1、1 殺菌劑生物測定殺菌劑生物測定2第三章第三章 殺菌劑毒力測定殺菌劑毒力測定l室內(nèi)測定與田間試驗有一定的差異l殺菌劑田間藥效試驗受寄主(作物)、環(huán)境、以及發(fā)病階段的影響較大。3第三章第三章 殺菌劑毒力測定殺菌劑毒力測定l多菌靈對鐮刀菌及由鐮刀菌引起的赤霉病、惡苗病的室內(nèi)毒力測定和田間藥效比較一致。l但多菌靈在室內(nèi)測定對由鐮刀菌引起的棉花枯萎病效果較好，而田間多菌靈對棉花枯萎病效果較差。4第三章第三章 殺菌劑毒力測定殺菌劑毒力測定l三環(huán)唑（黑色素合成抑制劑）在室內(nèi)測是無效的。l嘧啶胺類殺菌劑（嘧菌胺）室內(nèi)對灰霉病孢子萌發(fā)沒有抑制作用（300L/ ml），但在植物上(1L/ ml)，對灰霉病防效較

2、好。(該類藥劑能抑制病菌甲硫氨酸的生物合成和細(xì)胞壁降解酶的分泌，從而影響病菌侵入寄主植物)5一、殺菌劑毒力測定方法一、殺菌劑毒力測定方法l1、孢子萌發(fā)法 (spore germination method)l快速。廣泛用于保護(hù)劑的測定l此法適用于抑制病菌能量合成系統(tǒng)，而使孢子不能萌發(fā)的殺菌劑。6一、殺菌劑毒力測定方法一、殺菌劑毒力測定方法l1.1 玻璃器皿的處理l清潔：以洗液浸泡數(shù)十分鐘,用自來水沖洗, 用蒸餾水清洗,防塵干燥.l載玻片保存于70%的酒精溶液內(nèi).7一、殺菌劑毒力測定方法一、殺菌劑毒力測定方法l1.2 液劑的附著lA、混合滴加l將供試藥劑與孢子懸浮液混合滴加于載玻片上。對水溶性藥

3、和穩(wěn)定的懸浮劑可得到正確的結(jié)果。對于非水溶性藥劑，因沉降快而不易獲得正確結(jié)果。l簡單迅速，適于大規(guī)模初篩。測得結(jié)果一般偏高。8一、殺菌劑毒力測定方法一、殺菌劑毒力測定方法lB、定量滴加藥膜法l定量滴加藥液（用水或有機溶劑均可），形成均勻的藥膜，再滴加孢子液。l許多有機溶劑（丙酮、乙醚）表面張力小，不易形成均勻的藥膜，因此，應(yīng)采用凹玻片。防塵條件下干燥。9一、殺菌劑毒力測定方法一、殺菌劑毒力測定方法lC、裝置噴霧l利用精確噴霧裝置將藥液噴于載玻片上，干燥后滴加孢子懸浮液。10一、殺菌劑毒力測定方法一、殺菌劑毒力測定方法l1.3孢子懸浮液的配制l孢子萌發(fā)法常用菌種l馬鈴薯晚疫病，水稻稻瘟病，小麥赤

4、霉病，甘薯黑疤病，水稻胡麻葉斑病，玉米大斑病。11一、殺菌劑毒力測定方法一、殺菌劑毒力測定方法l1.3孢子懸浮液的配制l真菌在一定條件下才產(chǎn)生孢子，一般來說，生殖生長的條件比較嚴(yán)格。lA、改變培養(yǎng)基成分：先在高濃度養(yǎng)分的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，再移到營養(yǎng)成分較低的培養(yǎng)基中，可促進(jìn)孢子的產(chǎn)生。12一、殺菌劑毒力測定方法一、殺菌劑毒力測定方法l1.3孢子懸浮液的配制lB、選用不同培養(yǎng)基：l植物質(zhì)培養(yǎng)基或利用植物的組織或它們的煎汁往往可促進(jìn)真菌產(chǎn)生孢子。13一、殺菌劑毒力測定方法一、殺菌劑毒力測定方法l1.3孢子懸浮液的配制lC、培養(yǎng)基的理化性狀l增加培養(yǎng)基的酸度，可促進(jìn)某些真菌產(chǎn)生孢子。固體培養(yǎng)基上比液體培

5、養(yǎng)基上容易產(chǎn)生孢子。14一、殺菌劑毒力測定方法一、殺菌劑毒力測定方法l1.3孢子懸浮液的配制lD、病菌培養(yǎng)條件l高溫、低溫或高低溫交替有時可促進(jìn)孢子的產(chǎn)生。一般半知菌在有光照的條件下易產(chǎn)生孢子。但有的病菌在無光下易產(chǎn)生孢子。15一、殺菌劑毒力測定方法一、殺菌劑毒力測定方法l1.3孢子懸浮液的配制l配制：一般將已培養(yǎng)好的菌種（斜面或三角瓶培養(yǎng)）加入無菌水，用接種環(huán)在表面輕輕摩擦，使孢子懸浮于水中，然后用雙層紗布過濾，除去菌絲體和培養(yǎng)基碎塊。最好在1000r/min的離心機上用無菌水洗滌三次。l一般規(guī)定孢子的濃度最好是5萬/ml。10*10觀察時，每個視野約有35個。16一、殺菌劑毒力測定方法一、

