1、.高效液相色譜法分析黃秋葵多糖的單糖組成裘雅漁1 李巧玲1 程和勇2(1浙江大學化學系，浙江 杭州310027；2 杭州師范大學材料系，浙江 杭州 310058)摘要：采用高效液相 (HPLC-RID)色譜法，建立了7種常見單糖的分離模式，并成功地用于黃秋葵多糖的單糖組成分析，具有良好的重復性。結果表明，黃秋葵多糖由木糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、果糖、半乳糖及阿拉伯糖7種單糖組成，其摩爾比為0.57：1.00：0.53：3.50：1.75：1.25：1.70，該HPLC-RID方法是簡單、快速、靈敏、方便的分析技術，可用于黃秋葵多糖的質量控制。關鍵詞：黃秋葵多糖，單糖組成，高效液相色譜文章分類

2、號：O65。Analysis of Monosaccharide Composition in Okra Polysaccharides by High Performance Liquid ChromatographyQIU Ya-yu1，LI Qiao-ling1，CHENG He-yong2(1 Department of Chemistry，Zhejiang University , Hangzhou ,310027 China;2 Department of Materials，Hangzhou Normal University , Hangzhou ,310058 China)A

3、bstract :The high performance liquid chromatographic(HPLC) method ofwas developed to separate the traditional seven monosaccharides and detect the monosaccharide composition of Okre polysaccharides with good reproducibilityIn this study，it was found that sulfuric acid and trifluoroacetic acid posses

4、sed the same ability for hydrolyzing Okra polysaccharides and the component monosaccharides were completely released from the polysacchaides until hydrolyzing for 8 hand the whole drying processes of the acid hydrolysates could be omitted The results of HPLC analysis showed that Okra polysaccharides

5、 consisted of xylose, mannose，rhamnose，glucose，fructose，galactose and arabonose with the molar ratio of 0.57：1.00：0.53：3.50：1.75： 1.25：1.70The HPLC method is simple， rapid， sensitive， convenient and can be applied to th e quality control of Okra polysaccharidesKeywords: Okra polysaccharides，monosacc

6、haride composition， high perform ance liquid chromatography1 引言黃秋葵多糖是從黃秋葵嫩莢果中提取的水溶性成分，藥理學研究表明, 嫩莢果中含有特殊香氣和風味的粘滑汁液，這種粘滑汁液是由水溶性纖維果膠、半乳聚糖和阿拉伯樹膠等組成，具有神奇的功能，這種粘滑汁液即是粘蛋白1,具有保護腸胃、肝臟和皮膚粘膜作用2。并有治療胃炎、胃潰瘍等疾病的效果3；這種粘液蛋白還能刺激中樞神經，加速血液循環及促進新陳代謝和全身血管活化4，可防治因血管供血不足造成的心臟病、中風、骨質疏松及老年癡呆等疾病5。而多糖的單糖組成測定是控制多糖質量標準和提供多糖基本信息

7、的最重要環節69。因單糖存在互變異構體、差向異構體、結構相似等特征1012，而且往往同一待測樣品，如多糖、寡糖、糖肽、糖蛋白等，可能含有許多類型的單糖13,14。所以，單糖分析有其自身的特點，必須具有高效的分離技術，方可實現系列單糖的有效分離。本研究采用高效液相滲透色譜方法，用示差折光檢測器和磺化的聚苯乙烯二乙烯基苯陽離子交換樹脂（Pb2+）柱（交聯度為6%），建立適于黃秋葵多糖單糖組成測定的HPLC新方法，達到靈敏、快速、準確、方便和可在線大批量分析的目標。2 實驗部分2.1 儀器和試劑WATERS 2690液相色譜儀(美國WATERS 公司)；PRE-PACKED COLUMN RT PO

8、LYSPHER CH PB 分析糖柱(德國MERCK公司)；旋轉蒸發儀(瑞士BUCHI公司)；EZDRY冷凍干燥機(美國Filter公司)。三氟乙酸(TFA，Merck公司)；甲醇(色譜純，天津市科密歐化學試劑)；乙腈(TEDIA公司)；葡萄糖(Glc)、阿拉伯糖(Ara)、甘露糖(Man)、半乳糖(Ga1)、鼠李糖(Rha)、木糖 (Xy1)、果糖（FRU），丙三醇（Gly）均購自Sigma公司。其它試劑均為分析純。黃秋葵多糖由本教研室制備2.2 黃秋葵多糖水解精確稱取黃秋葵多糖樣品20.0 mg于安瓿中，分別加入2 mol·L-1 TFA、2 mol·L-1 H2SO4

