1、核酸擴增檢測設計及工作流程臨床檢驗中心Tel.: 2014.9.11-14 長沙問題？l 核酸檢測到底要分多少個區？l 緩沖間有何作用？l 使用什么樣的生物安全柜？l “無l 核酸檢測是什么？”或“無核酸”概念？最有效的“防污染措施”血液標本的接收l 通常的工作流程：標本血清分離編號保存或檢測四個測定區域之外的地方或區域內接收l 接收的標本應收集在原始容器中ll 在核酸提取時帶入至標本區標本的接收區的儀器設備要求l 如果在標本接收區分離血清（漿）標本，有1臺分離血清（漿）用離心機、1臺生物安全柜、1臺冰箱、加樣器及相應經高壓處理的消耗品如帶濾芯吸頭、標本接收編號及記號筆等即可。本以l 如果不在

2、標本接收區分離血清（漿）標本，只是簡單的接收，則就不需要分離血清（漿）用離心機、生物安全柜、加樣器及其消耗品。設計A理想的核酸擴增產物分析區空氣流向 擴增區空氣流向標本區空氣流向試劑準備區空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間走廊工作流向設計B理想的核酸擴增產物分析區空氣流向 擴增區空氣流向標本區空氣流向試劑準備區空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間走廊工作流向核酸擴增檢測設計的一般原則(1)在物理空間上，必須是完全相互的，各l 各區區域無論是在空間還是在使用中，應始終處于完全的分隔狀態; (2)不能有空氣的直接相通。l 注意風向由清潔區域向污染區域l 因地制宜“十六字口訣”l 方便工作A門外走廊門B門門外走廊擴增

3、及產物 分析區標本區試劑準備區門門標本區擴增區門門產物分析區門試劑準備區門標本區空氣流向門擴 增 及 產物分析區空氣流向空氣流向試劑準備區門門擴增和產物分析區空氣流向其他試劑準備區空氣流向其他其他走廊走廊其他空氣流向標本區其他其他其他標本區空氣流向+門擴增及產物分析區空氣流向空氣流向+試劑準備區門門門擴增和產物分析區空氣流向+其他試 劑 準 備區空氣流向其他其他空氣流向走廊走廊其他空氣流向+標 本區其他其他其他產物分析區擴增區標本區試劑準備區傳遞窗傳遞窗傳遞窗空氣流向空氣流向空氣流向 空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間走廊工作流向核酸檢測設計“各區注意風向因地制宜方便工作”應根據空間大小。所采用的檢測

4、技術平臺和工作量來決定分區的多少及各區域的緩沖間的功能是“空氣的流向”。生物安全柜可考慮“A2”。產物分析區空氣流向擴增區空氣流向標本區空氣流向試劑準備區空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間走廊工作流向關于“區域”合并l 如使用擴增和產物分析同時完成的實時熒光PCR儀進行核酸擴增檢測，擴增區和產物分析以合并。l 如使用核酸提取、擴增及產物分析等均在一臺儀器上完成的全自動核酸檢測分析儀，標本區、擴增區和產物分析合并。“無”或“無核酸”概念的重要性！尊敬的您好！來信請教一個問題，具體情況是這樣的：我這兒使用的PCR儀是ABI 7300，用的是達安公司的HBV- DNA試劑，去年12月中旬的一次試：劉大夫：P

5、CR一旦出現嚴重污染，消除將會比較，通常可采用下述方法：（1）開窗;（2）采用次氯酸鈉溶液擦地面及實驗臺驗中發生了爆管，發生后， 處理，;（3）增長紫外面，甚至已經按照SOP規程進行了照射時間；（4）用75%乙醇空中噴霧，然后用于次氯酸鈉溶液擦地面及實驗臺面。上述措施每天都要進行，直至污染消除。不知你是否按上述方法進行？如沒有，你可以這樣試，并請將效果告訴我。到現在已經有半年了，可還是不能消除污染。PCR在三樓，現在即使加樣操作放在同一幢樓房的一，其余如混勻、離心等還放在原來的，擴增也對照孔所加在原來的對照，標本一樣處理（因此暴露在空氣中的時間很短），陰性對照有擴增，大約在21個循此外，在出現

6、嚴重污對照顯示的Ct環的時候開始，染后，如還要進行工作，則可臨時更換一個廠家試劑， 應就可以。約為26左右。請問這是什么，怎么處理才能消除污染。盼指點！劉X2013050820130508尊敬的：您好！我是上次您好！您所說的措施我向您請教PCR污染都實行過，只不過除外，如何清除的小劉，我們按照您的指點進行處理，現其余措施僅實施過很少幾次，我將按您所說措施處理一段時間再看看。另外，再請教兩個問題：（1）上述措施在污染已經完全清除，非常感謝！以后我們會更加注意操作的規范及相關知識的學習！要在三個進行嗎？（2）樓房第三層污染，在第一層操作怎么也會受到影響？您撥冗指教！劉X2013.7.1820130

7、508原來是在作怪2011年五大科學The Scientist符合基本要求的核酸擴增檢測的條件（1）試劑準備區、標本區和擴增及產物分析區等三l個或四個區域在物理空間上，必須是完全相互的，各區域無論是在空間還是在使用中，應始終處于完全的分隔狀態，不能有空氣的直接相通。（2）各區的可移動的儀器設備及各種物品包括實驗l本、記號筆、試管架及清潔用具等必須。（3）標本區、擴增及產物分析區等相對有可能l出現“污染物”的區域安裝排風扇或其它排風和有效的裝置，以使空氣按試劑準備區®標本區®擴增（及產物分析）區方向。核酸擴增的工作流程試劑準備區標本區擴增區及擴增產物分析區試劑貯存準備區l 核

8、酸擴增中最為“潔凈”的區域，不應有任何核酸的存在，包括試劑中所帶的標準品和陽性對照。l 所有實驗用潔凈物品如離心管、吸頭等的存放和準備處。l 商品試劑盒： 75%乙醇、焦碳酸二乙酯（DEPC）處理水、等可能需要自配試劑：一次較大量配制，然后分裝成小瓶保存，每次檢測時，取出一小瓶使用，未用完的即棄掉，不再使用。ll 儀器設備主樣器、天平、離心機和冰箱等，最好配備超凈工作臺。標本區儀器設備主要有設備、核酸提取儀、生物安l全柜、加樣器、高速臺式（冷凍）離心機、加熱模塊或水浴箱、冰箱等。生物安全柜不應放在實驗室門口等易受對分體式空調。走動影響的地方，也不應直主要是用于血液樣本的加樣器吸頭必須帶濾芯。、核酸樣本的提取。ll使用加熱模塊時，如在模塊砂，然后將標本管置于細砂中填入二氧化硅細，可得到較為l一致的溫度。擴增及產物分析區l 擴增反應體系的配制和提取核酸的加入，可在標本區也可在本區內進行，關鍵是要防止產物的污染。如果空間區域內進行。的話，也可在一個的l 加樣時，先加提取的核酸模板樣本，每加完一個即標本蓋子，然后加陽性質控核酸模板，再就是質控和僅含按樣本一樣稀釋的主反應混合液的擴增質控，這樣做的目的是，最大可能地測出以前擴增產物的交叉污染。擴增及產物分析區l 熱循環儀的電源應