6、殺菌劑毒力測定方法l孢子濃度可用計數(shù)器測定l紐鮑爾（Neubauer）血球計數(shù)器。l邊長為0.05mm的小方格，深度為0.1mm17一、殺菌劑毒力測定方法一、殺菌劑毒力測定方法l1.4 孢子萌發(fā)條件lA、溫度：各種真菌孢子萌發(fā)的最適溫度不同。適于低溫的孢子，如小麥黑穗病菌的厚垣孢子，溫度超過2122 就不能萌發(fā)。18一、殺菌劑毒力測定方法一、殺菌劑毒力測定方法l1.4 孢子萌發(fā)條件lB、濕度：真菌孢子一般要求在水滴中才能萌發(fā)，但也有少數(shù)真菌孢子，如白粉病菌的分生孢子，在相對濕度很低的情況下也能萌發(fā)。19一、殺菌劑毒力測定方法一、殺菌劑毒力測定方法l1.4 孢子萌發(fā)條件lC：光照：光照對多數(shù)真菌

7、孢子萌發(fā)的影響不大，但對某些真菌孢子有刺激或抑制作用，如光照可刺激水稻黑粉病菌厚垣孢子的萌發(fā)，抑制小麥稈銹病菌夏孢子的萌發(fā)。20一、殺菌劑毒力測定方法一、殺菌劑毒力測定方法l1.4 孢子萌發(fā)條件lD：空氣：孢子萌發(fā)多需要空氣，所以水滴表面的孢子比沉在水滴中的萌發(fā)好。但玉米黑粉病菌孢子萌發(fā)需要15%的CO2。21一、殺菌劑毒力測定方法一、殺菌劑毒力測定方法l1.4 孢子萌發(fā)條件lD：養(yǎng)分：有的不需外源養(yǎng)分，有的則必須由外界提供養(yǎng)分。l植物組織煎汁常常是促進(jìn)孢子萌發(fā)的物質(zhì)，其刺激作用是因為含有生長素或揮發(fā)性物質(zhì)。但有研究表明，萌發(fā)促進(jìn)物質(zhì)可增加孢子對藥劑的抵抗力。22一、殺菌劑毒力測定方法一、殺菌

8、劑毒力測定方法l有些病菌在蒸餾水中萌發(fā)不好，可加入某些促進(jìn)物質(zhì)。許多病菌孢子，按10毫升孢子液加入0.1%葡萄糖溶液0.01毫升，可使孢子萌發(fā)整齊。l玉米小斑病菌孢子，適當(dāng)加入一點玉米苗的新鮮汁液，在26下2h，孢子萌發(fā)率高，整齊。23一、殺菌劑毒力測定方法一、殺菌劑毒力測定方法l1.5 調(diào)查方法l一般病菌培養(yǎng)2024小時即可鏡檢。一般在100200倍下鏡檢，每處理隨機檢查200個孢子。l孢子萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)：芽管大于孢子短半徑即算萌發(fā)。l或以孢子囊產(chǎn)生游動孢子為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，如馬鈴薯晚疫病菌。24一、殺菌劑毒力測定方法一、殺菌劑毒力測定方法l1.5 調(diào)查方法l對照萌發(fā)率至少大于80%，低于80%應(yīng)重做。

9、%100對照萌發(fā)率處理萌發(fā)率對照萌發(fā)率抑制萌發(fā)率25Determining fungicide inhibition of pathogen spore germination on concave slidesl1. 試驗靶標(biāo)l易產(chǎn)生孢子,便于鏡檢,如稻瘟病菌,梨黑星病菌等.在培養(yǎng)基上培養(yǎng),或?qū)⒉〗M織保濕培養(yǎng),待產(chǎn)生孢子后備用。26Determining fungicide inhibition of pathogen spore germination on concave slidesl2. 孢子懸浮液配制l將培養(yǎng)好的病原真菌孢子用去離子水從培養(yǎng)基或病組織上洗脫、過濾、離心（1000r/

10、min）5min，倒去上清液，加入去離子水，再離心。最后用去離子水將孢子重懸浮至每毫升105107個孢子，并加入0.5%葡萄糖溶液。27Determining fungicide inhibition of pathogen spore germination on concave slidesl3. 藥劑的配制l水溶性藥劑直接用水溶解，其它藥劑選用合適的有機溶劑（甲醇、丙酮、二甲基亞砜等）溶解，再用0.1%的吐溫80水溶液稀釋，設(shè)置57個濃度，有機溶劑最終含量不超過2%28Determining fungicide inhibition of pathogen spore germinati

11、on on concave slidesl4. 藥劑處理l使藥液與孢子懸浮液在小試管中等量混合均勻。用微量加樣器吸取上述混合液滴到凹玻片上，然后架放于帶有淺層水的培養(yǎng)皿中，加蓋保濕培養(yǎng)。每處理不少于3次重復(fù)。29Determining fungicide inhibition of pathogen spore germination on concave slidesl5. 調(diào)查l當(dāng)空白對照孢子萌發(fā)率達(dá)到90%以上時，每重復(fù)了隨機觀察3個以上視野，調(diào)查孢子總數(shù)不少于200個，分別記錄萌發(fā)數(shù)和孢子總數(shù)。30Determining fungicide inhibition of pathogen

