1、基因擴增與基因重排基因擴增與基因重排遺傳學遺傳學基因擴增的定義:基因擴增（gene amplification):細胞內某些特定基因的拷貝數專一性的增加,它是細胞在短期內為滿足某種需要而產生足夠基因產物的 一種調控手段。v為滿足正常的生長發育為滿足正常的生長發育 兩棲類和昆蟲的卵母細胞兩棲類和昆蟲的卵母細胞rRNA基因的擴增基因的擴增 果蠅濾泡細胞卵殼蛋白的基因擴增現象果蠅濾泡細胞卵殼蛋白的基因擴增現象v外界環境因素引起的基因擴增外界環境因素引起的基因擴增 藥物誘導抗藥性基因的擴增藥物誘導抗藥性基因的擴增 腫瘤細胞中原癌基因拷貝數異常增加腫瘤細胞中原癌基因拷貝數異常增加 許多致癌劑可誘導許多致

2、癌劑可誘導DNA擴增擴增體細胞體細胞rDNA500拷貝拷貝1.爪蟾卵細胞內的rRNA(rDNA)的擴增 注：注： rDNA：基因組中編碼核糖體RNA（rRNA）分子的對應的DNA序列。 rRNA：rDNA的轉錄產物，它是構成核糖體的重要成分，核糖體由許多小的rRNA分子組裝而成。卵細胞卵細胞rDNA約約2000000拷貝真核細胞真核細胞rRNA基因為串聯重復序列基因為串聯重復序列:由由18S、5.8S和和28SrRNA基因組成一個轉錄單位基因組成一個轉錄單位,彼此間隔分開彼此間隔分開,重復單位之間的間隔重復單位之間的間隔DNA序列不轉序列不轉錄錄.由于間隔區中的串聯重復次數不同，由于間隔區中的

3、串聯重復次數不同，因此，不同間隔區的長短差異很大。因此，不同間隔區的長短差異很大。020406080100120一月二月三月四月亞洲區歐洲區北美區 生物生物 重復單位長度重復單位長度非轉錄間隔區長度非轉錄間隔區長度 轉錄區長度轉錄區長度 釀酒酵母 黑腹果蠅 非洲爪蟾 小鼠 8950 1150014200 1050013500 4400 1750 37506450 23005300 30000 7200 7750 7875 13400 rRNA基因簇串聯重復單位的不同長度基因簇串聯重復單位的不同長度單位：bp 5SrRNA基因在基因組中呈串聯重復排列成基因簇?；蛟诨蚪M中呈串聯重復排列成基因簇

4、。5S基基因因與非轉錄間隔區相間排列，組成一個重復單位。在爪蟾體細與非轉錄間隔區相間排列，組成一個重復單位。在爪蟾體細胞中胞中5SrRNA基因約有基因約有500拷貝，而在卵細胞中拷貝，而在卵細胞中5S基因可重基因可重復復20000多次。這大概是為了和卵細胞中大量擴增的多次。這大概是為了和卵細胞中大量擴增的28S和和18S基因相統一?；蛳嘟y一。5SrRNA基因沒有基因擴增現象基因沒有基因擴增現象rDNA的擴增的擴增 rDNA是采用是采用滾環式復制滾環式復制方式在核仁區進行的方式在核仁區進行的擴增，擴增產生的新擴增，擴增產生的新rDNA不納入線形染色體不納入線形染色體中，而是一環狀小中，而是一環

5、狀小DNA分子方式存在。分子方式存在。滾環式復制：雙鏈DNA環狀分子先在一條單鏈的復制起點上產生一個切口(nick)，然后以另一條單鏈為模板不斷地合成新的單鏈。釋放出的新合成的單鏈或是先復制成雙鏈DNA，被酶切割成單位長度后，再形成環狀雙鏈DNA分子；或是釋放出的新合成的單鏈DNA，先被酶切割成單位長度形成單鏈環狀DNA分子后再復制成雙鏈環狀DNA分子。 果蠅在卵巢成熟之前，卵巢顆粒細胞中的卵殼蛋白基因被擴增。果蠅的卵母細胞經過4次分裂，形成1個卵母細胞和15個營養細胞（為卵母細胞提供蛋白質及其它營養）。營養細胞通過胞漿橋與卵細胞相連，使營養物質順利進入正在增大的卵細胞。多次特殊的DNA復制，

