙微生物的正常代謝，也可能擾亂微 生物的氧化還原作用，使電勢太高，不適于微 生物的增殖而滅活（如豬瘟結晶紫疫苗、雞白 痢染色抗原等）。(Crystal violet)(五)3-丙酰內酯卩(ppropiolactone), 又名為超基丙酸-內酯。性狀為無色有刺激氣 味的液體，潮氣進入時緩緩分解成拜基丙酸， 其水溶濃迅速全部分解。水中溶解度3

12、7% (V/V),水溶液有效期10C保存18h, 25C?？?5h, 50C保存20min,密封于玻璃瓶中5C保存較為穩定。能 與丙酮、醯和氯仿任意混合。對皮膚。粘膜及眼有強刺激性，.其液體對 動物肴致癌性?；皇裂玫牟《緶鐒?，病毒 滅活后，能保掩良好的免疫原性，主要用于旺 犬病滅活疫苗的制備。三、影響滅活作用的因素某些滅活劑只對一部分微生物有明顯的滅活作用, 而對另一些微生物則效力很芳。如酚類能抑制和殺滅大部分細菌的繁殖體，5%石炭酸溶液于數小時內能殺死細菌的芽胞。 真菌和病毒對酚類不太敏感。陽離子表面活性劑抗菌譜廣，效力快，對組 織無刺激性，能殺死多種革蘭氏陽性菌和陰性菌, 但對綠膿杠菌

13、和細菌芽胞作用弱， 其水溶液不能 殺死結核杯菌。因此在選擇滅活劑時，應考慮其特異性，即 應考慮其對微生物的作用范圍。（二）微生物種類與特性不同種類的微生物如細菌、病毒、真菌以及革蘭 氏陽性菌與革蘭氏陰性菌對各類滅活劑的敏感性 并不完全相同；細菌的繁殖體及其芽胞對化學藥物的抵抗力不同; 生長期和靜止期的細菌對滅活劑的敏感程度亦有 差別，另外細菌的濃度也會影響滅活的效果。微 生物或毒素的總氮量和氨基氮含量対滅活也有一 定影響。一般含氮量越高，甲醛等滅活劑的消耗量就越大, 滅活脫毒速度越慢。（三）滅活劑濃度I-以甲醛為例，甲醛濃度越高，滅活脫毒越快，但抗 原損失量亦較大。有人證明，加0.5%甲醛溶液

14、脫毒的類毒素，其結合 力僅相當于0.2%甲醛溶液脫毒類毒素結合力的2/3。有時可以采用分次加入甲醛溶液進行滅活、脫毒比 較緩和的方法。即將甲醛溶液分數次加入，加量由 小至大，pH由低而高，溫度起初為室溫，繼而轉為 允許的最高溫度，這樣對于保護抗原的免疫原性有 一定好處。（四）滅活溫度通常情況下，火活作用隨滅活溫度上升而加速。 在低溫時，溫度每上升10C,細菌死亡率可成倍 增加。每升高10C,金屬鹽類的滅菌作用增加25倍，石炭酸的殺菌作用增加58倍。但是，如果溫度超過4CTC或更高，對微生物 的抗原性將有不利影響。（五）滅活時間滅活時間與滅活劑濃度和作用溫度密切相關。一般隨著滅活劑濃度增高、作用

15、溫度升高， 滅活時間則縮短。在生物制品生產中，應以能保征制品安 全和效力，以低滅活劑劑量、低作用溫度和 短時間處理為最佳。在微酸性時滅活速度慢，抗原性保持較好，在堿性 時滅活速度快，但抗原性易受破壞。滅活初期損失較快，以后逐漸減慢，尤其甲醛 溶液濃度高時，在堿性溶液屮抗原性損失更大。對細菌的滅活作川，pH 有較大影響。pH 改變 時，細菌的電荷也發生改變，在堿性溶液中，細菌 帶陰電荷較多，陽離子表面活性劑的殺菌作用較人。 在酸性溶液屮，則陰離子的殺菌作用較強。同時， pH 值也影響滅活劑的電離度。未電離的分子一般較 易通過細菌細胞膜，火活效果較好。被滅活的病毒或細菌液中，如果含有血清或其 他有

16、機物質，會影響滅活劑的滅活能力。因為有機物能吸附于滅活劑的表面或者和 滅活劑的化學基團相結合。受其影響最大的為 苯胺類染料、汞制劑和陽離子去污劑。一旦汞 制劑與含硫氫基化物相遇或季讓鹽類與脂類結 合，則明顯降低這些滅活劑的滅活作用。（六（第二節保護劑(protector)又稱穩定齊！J (stabilizer),是指一類能防 止生物活性物質在冷凍真空干燥時受到破壞的 物質。廣義上保護劑是指保護微生物和寄生蟲等活 力和免疫原及隔和激秦窖生物活旌的一類物質, 還包括細菌或病毒的營養液、賦形劑和抗氧化 齊!J。生物制品的冷凍真空干燥一般都加凍干保 護劑， 以使制品在凍干后仍保持有較高的生物 學活性，