12、 spore germination on concave slidesl6. 數(shù)據(jù)處理l計算校正的孢子萌發(fā)率，求出毒力回歸線，EC50，EC90及95%置信限。31一、殺菌劑毒力測定方法一、殺菌劑毒力測定方法l2 生長速率法(mycelium growth rate test)l將不同濃度的藥液與融化的培養(yǎng)基混合，制成帶毒培養(yǎng)基平面，在平面上接種病原菌，以病原菌生長速度快慢來判定藥劑毒力大小。32一、殺菌劑毒力測定方法一、殺菌劑毒力測定方法l2 生長速率法l病菌易培養(yǎng)，菌絲生長快，不易產(chǎn)生孢子。l棉花炭疽、紅麻炭疽、小麥赤霉等病菌具有生長快速、整齊、平伏的特點，有利于此法測定。33一、殺菌劑

13、毒力測定方法一、殺菌劑毒力測定方法l2 .1 含毒培養(yǎng)基的制備l一般以1ml藥液加入 9ml培養(yǎng)為宜,這樣的比例不會影響培養(yǎng)基凝固.l對揮發(fā)性強、受熱易分解的藥劑應(yīng)注意培養(yǎng)基的溫度，最好當(dāng)培養(yǎng)基冷卻到50左右時再加入藥劑。34一、殺菌劑毒力測定方法一、殺菌劑毒力測定方法l2 .2 接種病原菌l菌餅接種法：0.4cm的打孔器打出菌餅，用接種針或鑷子放入含毒培養(yǎng)基的中央。35一、殺菌劑毒力測定方法一、殺菌劑毒力測定方法l2 .2 接種病原菌l劃線接種法：用接種針沾取病菌孢子液在培養(yǎng)基上劃一直線進(jìn)行接種，培養(yǎng)一段時間后，測量菌絲伸向直線垂直方向的長度。36一、殺菌劑毒力測定方法一、殺菌劑毒力測定方法

14、l2 .3結(jié)果檢查及其表示方法l十字交叉測2個直徑，以其平均值代表菌落大小。%1001菌餅直徑對照菌落直徑菌餅直徑處理菌落直徑抑制生長率37一、殺菌劑毒力測定方法一、殺菌劑毒力測定方法l3 濾紙片附著法(adsorption technique)l此法是將真菌孢子懸浮液用適當(dāng)方法附著在滅菌的濾紙片上，使其接觸一系列不同濃度的藥劑，放在一定條件下培養(yǎng)一定時間后，觀察菌絲生長情況。38一、殺菌劑毒力測定方法一、殺菌劑毒力測定方法l3 濾紙片附著法l定性濾紙滅菌（130，1h），70-80%的酒精20-30分鐘， 滴加孢子懸浮液，無菌干燥，浸入藥液中10分鐘，放入培養(yǎng)基上培養(yǎng)。39一、殺菌劑毒力測定

15、方法一、殺菌劑毒力測定方法l4 擴散法（抑菌圈法,detection of inhibition zone）l基本原理是在已接種的瓊脂培養(yǎng)基上加少量的抗菌物質(zhì)，使其接觸培養(yǎng)基和病原菌，經(jīng)一定時間的培養(yǎng)后，接觸部分的周圍由于抗菌物質(zhì)的擴散而產(chǎn)生抑菌圈。l擴散法廣泛用于醫(yī)用和農(nóng)用抗菌物質(zhì)的篩選和抗菌性物質(zhì)有效成分的定量40一、殺菌劑毒力測定方法一、殺菌劑毒力測定方法l4 擴散法l管碟法：國際公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)抗菌素效價測定l將直徑9.0cm的培養(yǎng)皿保持水平，倒入約20ml瓊脂培養(yǎng)基，凝固后作為底層，然后將馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基溶化，在5060時，接種供試菌（細(xì)菌、霉菌孢子），取其少量均勻倒入培養(yǎng)皿的底層培養(yǎng)

16、基上，做成試驗平面（菌層）。41一、殺菌劑毒力測定方法一、殺菌劑毒力測定方法l4 擴散法l管碟法：l在試驗平面上放4個牛津杯（外徑8mm，內(nèi)徑6mm，高10mm）。用移液管將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)液和不同濃度的待測液移圓筒內(nèi)，在適溫下培養(yǎng)，讓其形成抑菌圈。測其直徑。42一、殺菌劑毒力測定方法一、殺菌劑毒力測定方法l4 擴散法：農(nóng)用抗菌素效價測定l抗菌素效價的衡量單位分兩類：lA、稀釋單位，將1mg抗菌素配成溶液，在一定條件下進(jìn)行稀釋，對某一細(xì)菌能抑制其生長的最高稀釋度，即為1mg抗菌素所含的單位。如1mg青霉素，在一定條件下稀釋3600倍能抑制白色念球菌的繁殖，則1mg青霉素含有3600單位。43一、

17、殺菌劑毒力測定方法一、殺菌劑毒力測定方法l4 擴散法：農(nóng)用抗菌素效價測定lB、重量單位，將純凈的抗菌素直接作為抗菌素效能的衡量單位，即1g相當(dāng)于于1個單位。例如，純凈的1mg鏈霉素含有1000個單位。44一、殺菌劑毒力測定方法一、殺菌劑毒力測定方法l4 擴散法：l濾紙片法：藥劑加于一定大小的圓形濾紙片上。l孔碟法：在培養(yǎng)基上打孔或留孔，藥液加于此孔內(nèi)。l滴下法：利用注射器、毛細(xì)管、移液管等將藥液直接滴加于培養(yǎng)基上。45一、殺菌劑毒力測定方法一、殺菌劑毒力測定方法l5 稀釋法(最低抑制濃度測定法, determination of minimum inhibitory concentration