6、卵殼蛋白等基因拷貝數顯著增加。2. 果蠅濾泡細胞卵殼蛋白的基因擴增現象果蠅濾泡細胞卵殼蛋白的基因擴增現象DNA不切離的多次擴增形成復制泡的網狀結構不切離的多次擴增形成復制泡的網狀結構外界環境因素引起的基因擴增外界環境因素引起的基因擴增1.在培養的動物細胞中在培養的動物細胞中,已知對雙氧葉酸還原酶已知對雙氧葉酸還原酶(DHFR)的抑制劑甲氨蝶呤的抑制劑甲氨蝶呤(methotrexate)具有耐藥性的細具有耐藥性的細胞胞,其其dhfr基因增加達基因增加達1000個拷貝個拷貝,這已使用于對基這已使用于對基因擴增機制的分析等因擴增機制的分析等.2.細胞受到藥物攻擊后細胞受到藥物攻擊后,為抵抗藥物作用為

7、抵抗藥物作用,需產生抗性需產生抗性基因的產物基因的產物去破壞它去破壞它,最直接有效的辦法是大量最直接有效的辦法是大量增加增加抗性基因的數目抗性基因的數目,使抗性基因的產物隨之大量增加使抗性基因的產物隨之大量增加.v基因擴增是基因表達增加的一種重要機理。v基因擴增與抗藥性有關。基因重排v定義:DNA分子的核苷酸序列的重新排布,序列的重排可形成新的基因,還可調節基因的表達.通過基因的轉座，DNA的斷裂錯接而使正?；蝽樞虬l生改變。 基因重排v 定向重排與變換v非定向重排定向重排與變換定向重排可使一個基因從遠離其啟動子的位置移到啟動子附近位點而被啟動?；虮磉_的變換環境條件引起的基因變化小鼠免疫球蛋

8、白結構基因的表達當免疫細胞分化時，當免疫細胞分化時，染色體定向重排染色體定向重排把把3個遠離的基因連在一起，個遠離的基因連在一起，因因由于由于V、C、J基因的不同組合造成了抗體的多樣性?；虻牟煌M合造成了抗體的多樣性?；虮磉_的變換 由于DNA片段缺失片段缺失使調控區和新基因受體連連接成新調控啟動基因接成新調控啟動基因，使原來無活性基因轉變為有活性。（如（如酵母細胞性別的轉換酵母細胞性別的轉換）酵母菌的生活周期酵母菌的生活周期 a單倍體 a單倍體 a單倍體 單倍體單倍體單倍體 a / 二倍體M A T aM A T aM A T M A T M A T aM A T aM A T M A T

9、 a 因子 因子受體受體性因子與受體接合接合二倍體形成子囊形成酵母菌的生活史和細胞特征酵母菌的生活史和細胞特征v1. 酵母菌的生活史和細胞特征酵母菌的生活史和細胞特征 單倍體細胞單倍體細胞 二倍體細胞二倍體細胞 單倍體細胞單倍體細胞v2. 酵母的接合型轉換酵母的接合型轉換 a細胞細胞 細胞細胞 細胞細胞 a細胞細胞v3. 酵母細胞接合型決定因子基因結構及表達酵母細胞接合型決定因子基因結構及表達 HML, HMR, MAT, HO; 信號傳遞和調控基因信號傳遞和調控基因v4. 酵母接合型轉換模型酵母接合型轉換模型-磁帶模型磁帶模型 活動磁帶盒和沉默磁帶盒活動磁帶盒和沉默磁帶盒 接合型控制的幾種活

10、性接合型控制的幾種活性 酵母接合型轉換模型酵母接合型轉換模型-磁帶模型磁帶模型S l ie n t c a s s e t t eA c ti v e c a s s e t t eS l ie n t c a s s e t t eF r e q u e n tF r e q u e n tH M LM A TH M RaaH M LM A TH M RaH M LM A TH M RaaH M LM A TH M RaaHML和和HMR兩個基因貯存了兩種接合型等位基因，兩個基因貯存了兩種接合型等位基因，當轉座當轉座給給MAT基因座時就發生了接合型的轉換?；蜃鶗r就發生了接合型的轉換。因此，

