1、基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序知識點一：知識點一：1 1原核細胞的基因結構原核細胞的基因結構非編碼區非編碼區非編碼區非編碼區編碼區編碼區與與RNARNA聚合酶結合位點聚合酶結合位點啟動子啟動子終止子終止子啟動子：啟動子：是一段有特殊結構的是一段有特殊結構的DNADNA片段，片段，位于基因首端位于基因首端是是RNARNA聚合酶識別和結合的部位并能聚合酶識別和結合的部位并能驅動基因轉錄驅動基因轉錄出出mRNAmRNA。沒有啟動子，基因就不能轉錄。沒有啟動子，基因就不能轉錄。終止子：終止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片斷，它能片斷，它能阻礙阻礙RN

2、ARNA聚合酶的移動，并使其從聚合酶的移動，并使其從DNADNA模板鏈上脫離下來，模板鏈上脫離下來，使轉錄終止使轉錄終止。不能轉錄不能轉錄為信使為信使RNARNA，不能不能 編碼編碼蛋白質。蛋白質。：能轉錄能轉錄相應的信使相應的信使RNARNA，能能 編碼編碼蛋白質蛋白質 編碼區編碼區非編碼區非編碼區原核原核細胞細胞的的 基因基因結構結構有調控序列，最重要的是有調控序列，最重要的是RNARNA聚合酶結合位點。聚合酶結合位點。非編碼區非編碼區非編碼區非編碼區編碼區編碼區編碼區上游編碼區上游 編碼區下游編碼區下游 啟動子啟動子終止子終止子編碼區編碼區非編碼區非編碼區非編碼區非編碼區內含子內含子 外

3、顯子外顯子 啟動子啟動子終止子終止子知識點一：知識點一：2 2真核細胞的基因結構真核細胞的基因結構真核真核細胞細胞的的 基因基因結構結構編碼區編碼區非編碼區非編碼區外顯子：能編碼蛋白質外顯子：能編碼蛋白質內含子：不內含子：不能編碼能編碼蛋白質的序列蛋白質的序列與原核細胞相同與原核細胞相同非編碼序列：非編碼序列：包括非編碼區和內含子包括非編碼區和內含子原核細胞與真核細胞的基因結構比較原核細胞與真核細胞的基因結構比較思考思考編碼相同數目氨基酸的蛋白質，原核編碼相同數目氨基酸的蛋白質，原核細胞與真核細胞基因結構一樣長嗎？細胞與真核細胞基因結構一樣長嗎？連續連續不連續不連續編碼區編碼區非編碼非編碼2

4、2基因基因表達載體的構建表達載體的構建3 3將目的基因導入受體細胞將目的基因導入受體細胞4 4目的基因的檢測與鑒定目的基因的檢測與鑒定目的基因的獲取目的基因的獲取閱讀課本第一自然段，回答以下問題：閱讀課本第一自然段，回答以下問題：2 2獲取目的基因的常用方法有哪些？獲取目的基因的常用方法有哪些？（1 1）從基因文庫中獲取）從基因文庫中獲取（2 2）利用）利用PCRPCR技術擴增技術擴增（3 3）人工合成）人工合成1 1什么叫目的基因？并舉例說明。什么叫目的基因？并舉例說明。主要是編碼蛋白質的基因，也可以是一些主要是編碼蛋白質的基因，也可以是一些具有調控作用的因子具有調控作用的因子（一）從基因文

5、庫中獲取目的基因（一）從基因文庫中獲取目的基因1.基因文庫：基因文庫：概念見課本概念見課本2.基因文庫的分類基因文庫的分類:按外源按外源DNA片段的來源分類片段的來源分類種種類類基因組文庫：基因組文庫：含有一種生物的含有一種生物的全部全部基因基因部分基因文庫：部分基因文庫：只包含了一種生物的只包含了一種生物的部分部分基因，基因， 如：如：cDNA文庫文庫3.基因文庫的目的基因文庫的目的為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。需的目的基因。提取某種生物的全部提取某種生物的全部DNADNA用適當的限制酶切用適當的限制酶切一定大小的一定大小的