18、)l在液體或固體培養(yǎng)基中，加入一系列濃度的供試藥液，分別注入滅菌的試管或培養(yǎng)皿內(nèi)，在其中接種供試菌進(jìn)行培養(yǎng)，把具有使病菌發(fā)育完全停止的最低濃度定為抗菌力的指標(biāo)。l此法也可用抗菌素的效價測定。46一、殺菌劑毒力測定方法一、殺菌劑毒力測定方法l6 氣體效力測定法l一般把表示揮發(fā)物質(zhì)的抗菌力叫氣體效果。l一般在滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)固定的培養(yǎng)上接種供試菌，將皿倒置，在蓋內(nèi)放上藥劑，用2%洋菜液或玻璃紙密封，調(diào)查適溫下的病菌生長狀況。 47二、不同類型殺菌劑效力測定方法二、不同類型殺菌劑效力測定方法l1 噴布用殺菌劑效力測定l1.1 鮮葉孢子萌發(fā)試驗法l在（梨等的）葉表面撒布藥劑，噴布梨黑斑病菌孢子懸浮液,葉

19、片放在保濕的培養(yǎng)皿內(nèi)，在25-28保持20小時后，用龍膽紫或亞甲基藍(lán)（0.1%水溶液）將芽管染色,將葉片風(fēng)干,用涂有甘油透明膠的蓋玻片輕輕壓在葉面上,等明膠凝固后,剝?nèi)∩w玻片,鏡檢。48l梨黑斑病二、不同類型殺菌劑效力測定方法二、不同類型殺菌劑效力測定方法49l1.1 鮮葉孢子萌發(fā)試驗法l蘋果葉（蘋果灰霉病菌(Botrytis cinerea )孢子懸浮液）也可用此法。二、不同類型殺菌劑效力測定方法二、不同類型殺菌劑效力測定方法50l1.2 葉片接種試驗法l在附著藥劑的葉片上接種病原菌，一定時間后觀察發(fā)病情況，以判斷藥劑效果。此法可用于甘薯黑星病，白菜軟腐病、麥類葉白粉病等。二、不同類型殺菌劑

20、效力測定方法二、不同類型殺菌劑效力測定方法51以蠶豆法（高坂氏法）為例，測定步驟如下：a）用適當(dāng)方法在蠶豆成葉（有一對小葉的復(fù)葉）的兩面撒布藥劑或?qū)⑿Q豆葉在藥液中迅速浸沾一下，使葉片充分附著劑，在室內(nèi)干燥后，置于保濕的培養(yǎng)皿內(nèi)。b）將在馬鈴薯洋菜培養(yǎng)基平面上培養(yǎng)（28）3d的水稻紋枯病菌（Hypochuns sasakii）用打孔器，將帶菌的培養(yǎng)基打成直徑為5mm的小塊，放在藥劑處理過的葉片中部，并蓋上蓋玻片（7mm7mm）進(jìn)行接種。c）接種后把葉片放到恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)（30）約20h后調(diào)查菌絲生長長度，測定對菌絲的抑制作用。同時在接種3d后，當(dāng)對照組的發(fā)病面積擴展到全葉面時，觀察藥劑處理后的發(fā)病

21、程度，判斷藥劑的防治效果。52以蠶豆法（高坂氏法）為例，測定步驟如下：d）在未進(jìn)行藥劑處理前接種病菌，當(dāng)發(fā)病面積到全葉面積的1/101/5時（接種后24h左右）取出病葉，進(jìn)行藥劑處理，藥劑干后，置培養(yǎng)皿內(nèi)，進(jìn)行上述保溫培養(yǎng)，12d 內(nèi)觀察對病勢進(jìn)展的抑制作用。e）測定殘效時，在蠶豆的青苗上（也可剪取室內(nèi)水培的幼苗枝葉）灑布藥劑，在預(yù)定的施藥若干天后，采集附有藥劑的葉片，同上進(jìn)行接種試驗。f）在對照組病斑擴大到全葉面時進(jìn)行藥效調(diào)查。出現(xiàn)的病斑（合并后的病斑）大小（面積），以發(fā)病面積對全葉面積的比率來表示。進(jìn)行本試驗的蠶豆盡量一致（葉片所在部位的大小），一個試驗處理的供試葉數(shù)至少要10枚以上。53

22、l1.3 幼苗接種試驗法l一般認(rèn)為此方法是最可信賴的方法，稻瘟病、稻胡麻葉斑病、稻紋枯病、甘藍(lán)黑斑病等可用此法。l稻胡麻葉斑病二、不同類型殺菌劑效力測定方法二、不同類型殺菌劑效力測定方法54例如甘藍(lán)黑斑病的接種試驗，是把小油菜、白菜栽培在盆中，當(dāng)長到35片真葉時，將馬鈴薯洋菜培養(yǎng)基上培養(yǎng)（2528）一周的黑斑病菌孢子懸浮液（可用滅菌水制備，如果用馬鈴薯浸煮液或Hepkins培養(yǎng)母液制備孢子懸殊浮液，則發(fā)病率可提高），用玻璃噴霧器噴出接種，接種前后進(jìn)行藥劑處理。把噴藥、接種后的植物放入接種箱或適當(dāng)?shù)谋仄髦校?528下保持24h，取出放到室內(nèi)有陽光處或溫室內(nèi)，保持25左右的室溫。當(dāng)看到有病斑生