17、而且能夠延長制品保存期和提高耐熱 性。 一類為滲透劑，如二甲基亞硯(dimethylsulfoxide, DMSO)、甘油和蔗糖等，能滲入細菌細胞等生物活性物質內部，降 低因冷凍而增加的滲透壓，防止細胞內脫水, 可保護細胞因慢凍可能產生的損害。另一類是非滲透劑如聚乙烯毗咯噪酮(PVP)和蛋白質等，能 防止保護劑分類細胞等生物活性物質由外向內滲漏 溶質，可保護其在速凍和溶解時可能產 生的損害。根據其分子量大小，乂可分為高分子物質和低分子物質。按其化學性質，可 分為復合物、糖類、鹽類、醇類、酸類 和聚合物。丄一些常用的冷凍干燥保護劑分類保護齊IJ復合脫脂乳、明膠、蛋白質、蛋白月東、糊精、物血清、甲

18、基纖維素等糖類蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、果糖等鹽類乳酸鈣、谷氨酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、醋 酸鞍、硫代硫酸鈉等醇類山梨醇、甘油、甘露醇、肌醇、木糖醇等酸類檸檬酸、酒石酸、氨基酸等聚合葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯毗咯烷酮(PVP：物等營養液可使因凍干而受損傷的細胞修復，對水分子起緩2 用,-并能使凍于生物制品仍含有一定量水分匚還可促進 脫脂乳、蛋白豚、氨基酸和糖類等,常為低分子薯防止活性物質失去結構水及阻止結構水形成 結晶而導致生物活性物質的損傷；降低細胞內外的滲透壓差、防止細胞內結構 水結晶，以保持細胞的活力；保護或提供細胞復蘇所需的營養物質，有利 于生活力的復蘇和迅速修復自身。 對凍干生物 活性物

19、質，一些含輕基的有機保護劑，還能替 代部分結構水，、凍干保護劑的組成與作用通常由營養液、賦形劑和抗氧化劑三部分組成。子物質形磴犯HI j狀物廠從而使溶解度PVP、葡凍離質在辭中硫酸鈉增凍與蛋白質中的撥基或氨基結合, 保持其三級和四級結構。一種優良的凍干保護劑應充分利用上述不同物質，發揮各自作用，進行優化集成。二、影響保護劑效能的因素保護劑的效能主要表現在保證生物活性物 質在凍干和保存過程中的存活率。一般來說，每種微生物或生物制品均有其 最佳凍干保護劑的組合，從而獲得在凍干過程 中失活率最低、增加制品的保存期。凍干保護劑的種類、組合、配制以及組分 的濃度對其效能的影響十分明顯。影響保護劑效能的因

20、素一種新的凍干制品在批量生產前應進行系統的最佳保護劑的選擇試驗，包括保護劑凍干 前后的活菌數、病毒滴度或效價測定的比較試 驗；不同保存條件和不同保存期的比較試驗。任何一種制品在選擇凍干保護劑時，還應 選擇適當的凍干曲線，使其在共融點以下水分 基本升華為原則。絕不能任意更換不明規格的 材料和質量標準。在凍干制品投產以后，仍須根據條件的改 變不斷作選擇試驗，以改進凍干制品的質量。用不同保護劑凍干的同一種微生物, 其保存過程中存活率不同。如分別用7.5%葡萄糖肉湯和7.5%乳糖肉湯作保護劑凍干的沙門氏菌，在 室溫保存7個月后的細菌存活率分別為35%和21%o可直接影響凍干制品細菌或病毒的成活率，必須

21、嚴格掌握。如以副大腸桿菌“D201H”加不同濃 度葡萄糖作保護劑進行凍干， 并測定凍 干品的細菌的存活率，證明用5%10%葡萄糖存活率最高。1.保護劑種類2.保3.保護劑配制方法配置方法不同會影響保護劑的效果，例如含糖保護劑滅菌溫度不宜過高, 否則由于糖的炭化而影響凍干制品的物 理性狀和保存效果，所以均采用114C30min滅菌或間歇滅菌；又如血清保護劑就不能用熱滅菌法, 必須以濾過法除菌。保護劑的pH應與微生物生存時的pH相同或相 近，過高或過低都能導致微生物的死亡。例如明膠蔗精保護劑的pH以6.8-7.0為最佳，否則會造成微生物大量死亡。乂如含葡萄糖、乳糖保護劑經高壓滅菌后能或多或少改變保

22、護劑的pH值，從而影響保護 效果，為此最好采取濾過除菌。4.保各類微生物適用的保護劑甚多，同 i 種制品 所使用的保護劑組成不一樣;例如雞新城疫弱毒疫苗，我國選用5%蔗糖脫 脂乳為凍干保護劑，而日本則用5%乳糖，0.15%聚乙烯毗咯烷酮、1%馬血清或0.4%蔗 糖脫脂乳、0.2%聚乙烯毗咯烷酮作保護劑；豬丹毒弱毒菌苗，我國以5%蔗糖、1.5%明膠作凍干保護劑，而日本用5%脫脂乳、2.5%酵母浸膏為保護劑。各類微生物常用的保護劑如下:1.需氧和兼性厭氧性細菌：適用的凍干 保護劑有10%蔗糖、5%蔗糖脫脂乳、5%蔗糖、1.5%明膠，10%20%脫脂 孚L利洽1%谷氨酸鈉的10%脫脂乳等。2.厭氧性細菌：含0.1%谷氨酸鈉的10%乳糖、10%脫脂乳及7.5%葡萄糖血 清等。亠、常用的凍干保護劑）不同微生物適用的保護劑各類微生物常用的保護劑 3.病毒：常以下列物質的不同濃度或