6、DNADNA片段片段將將DNADNA片段與載體連接片段與載體連接導入受體菌中儲存導入受體菌中儲存基因組文庫基因組文庫單鏈互補單鏈互補DNADNA雙鏈雙鏈cDNAcDNA片段片段導入受體菌中儲存導入受體菌中儲存與載體連接與載體連接cDNAcDNA文庫文庫反（逆）轉錄酶反（逆）轉錄酶DNADNA聚合酶聚合酶（2 2）反轉錄法：）反轉錄法：cDNAcDNA的合成流程圖解的合成流程圖解某種生物的單鏈某種生物的單鏈mRNAmRNA思考：思考：基因組文庫和部分基因文庫（如基因組文庫和部分基因文庫（如cDNA）的關系？）的關系？2 2基因組文庫和基因組文庫和cDNAcDNA文庫的比較文庫的比較3 3小小大大

7、無無有有無無有有某種生物的部分某種生物的部分基因基因某種生物的全部某種生物的全部基因基因可以可以部分基因可以部分基因可以2 2利用利用PCRPCR擴增目的基因（閱讀課本第擴增目的基因（閱讀課本第1010頁回答問題）頁回答問題）（1 1）RCR RCR 的中文全稱？的中文全稱？PCRPCR是一項什么樣的技術？是一項什么樣的技術？（2 2）PCRPCR原理？利用這一技術獲取目的基因的前提？原理？利用這一技術獲取目的基因的前提？（3 3）PCRPCR的過程？這一過程利用了什么酶？的過程？這一過程利用了什么酶？（4 4）通過）通過PCRPCR使目的基因的數目如何增長？使目的基因的數目如何增長？ 概念：

8、概念：PCRPCR全稱為全稱為_，是一項，是一項 在生物在生物_復制復制_的核酸合成技術的核酸合成技術 條件：條件：原理：原理：方式：以方式：以_方式擴增，即方式擴增，即_（n n為擴增循為擴增循 環的次數）環的次數）結果：結果：聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應體外體外特定特定DNADNA片段片段DNADNA復制復制四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸 熱穩定熱穩定DNADNA聚合酶聚合酶指數指數2 2n n在短時間內大量擴增目的基因在短時間內大量擴增目的基因前提：前提：一對引物、一對引物、 模板模板DNADNA（含目的基因）（含目的基因）過程：過程：A ADNADNA變性變性（90-9590-95）：雙

9、鏈）：雙鏈DNADNA模板模板 在熱作用下，在熱作用下，_斷裂，形成斷裂，形成_B B退火退火（復性復性55-6555-65）：系統溫度降低，）：系統溫度降低， 引物與引物與DNADNA模板模板結合，形成局部結合，形成局部_。 C C延伸延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，酶的作用下， 合成與模板互補的合成與模板互補的_。 氫鍵氫鍵單鏈單鏈DNADNA雙鏈雙鏈DNADNA鏈鏈5 5/ /3 3/ /G GG GT TC C3 3/ /5 5/ /A AG GC CC C5 5/ /3 3/ /引物引物G GG G變性變性復性復性延伸延伸1 1變性變性(9(90 095

10、 )95 )：目的基因：目的基因DNADNA受熱變性，解鏈為受熱變性，解鏈為單鏈；單鏈；2 2復性（復性（5 55 560 60 ）：引物與兩條單鏈通過堿基互）：引物與兩條單鏈通過堿基互補配對原則結合；補配對原則結合；3 3延伸（延伸（707075 75 ）：在）：在TaqDNATaqDNA聚合酶的作用下，聚合酶的作用下，以以dNTPdNTP為原料，從引物的為原料，從引物的55端端33端延伸，合成與模端延伸，合成與模板互補的板互補的DNADNA鏈鏈 5 5/ /3 3/ /A AG G引物引物（二（二) )利用利用PC(RPC(R技術擴增目的基因技術擴增目的基因PCRPCR技術擴增與技術擴增與