23、時，調(diào)查病斑數(shù)目。若病斑過多或造成葉片枯萎時，應(yīng)確定適當(dāng)?shù)谋缓?biāo)準(zhǔn)，以判定藥效。55l2 種子殺菌劑效力測定l通常采用將病原菌附著在種籽的試驗法。人工制備帶菌種籽常用的病原菌有：棉花炭疽病菌，稻麥赤霉病菌等。l種子殺菌劑的作用是抑制附著或潛伏在種苗上病原菌的活動，以防止田間發(fā)病。它不能損害在土壤中的種子發(fā)芽，但能抑制寄生在幼苗而引起發(fā)病的有害病菌，以便使幼苗生長良好的。 二、不同類型殺菌劑效力測定方法二、不同類型殺菌劑效力測定方法56例如，用棉花炭疽病菌對棉花籽接種進(jìn)行藥劑效力測定時，先把棉籽用溫湯浸種，以除去棉籽上的雜菌。晾干后拌以一定量的棉花炭疽病孢子懸浮液，再涼到七成干，進(jìn)行藥劑處理；然

24、后將藥劑處理過的棉籽置于培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)基平面上，一定時間后觀察種籽發(fā)病情況和發(fā)芽率，比較效果。57l3 土壤殺菌劑效力測定l供試土壤不能僅限于1種，至少應(yīng)選2-3種土壤。l有直接法和盆栽試驗法二、不同類型殺菌劑效力測定方法二、不同類型殺菌劑效力測定方法58l3 土壤殺菌劑效力測定l直接法：在玻璃容器內(nèi)裝入病原菌和土壤，進(jìn)行藥劑處理，直接判斷殺菌效果。l土壤過篩、滅菌、接種病原菌、注入藥液、培養(yǎng)、用水將土壤沖掉，取出菌絲、菌核、在培養(yǎng)基上培養(yǎng)看能否發(fā)育。二、不同類型殺菌劑效力測定方法二、不同類型殺菌劑效力測定方法59Zentmyer方法：將風(fēng)干土用8目篩篩過，裝入高壓滅菌的玻璃管內(nèi)（直徑2cm，長

25、8.5cm），裝土厚度為2.5cm。其上放入一定量培養(yǎng)好的供試菌絲或菌核，然后再裝入2.5cm厚的滅菌土，注入5ml供試藥液，在適溫下培養(yǎng)24h后，將玻璃管內(nèi)的土壤倒在金屬網(wǎng)上，用自來水將土壤沖掉，取出菌絲、菌核、置清潔的濾紙上，除去水分，接種在酸性真菌培養(yǎng)基上（即加有0.05%檸檬酸的馬鈴薯洋菜培養(yǎng)基），在適溫下培養(yǎng)，觀察能否發(fā)育，以判定藥效。也可采用下述方法：菌種用秧苗枯萎病菌類（Rhizoctonia SP,Pythium SP,Fu Sarium Oxysporum）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）等。在普通試管內(nèi)（直徑1.5cm）加入洋菜培養(yǎng)基5ml

26、，培養(yǎng)菌核病（高層培養(yǎng)），當(dāng)菌絲生長到布滿全培養(yǎng)基時，將滅菌土和定量藥劑混合（含水量為30%左右）每支試管內(nèi)輕輕裝入20g混合藥的土壤，保持在28下，然后測定管壁上菌絲的伸長度。 60荻原氏法：荻原氏（1960）報道培養(yǎng)皿的試驗方法。這是揮發(fā)性小的藥劑對土壤表層病菌（秧苗枯萎病菌、菌核病菌）毒力測定的有用方法。在直徑9cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，加入風(fēng)干土20g，使其均勻平整，在土壤表面噴布一定濃度的藥液1.7ml。若用粉劑，可取一定量的藥粉混入土中，或?qū)⒓啿集B成雙層，把藥粉包好，均勻地撒在土表。在土表中央放一蓋玻片，上面放洋菜培養(yǎng)基塊，并接種菌核病菌。保存在28的保濕器中，一定時間后測定菌絲伸向土壤表面

27、的長度。用蒸氣滅菌供試土壤。也可用濾紙片代替蓋玻片，用秧苗立枯病菌(Rhizoctonia SP)代替菌核病菌。如果在培養(yǎng)皿的整個平面播種小油菜類種籽，可以明確的判定藥劑的藥效和藥害。61l3 土壤殺菌劑效力測定l盆栽法：用致病性強的秧苗枯萎病菌進(jìn)行盆栽試驗，一般可得到與田間藥效一致的結(jié)果。二、不同類型殺菌劑效力測定方法二、不同類型殺菌劑效力測定方法62將秧苗枯萎病菌在麥麩培養(yǎng)基上培養(yǎng)（28）10d左右取出，盡量在無菌條件下涼干（達(dá)到能過篩的程度）將其松散成10篩目大小一致的顆粒。取2g加入蒸汽消毒的（100，30min）1L土樣中，混合均勻，然后取混合好的帶菌土100ml裝入直徑為78cm普