11、因此，MAT基因座基因座是通過轉座而轉換其接合型的。是通過轉座而轉換其接合型的。MAT基因座的序列轉換成另基因座的序列轉換成另一個基因的序列，一個基因的序列， 非定向重排非定向重排 例如轉座子在染色體上的移動，轉座子的插例如轉座子在染色體上的移動，轉座子的插入可激活或抑制某些基因。如順向末端重復入可激活或抑制某些基因。如順向末端重復序列的轉座可能導致某些片段的缺失而使啟序列的轉座可能導致某些片段的缺失而使啟動子鄰近結構基因而使其轉錄。動子鄰近結構基因而使其轉錄。 環境因素也引起基因重排環境因素也引起基因重排 改變環境溫度、水分和改變環境溫度、水分和pH等條件，可使植物等條件，可使植物改變了的表

12、型得到遺傳。環境引起的穩定變改變了的表型得到遺傳。環境引起的穩定變異很可能起因于某些異很可能起因于某些DNA序列的不等復制、序列的不等復制、不等變換或某些染色體外因子導致的基因重不等變換或某些染色體外因子導致的基因重排。排。總結總結v基因重排重排廣泛存在于動物、植物和微生物的體基因重排重排廣泛存在于動物、植物和微生物的體細胞基因組中細胞基因組中;v基因重排可能導致基因重排可能導致DNA順序的變化，順序的變化，DNA的擴增、的擴增、丟失或修飾；丟失或修飾；v基因重排可能產生新基因，用于特定環境中的表達，基因重排可能產生新基因，用于特定環境中的表達，如動物的免疫球蛋白；如動物的免疫球蛋白；v基因重

13、排可能是改變已有基因的表達模式，用于調基因重排可能是改變已有基因的表達模式，用于調控其他基因的表達。控其他基因的表達。DNA重排技術DNA重排又叫有性重排又叫有性PCR、分子雜交等、分子雜交等,是一種反復是一種反復性突變、重組過程性突變、重組過程,它是它是將一組緊密相關的核酸序列將一組緊密相關的核酸序列隨機片段化隨機片段化,這些片段通過自配對這些片段通過自配對PCR或重組裝或重組裝PCR延伸延伸,最后組裝成一個完整的全長核酸序列最后組裝成一個完整的全長核酸序列,在在這個過程中就引入了突變并進行了重組這個過程中就引入了突變并進行了重組,這樣通過這樣通過核酸序列的迅速進化核酸序列的迅速進化,就可提

14、高核酸序列或其編碼就可提高核酸序列或其編碼的蛋白的功能。的蛋白的功能。DNA重排技術步驟v目的目的DNA片段的獲得片段的獲得v隨機片段化隨機片段化v重組裝重組裝PCR/無引物無引物PCRv篩選或選擇篩選或選擇基因重排技術的應用v單基因的定向改造；單基因的定向改造；v序列相關基因的重排；序列相關基因的重排；v生物代謝途徑的改造；生物代謝途徑的改造；v對整個基因組的改造對整個基因組的改造利用利用DNA重排技術已經成功地對許多單基因重排技術已經成功地對許多單基因如工業用酶、抗體以及一些重要蛋白等進行如工業用酶、抗體以及一些重要蛋白等進行了定向改造了定向改造,使酶活性、底物特異性以及抗體使酶活性、底物

15、特異性以及抗體親和性、蛋白的功能、熱穩定性等得到了明親和性、蛋白的功能、熱穩定性等得到了明顯提高顯提高,DNA重排既可以對單一代謝途徑進行優化重排既可以對單一代謝途徑進行優化,又又可以同時對多個代謝途徑進行組合性改造可以同時對多個代謝途徑進行組合性改造,形形成多樣性的合成途徑成多樣性的合成途徑,導致生物小分子多樣性導致生物小分子多樣性的出現的出現,產生產生“非天然非天然”的天然小分子文庫的天然小分子文庫,用用于先導化合物的篩選于先導化合物的篩選展望DNA重排目前已經可以在單一基因、單一代謝途徑甚至整重排目前已經可以在單一基因、單一代謝途徑甚至整個基因組等各個層面用于體外進化個基因組等各個層面用于體外進化,如果與合適的選擇或篩選如果與合適的選擇或篩選壓力結合壓力結合,將在多方面特別是醫藥方面得到廣泛應用。如用將在多方面特別是醫藥方面得到廣泛應用。如用于于DNA序列的改造序列的改造,可以提供更好的可以提供更好的DNA疫苗、蛋白表達、疫苗、蛋白表達、基因治療、轉基因載體基因治療、轉基因載體;用于特定蛋白的改造用于特定蛋白的改造,可以提供特異可以提供特異性