11、DNADNA復制的比較復制的比較四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸模板、能量、酶模板、能量、酶DNADNA在高溫下變性解旋在高溫下變性解旋解旋酶催化解旋酶催化體外復制體外復制細胞核內細胞核內熱穩定的熱穩定的DNADNA聚合酶聚合酶細胞內的細胞內的DNADNA聚合酶聚合酶大量的大量的DNADNA片段片段形成整個形成整個DNADNA分子分子( (二二) )利用利用PCRPCR技術擴增目的基因技術擴增目的基因小結小結目的基因的獲取目的基因的獲取目的基因的定義目的基因的定義常用常用方法方法從基因文庫從基因文庫中獲取中獲取利用利用PCRPCR技技術擴增術擴增人工合成人工合成基因組文庫基因組文庫部分基因文庫部分

12、基因文庫原理、條件原理、條件方式、結果方式、結果過程過程二、基因表達載體的構建二、基因表達載體的構建 核心核心1 1如何構建基因表達載體？如何構建基因表達載體？2 2基因表達載體構建的目的？基因表達載體構建的目的？3 3基因表達載體的組成？基因表達載體的組成？4 4啟動子、終止子、標記基因的作用分別是？啟動子、終止子、標記基因的作用分別是？讀教材回答以下問題讀教材回答以下問題1.1.用一定的用一定的_切割切割 質粒，使其出現一個切質粒，使其出現一個切 口，露出口，露出2.2.用用_切斷目切斷目 的基因，使其產生的基因，使其產生 核心核心3.3.將切下的目的基因片段插入質粒的將切下的目的基因片段

13、插入質粒的_處，處， 再加入適量再加入適量_，形成了一個重組，形成了一個重組 DNADNA分子（重組質粒）分子（重組質粒）限制酶限制酶黏性末端平末端黏性末端平末端同一種限制酶同一種限制酶切口切口DNADNA連接酶連接酶二基因表達載體的構建二基因表達載體的構建相同的黏相同的黏末端末端平末端。平末端。基因表達載體的組成：基因表達載體的組成：使目的基因在受體細胞中穩定存在，并使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發揮作用。能夠表達和發揮作用。目的基因目的基因啟動子啟動子終止子終止子標記基因標記基因目的：目的：位于基因的首端的一

14、位于基因的首端的一段特殊的段特殊的DNADNA片斷，它是片斷，它是RNARNA聚聚合酶識別和結合的部位，有了合酶識別和結合的部位，有了它才能它才能驅動基因轉錄出驅動基因轉錄出mRNAmRNA，最終獲得蛋白質最終獲得蛋白質位于基因的尾端的一位于基因的尾端的一段特殊的段特殊的DNADNA片斷，片斷，能終止能終止mRNAmRNA的轉錄的轉錄的作用是的作用是為了為了鑒別鑒別受受體細胞中是否含有目的基因，體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選從而將有目的基因的細胞篩選出來出來 通讀教材回答問題通讀教材回答問題1轉化的概念轉化的概念2將目的基因導入植物、動物、微生物細胞將目的基因導入植物、動

15、物、微生物細胞的方法分別有哪些？的方法分別有哪些？（一）轉化：（一）轉化： （二）方法（二）方法將目的基因導入將目的基因導入植物細胞植物細胞將目的基因導入將目的基因導入動物細胞動物細胞將目的基因導入將目的基因導入微生物細胞微生物細胞農桿菌轉化法農桿菌轉化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法顯微注射法顯微注射法感受態細胞感受態細胞目的基因進入目的基因進入_內，并且在內，并且在 受體細胞內維持受體細胞內維持_和和_的過程的過程受體細胞受體細胞穩定穩定表達表達易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數單子葉植物沒有感染能力。數單子葉植物沒有感染能力。原理：原理：Ti