28、通花盆的孔洞用濾紙或吸濕紙堵住，而不用碎瓦片。然后根據(jù)藥劑性能用相應(yīng)的方法（混入，溶于水全面灌注或具有揮發(fā)性藥劑，注加于中心部位）進(jìn)行處理。立即或過一定時間后，播種綠豆，瓜類種籽510粒，放在2030的室內(nèi)、溫室或露天，在土表尚未太干時灌水，并觀察發(fā)芽，幼苗生長狀況，通常經(jīng)過7d14d，當(dāng)有侵染力的病菌生存的情況下，幼苗生長不良，即可判斷有無效果。 63以菌核病菌為供試菌種時，將滅菌土放入盆缽后，再把培養(yǎng)好的菌核均勻地放到土表（用直徑7cm的盆，每盆放1020粒），然后用滅菌土把菌核完全復(fù)蓋好，再進(jìn)行藥劑處理。菌核應(yīng)采用在馬鈴薯洋菜或稻草培養(yǎng)基上，25左右培養(yǎng)23周的、成熟度一致的菌核。如果將

29、菌核在甜菜培養(yǎng)基上（即在甜菜渣培養(yǎng)基中加等量水進(jìn)行高壓滅菌）進(jìn)行培養(yǎng)，可得到非常大的菌核。一次進(jìn)行大量試驗時，盆內(nèi)可多半裝不滅菌的土，僅在上部裝2cm 厚的滅菌土即可。試驗用的盆缽不限于素?zé)ㄅ瑁部捎蒙狭擞缘幕ㄅ杌蚺囵B(yǎng)皿、搪瓷盆等容器。64l4 果實防腐效力測定l先用砂紙輕擦果實，使果皮擦傷，也可用刀尖或昆蟲針刺傷。將果實放在藥液中浸漬一定時間或噴上藥液，晾干后，進(jìn)行接種，然后將接種后的果實放入玻璃保濕器，在25下保持5天，觀察發(fā)病情況。二、不同類型殺菌劑效力測定方法二、不同類型殺菌劑效力測定方法65l5 內(nèi)吸殺菌劑效力測定l英國等常用室溫下沙培西紅柿苗法：當(dāng)苗高15cm左右時，將藥液灌于幼

30、苗根部或莖部注射或用羊毛脂混合涂莖，處理57天后接種早疫病菌孢子，在室溫下讓其發(fā)病，觀察病斑發(fā)生程度。二、不同類型殺菌劑效力測定方法二、不同類型殺菌劑效力測定方法66l5 內(nèi)吸殺菌劑效力測定l還可將普通盆栽的蠶豆芽拔出(不使根損傷),于藥液中浸一定時間后,再放置原位繼續(xù)栽培,待完全成活后,接種赤霉病菌,并判斷其效果。二、不同類型殺菌劑效力測定方法二、不同類型殺菌劑效力測定方法67三、抗病毒劑測定方法三、抗病毒劑測定方法l1 病毒磨擦接種法l切取少量植物病癥嚴(yán)重的新組織，放入研缽內(nèi)，加入與組織鮮相等或5倍量的1/15mol磷酸緩沖液，充分磨碎（先把組織冰凍，可更易磨碎）。把棉球在制備的病組織汁液

31、中浸蘸一下，用鑷子夾住棉球在接種植物的葉面沿其支脈方向輕輕擦1-2次。為了提高接種效率，最好在含病毒的汁液中加少量金剛砂（400-600目）再接種。68三、抗病毒劑測定方法三、抗病毒劑測定方法l2 藥劑施用方法l2.1 浸漬法l2.2 組織培養(yǎng)法l2.3 涂莖法l2.4 撒布法l2.5 土壤使用法69四、殺菌劑溫室植株測定法四、殺菌劑溫室植株測定法l殺菌劑的開發(fā)：l室內(nèi)測定l溫室植株測定l田間試驗70四、殺菌劑溫室植株測定法四、殺菌劑溫室植株測定法l1、供試植物l我國常用植物：小麥、水稻、黃瓜、棉花、番茄、馬鈴薯。l植物不同發(fā)育時期感病性不一樣，黃瓜霜霉病成株易感病。l兼性寄生菌易侵害弱的寄主

32、，專性寄生菌要求正常植物代謝作為其營養(yǎng)，如小麥銹病接種時，健壯的植株才易接種成功。71四、殺菌劑溫室植株測定法四、殺菌劑溫室植株測定法l2、供試菌種l易培養(yǎng)，易產(chǎn)生大量孢子，應(yīng)是我國主要病害的病原菌。l小麥銹病菌、黃瓜霜霉病菌目前不能在常規(guī)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，可植株培養(yǎng)。霜霉病菌需新鮮孢子接種才能成功。72四、殺菌劑溫室植株測定法四、殺菌劑溫室植株測定法l接種時應(yīng)注意l（1）病原菌的培養(yǎng)條件及其退化l不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的病菌，其致病力往往不同。l有的菌種連續(xù)培養(yǎng)，致病力減弱，須經(jīng)過植物接種及重新分離的方法使其恢復(fù)致病力。73四、殺菌劑溫室植株測定法四、殺菌劑溫室植株測定法l接種時應(yīng)注意l（2）病原菌的菌