9、以及其混酸溶液2.0 mL，充氮氣封管，110油浴分別水解2、4、6、8和10 h。冷卻至室溫，反應混合物1000 r·min-1離心5 min，取上清液用0.3mol·L-1 NaOH溶液中和到約pH 7.0。2.3 HPLC分析方法采用WATERS 2690色譜系統,WATERS 2410 示差折光檢測器，檢測器溫度40；柱溫為40；流速0.6 mL·min-1；流動相：去離子水，進樣體積50µL 。2.4 分析原理與方法2.4.1 定量校正因子 以Gly(丙三醇)為內標，測定7種單糖的定量較正因子( fVs)。精密稱取各標準單糖并配制成2 mmol

10、·L-1的母液，用時稀釋為5個不同濃度的單糖溶液，并進行HPLC分析 (線性范圍在110mmol之間)。2.4.2 相關系數與回歸方程以單糖的濃度X ( WiWs)與峰面積Y(AiAs)作圖，得回歸方程與相關系數。求出各單糖的斜率 b，即定量較正因子f0 fVs=(WiWs )(AiAs)Ai ，As分別為Gly(丙三醇)和標準單糖的HPLC峰面積。2.4.3 摩爾比的計算以Gly(丙三醇)為內標，得到各單糖的峰面積與內標的峰面積比，乘以f/M ( M為單糖的分子量)，所得的值之比為摩爾比，即：RVs = fVs (AiAs)/M .3 結果與討論3.1 單糖對照品的HPLC分離為實

11、現黃秋葵多糖各組成單糖的高效分離，本實驗對黃秋葵多糖可能包含的葡萄糖(Glc)、阿拉伯糖(Ara)、甘露糖(Man)、半乳糖(Ga1)、鼠李糖(Rha)、木糖 (Xy1)、果糖（FRU）)等7種標準單糖及內標Gly(丙三醇)的高效液相色譜分離條件進行了優化。結果表明，在2.5mM 醋酸水溶液，5mM醋酸水溶液 和 去離子水三者之間選擇，在去離子水當中的分辨率高，分離效率最好，平且樣品容量大，因此去離子水為分離此7種單糖的較理想色譜分離條件。色譜峰的各峰保留時間依次為內標Gly(丙三醇),葡萄糖(Glc)、阿拉伯糖(Ara)、甘露糖(Man)、半乳糖(Ga1)、鼠李糖(Rha)、果糖（FRU）以

12、及木糖 (Xy1)如圖3(a)所示。其中，內標Gly(丙三醇)與其它單糖有很好的分離，其作為內標是合適的。 圖1 黃秋葵多糖水解樣品經干燥過程(a)和無干燥過程(b)對單糖組成測定結果的影響Fig1 The chromatogram of okra polysaccharide hydrolysates with drying(a)and without drying process(b)3.2 多糖水解樣品制備條件優化多糖水解樣品的制備通常要經復雜的干燥過程，方可進行下一步的分析。本樣品制備方法省略干燥過程，而將多糖水解液直接用NaOH中和(約中性)，這對于發展多糖的定性定量在線分析技術有重

13、要的實際意義。該制備方法的特點是：(1)簡化工藝、避免干燥損失。(2)該多糖水解樣品制備過程對多糖的組成測定無影響。圖1是黃秋葵多糖經TFA水解后，水解液經傳統的干燥過程和未經干燥過程的HPLC圖，圖中未發現有明顯吸收峰改變。(3)對多糖的含量、單糖組成等定量分析更有意義，因此過程幾乎無糖損失，多糖水解液可直接進行在線大批量分析監測。3.3 黃秋葵多糖樣品的單糖組成分析3.3.1 多糖水解時間對分析結果的影響考察了TFA的不同水解時間對黃秋葵多糖的組成測定結果的影響，結果如圖2所示。黃秋葵多糖隨水解時間的延長，測定的單糖摩爾比率增加，而在110用2 mmol·L-1 TFA水解8 h