16、質粒上的質粒上的T-DNA可以轉移可以轉移到受體細胞，并整合到受體細胞染色到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的體的DNA上。上。仔細閱讀課本將目的基因導入植物細胞仔細閱讀課本將目的基因導入植物細胞（1 1）將目的基因導入植物細胞采用最多的方法是？）將目的基因導入植物細胞采用最多的方法是？（2 2）農桿菌如何感染植物細胞？）農桿菌如何感染植物細胞？（3 3）農桿菌的）農桿菌的TiTi質粒中有何特點？質粒中有何特點？（4 4）若用農桿菌轉化法應選用什么作為運載體？將目）若用農桿菌轉化法應選用什么作為運載體？將目的基因插入運載體的什么部位？此時的農桿菌是受體細的基因插入運載體的什么部位？此時的農桿菌

17、是受體細胞嗎？胞嗎？（5 5）獲得含有目的基因的受體細胞后如何獲得具有新）獲得含有目的基因的受體細胞后如何獲得具有新性狀的植物體？原理？性狀的植物體？原理？（6 6）農桿菌轉化法和基因槍法分別適用于什么生物？）農桿菌轉化法和基因槍法分別適用于什么生物？過程：過程：優點：優點：穩定、經濟、有效穩定、經濟、有效將外源目的基因插入將外源目的基因插入TiTi質粒質粒的的T-DNAT-DNA中形成重組中形成重組TiTi質粒質粒將重組將重組TiTi質粒質粒轉入農桿菌轉入農桿菌使含重組使含重組TiTi質粒的農質粒的農桿菌感染植物細胞桿菌感染植物細胞含目的基因含目的基因的植物細胞的植物細胞表現出新性狀的植株表

18、現出新性狀的植株（2）基因槍法基因槍法（3）花粉管通道法花粉管通道法2 2將目的基因導入動物細胞將目的基因導入動物細胞方法：顯微注射法方法：顯微注射法程序：程序：目的基因表達載體提純目的基因表達載體提純 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 顯微注射顯微注射 受精卵受精卵 新性狀動物新性狀動物3 3將目的基因導入微生物細胞將目的基因導入微生物細胞閱讀課本：早期基因工程為何選擇原核閱讀課本：早期基因工程為何選擇原核生物作為受體細胞？方法？生物作為受體細胞？方法？原核生物特點：繁殖快、單細胞、遺傳物質原核生物特點：繁殖快、單細胞、遺傳物質少少方法：方法： 用用Ca2+處理細胞處理細胞 感受態細胞感受態細胞

19、 表達表達載體與感受態細胞混合載體與感受態細胞混合 感受態細胞吸感受態細胞吸收收DNA分子分子1 1獲取目的基因的常用方法、獲取目的基因的常用方法、PCRPCR技術的原理、條件、技術的原理、條件、過程、方式、結果。過程、方式、結果。2 2人工合成目的基因的方法及過程。人工合成目的基因的方法及過程。3 3構建基因表達載體的目的、基因表達載體的組成及構建基因表達載體的目的、基因表達載體的組成及各組成部分的作用。各組成部分的作用。4 4基因表達載體的構建過程？將目的基因導入植物、基因表達載體的構建過程？將目的基因導入植物、動物、微生物細胞的方法分別是什么？動物、微生物細胞的方法分別是什么？5 5農桿

20、菌轉化法的原理（即農桿菌轉化法的原理（即TiTi質粒的質粒的T-DNAT-DNA的作用特的作用特點）、適用范圍。點）、適用范圍。6 6敘述用農桿菌轉化法將目的基因導入受體細胞的過敘述用農桿菌轉化法將目的基因導入受體細胞的過程。程。復習（復習（15分鐘后黑板展示）分鐘后黑板展示）閱讀課本：目的基因的檢測與鑒定閱讀課本：目的基因的檢測與鑒定 目的基因檢測的過程分為哪幾步？分別用目的基因檢測的過程分為哪幾步？分別用什么方法？什么方法？ 鑒定（個體生物學水平）方法？鑒定（個體生物學水平）方法？四、目的基因的檢測與鑒定四、目的基因的檢測與鑒定 檢測檢測（分子檢測）（分子檢測） 鑒定鑒定（個體生物學水平）