33、系及生理小種l來源于不同地區(qū)或不同寄主，其致病力往往有很大差異。74四、殺菌劑溫室植株測定法四、殺菌劑溫室植株測定法l接種時應(yīng)注意l（3）接種量l一般病害需要一定數(shù)量的孢子接種才能發(fā)病。一般孢子濃度要在低倍鏡下每視野20-30個孢子。75四、殺菌劑溫室植株測定法四、殺菌劑溫室植株測定法l3、接種時環(huán)境因子的控制l接種后需保持一定時間的溫度，才能滿足病菌萌發(fā)和侵入寄主的要求。l馬鈴薯晚疫病菌在低溫時才能產(chǎn)生大量孢子，但孢子的侵入寄主后又需要較高的溫度。76四、殺菌劑溫室植株測定法四、殺菌劑溫室植株測定法l4、接種方法l對氣流和雨水傳播的病害，可采用噴灑法、噴粉法及涂抹法接種。如病菌主要是氣孔侵入

34、，接種時主要是葉背面，對由傷口侵入的病害，可先將植物表面用細(xì)砂損傷。77四、殺菌劑溫室植株測定法四、殺菌劑溫室植株測定法l4、接種方法l銹病和白粉病菌的接種，可直接用孢子粉（用滑石粉稀釋）噴撒于植物葉片上。78Potted plant test for fungicide control of downy mildew on cucumberl盆栽法測定防黃瓜霜病試驗l1、試材準(zhǔn)備l選用感病黃瓜品種盆栽，幼苗長至4到6片真葉期備用。79Potted plant test for fungicide control of downy mildew on cucumberl2、孢子囊懸浮液的準(zhǔn)備l

35、選擇病源葉片，用4蒸餾水洗下葉片背面霜霉病菌孢子囊，配成懸浮液（濃度為每毫105到107個孢子囊),4 下存放備用。80Potted plant test for fungicide control of downy mildew on cucumberl2、藥劑的配制l水溶性藥劑直接用水溶解，其它藥劑選用合適的有機溶劑（甲醇、丙酮、二甲基亞砜等）溶解，再用0.1%的吐溫80水溶液稀釋，設(shè)置57個濃度，有機溶劑最終含量不超過1%81Potted plant test for fungicide control of downy mildew on cucumberl3、藥劑處理l將藥液均勻噴施

36、于葉片兩面至全部潤濕，待藥液自然風(fēng)干后備用。試驗設(shè)不含藥劑的處理作空白對照。82Potted plant test for fungicide control of downy mildew on cucumberl4、接種與培養(yǎng)l將新鮮孢子囊懸浮液噴霧接種于葉片背面，每處理不少于5盆，每盆2株，保護(hù)性試驗在藥劑處理后24小時接種，治療性試驗在藥劑處理前24小時接種。接種后培養(yǎng)，光照/黑暗各12小時，溫度為17到22，RH90%以上。83Potted plant test for fungicide control of downy mildew on cucumberl5、調(diào)查l根據(jù)空白對照

37、發(fā)病情況，對接種葉片進(jìn)行分級調(diào)查：l0級：無病l1級：病斑面積5%以下；l3級：610%l5級：1125%l7級：2650， 9級：50%以上84Potted plant test for fungicide control of downy mildew on cucumberl6、數(shù)據(jù)處理l根據(jù)病情指數(shù)計算防治效果，求出毒力回歸線，EC50、EC90及95%置信限。85五 殺菌劑的抗藥性測定1 抗藥性測定的要點1）測定標(biāo)準(zhǔn)：測定時并不是觀測其絕對數(shù)值，而是將測定值與標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行比較。標(biāo)準(zhǔn)菌株是指歷來存在于自然界中的普通菌株或菌株群。2）檢測菌的采集和處理： 單孢分離培養(yǎng)或單細(xì)胞分離培養(yǎng)。3

38、）藥劑的選擇和處理：86五 殺菌劑的抗藥性測定4）試驗方法的選擇： 將從田間采集的病原菌進(jìn)行離體測定。 一種方法是使供試菌產(chǎn)生一定反應(yīng)的藥劑濃度（LD50或MIC）；另一種是比較在一定藥劑濃度下與不添加藥劑情況下供試菌的生長狀況，推測藥劑對菌生長的抑制程度。872 抗藥性測定方法：1）水稻稻瘟病菌（pyricularia oryzae) 對春雷霉素的抗藥性測定采用MIC法；對有機磷的抗藥性測定采用MIC法，孢子萌發(fā)法或菌絲生長法。五 殺菌劑的抗藥性測定88稻瘟病菌的分離和春雷霉素、有機磷抗性菌的測定 從田向采集的病稻樣本放在聚氯乙烯或聚乙烯袋內(nèi)用橡皮圈封住。分離之前保存在5冰箱內(nèi)(可保存一年左

39、右)。分離時首先切取病斑及其外圍部并浸于80乙醇中，然后再浸于0.1升汞水中，最后用無菌水洗凈，進(jìn)行表面消毒。消毒液也可用20倍安替佛民(antiformine)液代替。培養(yǎng)皿中注入一薄層瓊脂平板，平板表面放置病組織塊并使其充分附著瓊脂表面。在20-27下用近紫外光照射，2-7天后病斑部即產(chǎn)生孢子，孢子可在立體顯微鏡下用眼科手術(shù)刀進(jìn)行單孢分離并接種，在26-27下培養(yǎng)，大約十天后菌絲擴展，然后用打孔器打成菌塊，菌絲朝上移置到含藥PSA培養(yǎng)基和不含藥PSA培養(yǎng)基表面，在26-27下培養(yǎng)4-7天，通過測量菌落直徑求藥劑對菌絲生長抑制率。89稻瘟病菌的分離和春雷霉素、有機磷抗性菌的測定 春雷霉素抗性