14、后，水解已完全。可見，黃秋葵多糖經TFA水解8 h為其合適的水解時間。圖 2 黃秋葵多糖經TFA水解的時間對各組成單糖的測定影響Fig2 The effects of component monosaccharldes of Okra polysaccharides for different trifluoacetie acid (TFA) hydrolysis time3.3.2 不同酸水解對黃秋葵多糖的單糖組成測定的影響 選擇用于水解多糖的合適種類的酸對準確測定單糖組成非常重要。本研究考察了常用的TFA、H2 SO 4及其混酸等不同酸水解方法對黃秋葵多糖的組成測定結果的影響(圖3)。結果

15、表明，TFA和H2 SO4對黃秋葵多糖的水解效果無明顯影響，但TFA和H2 SO4混酸水解該多糖時，單糖測定結果有一定的變化，其原因尚不清楚。所以，本實驗選用TFA水解8 h為黃秋葵多糖的合適水解時間。圖3 黃秋葵多糖的不同酸水解樣品的色譜圖Fig3 HPLC separation of the diferently acid hydrolysates of Okra polysaceharidesa單糖標準品(monosaccharide standards)+丙三醇（GLY）；bTFA水解樣品(trifluoroacetic acid hydmlysates)；cH2SO4水解樣品(sul

16、furicacid hydrolysates)；dTFA和H2S04混酸水解樣品(hydmlysates of trifluoroacetlc acid and sulfuric acid)。1 葡萄糖(Glc)； 2阿拉伯糖(Ara) ； 3甘露糖(Man) ；4半乳糖(Ga1)； 5鼠李糖(Rha)； 6果糖（FRU）；7木糖 (Xy1)3.3.3 黃秋葵多糖的單糖組成測定結果 由HPLC分析和摩爾比計算結果可知，黃秋葵多糖由木糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、果糖、半乳糖及阿拉伯糖7種單糖組成，其摩爾比為0.57：1.00：0.53： 3.50：1.75：1.25：1.70，單糖測定的精密度(

17、RSD，n=3)均低于4.5 ，測定結果重復性良好。本研究通過凝膠滲透HPLC法，實現在普通實驗室常用示差折光檢測器和聚苯乙烯二乙烯基苯陽離子交換樹脂（Pb2+）糖柱分離分析黃秋葵多糖的單糖組成，并可望推廣用于其他多糖的單糖組成測定；同時，建立了黃秋葵多糖水解樣品的制備優化工藝，避免了傳統多糖水解產物的復雜干燥過程和進行繁瑣的衍生化反應；此外，該技術的完善將在食品糖含量控制、大輸液葡萄糖監測等領域有廣闊的應用前景，并為發展黃秋葵多糖以及其它多糖的在線定性定量HPLC方法奠定基礎。表1 黃秋葵多糖的組成測定結果Table 1 Analytical results of component mon

18、osaccharides of Okra polysaccharides峰 單糖 標準曲線 相關系數 相對峰面積 摩爾比率Peak Monosaccharides Stansard Curve r(n=5) Area(%) Ratio1 葡萄糖 y=0.5004x+0.1026 0.9972 26.4% 3.502 甘露糖 y=0.5061x+0.0811 0.9905 11.2% 1.003 半乳糖 y=0.5894x+0.0337 0.9979 11.7% 1.254 阿拉伯糖 y=0.4995x+0.1006 0.9954 16.3% 1.705 木糖 y=0.4169x+0.0087

19、0.9933 8.9% 0.576 果糖 y=0.4561x+0.0532 0.9991 17.9% 1.757 鼠李糖 y=0.5392x+0.0425 0.9989 7.6% 0.53參考文獻（References）1Katsutoshi H，Keiichiro E and Koji H. A convenient synthesis of lepidimoide fromokramucilage and its growth-promoting activity inhypocotylsJCarbohydrate Research，2004，339：9-192 ROM ANCHIK-CE

20、RPOVICE J E，TILMON R W ，BALDREE K A. Moisture remnfion and consumer acceptability of chocolate bar cookiesprepared with okra gum as a fat ingredient substituteJJournal of the Aencan Dietetic Assoeiation，2002，102(9)：1301- 13033 李建華，陳珊黃秋葵水提液抗疲勞的藥效學觀察J中國運動醫藥學雜志，2004，23(2)：1961974 李學智黃秋葵嫩莢的食用品質及貯藏的生理研究D杭州：浙江大學。20035 Sedat C，Musa O” ZC，Haydar H M Ugur Y A study on somephysicochemi cal properties of Turkey okra(Hibiscus esculentaL) seedsJJournal of Food Engineering，2005