21、（個體生物學水平）檢測目的基因是否翻譯成蛋白質檢測目的基因是否翻譯成蛋白質抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等檢查是否成功檢查是否成功檢測目的基因是否轉錄出了檢測目的基因是否轉錄出了mRNA檢測轉基因生物染色體的檢測轉基因生物染色體的DNA 上是否插上是否插 入了目的基因入了目的基因檢測轉基因生物染色體的檢測轉基因生物染色體的DNA上是否插了上是否插了目的基因目的基因過程過程:A首先取出轉基因生物的基因組首先取出轉基因生物的基因組DNA。B對對含目的基因的含目的基因的DNA片段片段作放射性同位素作放射性同位素標記，以此做探針。標記，以此做探針。C使探針和轉基因生物的基因

22、組雜交使探針和轉基因生物的基因組雜交,若顯示若顯示出雜交帶，表明染色體已插入染色體出雜交帶，表明染色體已插入染色體DNA中。中。方法方法:DNA分子雜交分子雜交DNADNA分子雜交示意圖分子雜交示意圖 采用一定的技術手段，將兩種生物的采用一定的技術手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補的堿基序列，那么，互補的堿基序列就會結補的堿基序列，那么，互補的堿基序列就會結合在一起，形成雜合雙鏈區；在沒有互補堿基合在一起，形成雜合雙鏈區；在沒有互補堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。 目的基因的檢測示意

23、圖目的基因的檢測示意圖檢測目的基因是否轉錄出了檢測目的基因是否轉錄出了mRNA檢測目的基因是否翻譯成蛋白質檢測目的基因是否翻譯成蛋白質方法方法:分分 子子 雜雜 交交方法方法: 抗原抗體雜交抗原抗體雜交過程過程: 用上述探針和轉基因生物的用上述探針和轉基因生物的mRNA雜交，若出現雜雜交，若出現雜交帶，表明目的基因轉錄出了交帶，表明目的基因轉錄出了mRNA.鑒定鑒定 抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等例：用棉鈴飼喂棉例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現鈴蟲，如蟲吃后不出現中毒癥狀，說明未攝入中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基目的基因或攝入目的基因未表達。如蟲吃后

24、中因未表達。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達。抗蟲基因并得到表達。思考：若培育耐鹽堿的水稻，如何鑒定？思考：若培育耐鹽堿的水稻，如何鑒定？歸納： 基因工程的基本操作程序 獲取目的基因獲取目的基因u從基因文庫從基因文庫u利用利用PCRPCRu化學方法人工合成化學方法人工合成 構建基因表達載體構建基因表達載體u目的基因、啟動子、終止子、標記基因目的基因、啟動子、終止子、標記基因 將目的基因導入受體細胞將目的基因導入受體細胞u農桿菌轉化法、顯微注射法農桿菌轉化法、顯微注射法 目的基因的檢測與鑒定目的基因的檢測與鑒定u檢測：是否插入、轉錄、翻譯檢測：是否插入、轉錄、

25、翻譯u鑒定：鑒定：學以致用學以致用若用若用Bt毒蛋白基因作為目的基因培育轉毒蛋白基因作為目的基因培育轉基因抗蟲棉，可用什么方法？敘述培育過程！基因抗蟲棉，可用什么方法？敘述培育過程！練習：為擴大可耕地面積，增加糧食產量，練習：為擴大可耕地面積，增加糧食產量，黃河三角洲等鹽堿地的開發利用備受關注。我黃河三角洲等鹽堿地的開發利用備受關注。我國科學家應用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品國科學家應用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。系。（）獲得耐鹽基因后，構建重組（）獲得耐鹽基因后，構建重組DNA分子所分子所用的限制性內切酶作用于圖中的用的限制性內切酶作用于圖中的 處，處，DNA連接酶作用于連接酶作用于 處。（填處。（填“a”或或“b”）aa（）將重組（）將重組DNA分子導入水稻受體細胞