40、程度大，采用l0-l00ppm之間任何濃度均可進(jìn)行抗藥性測定(10 ppm對敏感菌抑制率約60，對抗性菌不抑制。100ppm對敏感菌抑制率90，抗性菌約20)。配制春雷霉素要用檸檬酸緩沖掖將pH值調(diào)到5左右。 有機磷殺菌劑的田間抗性菌抗性程度多較弱，與普通菌區(qū)別本大。對異稻瘟凈來說，一般可采用l00mM濃度進(jìn)行測定(在此濃度下敏感菌抑制率約90，抗性菌約40或以下)。90五 殺菌劑的抗藥性測定2 抗藥性測定方法：2） 蘋果黑星病菌(Venturia inaequalis) 本病菌對多果定、苯來特、甲基托布津已產(chǎn)生抗藥性。在進(jìn)行抗藥性測定存在的問題是該病原菌在培養(yǎng)基上生長的很慢，將本菌從寄主病斑

41、部進(jìn)行單孢分離直至作為供試菌進(jìn)行抗藥性測定需要相當(dāng)長的時間，因此多采用從病斑部直接采集孢了進(jìn)行測定的方法。91五 殺菌劑的抗藥性測定2 抗藥性測定方法：2） 蘋果黑星病菌(Venturia inaequalis) 本菌對多果定的抗藥性采用子囊孢子萌發(fā)的方法進(jìn)行測定 。對苯來特和甲基托布津的抗性，通常采用孢子蔭芽率、萌發(fā)管長度及菌絲生長的方法進(jìn)行測定。這兩種藥劑屬細(xì)胞分裂抑制劑，抑制菌絲生長比抑制孢子萌發(fā)的能力強，因此一般認(rèn)為采用測量萌發(fā)管或菌絲生長的方法比較適合。92五 殺菌劑的抗藥性測定2 抗藥性測定方法：3） 梨黑星病菌(Venturia nashicola) 已有報道指出，采用菌絲生長的

42、方法證明本菌已對苯來特和甲基托布津產(chǎn)生了抗性。與蘋果黑星病菌同樣，本菌在培養(yǎng)基上生長很慢，分離培養(yǎng)測定所需時間長。一般認(rèn)為，進(jìn)行抗藥性測定不宜采用孢子萌發(fā)的方法，梅本等建立了以異常萌發(fā)作指標(biāo)的萌發(fā)管隔膜法。93萌發(fā)管隔膜法測定梨黑星病菌對苯并咪唑類藥劑抗藥性試驗 在PDA培養(yǎng)基中加入供試藥劑，然后高壓蒸氣滅菌。從梨的葉采集分生孢子放在含藥瓊脂培養(yǎng)基表面。為防止混入細(xì)菌的繁殖，可放在稍低溫度下(15)使其發(fā)芽。大約經(jīng)48小時即產(chǎn)生萌發(fā)管。但為可靠起見，最好在72小時后進(jìn)行調(diào)查，觀測萌發(fā)管有無隔膜。一般認(rèn)為苯來特、甲基托布津均采用0.2ppm濃度為宜。 也可采用子囊孢子進(jìn)行測定。此時，可將形成子囊

43、殼葉片用葉穿孔器切取病組織片，放在水中浸3-5分鐘，然后貼在培養(yǎng)皿蓋內(nèi)表面，使子囊孢子落在培養(yǎng)皿內(nèi)含藥PDA培養(yǎng)基表面。其他過程與上述相同。94五 殺菌劑的抗藥性測定2 抗藥性測定方法：4）梨黑斑病菌(Alternara kikuchiana) 本菌對多氧霉素的抗藥性已成為問題。多氧霉素對孢子萌發(fā)抑制并不顯著，但具有強烈的使萌發(fā)管膨潤的作用。因此，可通過異常萌發(fā)或抑制菌絲生長的方法進(jìn)行抗藥性測定。95五 殺菌劑的抗藥性測定2 抗藥性測定方法：5）柑桔青霉病菌(Penicillium italicum)和綠霉病菌(Penicillium dijitatum) 本菌對苯來特、甲基托布津及涕必靈產(chǎn)生抗藥性，并觀察到前兩種藥劑之間具有交叉抗藥性。與涕必靈之間有的有交互抗藥性，有的則不那么明顯。抑霉唑(R-23979)盡管與這三種藥劑屬同一系列藥劑，但也不具有交叉抗藥性。 本菌容易形成孢子，菌絲生長也快，所以很容易在含藥培養(yǎng)基上接種孢子或菌絲塊。通過測定菌落的生長進(jìn)行抗藥性測定。此外，采用果實測定在寄主上效果的方法也很容易進(jìn)行。96五 殺菌劑的抗藥性測定2 抗藥性測定方法：5）柑桔青霉病菌(Penicillium italicum)和綠霉病菌(Penicillium dijitatum) 已發(fā)