1、沙門菌效應蛋白對宿主細胞的影響及分子機制   本文關鍵詞：    本文簡介：摘要：沙門菌（Salmonellaspp.）作為胞內病原菌，通過侵入宿主細胞，導致人類和多種動物感染疾病。在與宿主細胞的長期斗爭中，沙門菌進化出多種機制來逃避宿主的監視與防御，從而完成侵入并生存增殖的過程。盡管一些效應蛋白靶向的宿主因子已經被發現，但大多數效應蛋白的靶點尚且未知。本文綜述了沙門菌效應    本文內容：   摘要：沙門菌 （Salmonella spp.） 作為胞內病原菌， 通過侵入宿主細胞， 導致人類和多種動物感染疾病。在與

2、宿主細胞的長期斗爭中， 沙門菌進化出多種機制來逃避宿主的監視與防御， 從而完成侵入并生存增殖的過程。盡管一些效應蛋白靶向的宿主因子已經被發現， 但大多數效應蛋白的靶點尚且未知。本文綜述了沙門菌效應蛋白對宿主細胞生理活動的影響， 包括對細胞骨架的變化， 炎癥應答， 胞膜修飾和濾泡的胞內移動的現象及其分子機制進行闡述。      關鍵詞：沙門菌； 效應蛋白； 宿主因子；      沙門菌是一種革蘭氏陰性病原菌， 能侵入宿主腸道上皮細胞并在胞內生存和增殖， 從而引起一系列的疾病， 包括腸胃炎、腹痛、傷寒癥等1.全球每年由

3、于沙門菌感染導致的疾病與死亡正成為重大的公共衛生問題。      沙門菌通過向宿主細胞內分泌多種毒力因子， 來調控宿主細胞的生理活動以利于自身的生存， 這些毒力因子被稱為效應蛋白。型分泌系統 （Typesecretion system, T3SS） 是沙門菌一套特殊的蛋白質分泌系統， 將沙門菌分泌的效應蛋白轉運至宿主細胞中2.沙門菌有兩套功能不同的型分泌系統T3SS1和T3SS2, 分別由沙門菌毒力島1和2 （Salmonella pathogenicity island, SPI-1和SPI-2） 編碼3, 其中SPI-1編碼的T3SS1在細菌感染的初

4、期發揮作用， 啟動沙門菌對上皮細胞的侵入4.而SPI-2編碼的T3SS2在系統性感染中發揮重要作用5, 當細菌進入宿主細胞后， T3SS2的效應蛋白被轉運至細胞內的不同部位， 調控宿主細胞的多種生理狀態。除了分泌效應蛋白外， 沙門菌感染細胞后會在胞內形成包含沙門菌的濾泡 （Salmonella-containing vacuole, SCV） , 并在其中增殖6.在沙門菌與宿主細胞的互作過程中， 沙門菌分泌的效應蛋白對宿主細胞內信號轉導和生理活動具有廣泛的調控作用。首先， 沙門菌利用效應蛋白操縱宿主細胞骨架蛋白， 引起細胞膜的褶皺， 從而促進沙門菌的入侵。侵入宿主內的沙門菌分泌效應蛋白抑制炎癥

5、反應從而在胞內存活， 并進一步形成SCV進行增殖， 此時， 更多的效應蛋白參與SCV胞膜的修飾， 促進SCV的成熟并向胞膜移動， 繼續感染鄰近的細胞。本文即對效應蛋白在胞內的作用進行綜述。         沙門菌感染過程中， 肌動蛋白細胞骨架的重排是宿主細胞發生的顯著變化之一， 并由此促進沙門菌的入侵7.在細胞骨架重排的過程中， Rho GTPase發揮著重要作用， 其中小分子Cdc42和Rac常常作為信號傳導通路中重要的“分子開關”8-9.Sop B是一種具有肌醇磷酸酶活性的效應蛋白， 經T3SS1分泌至宿主細胞內， 激活以Cdc4

6、2為主的Rho GTPase活性， 從而促進宿主細胞胞膜肌動蛋白的重排10.Sop B也可以通過募集膜聯蛋白A2來為肌動蛋白的重排提供平臺11 （圖1） .沙門菌通過特異性地靶向Microfold細胞從而侵入腸道上皮細胞， Sop B能夠誘導濾泡相關的腸上皮細胞發生上皮間質轉化， 轉分化成為Microfold細胞， 這一過程依賴于Sop B引起的WNT-catenin信號通路的激活， 并能進一步激活NF-B配體RANKL的受體激活因子和受體RANK12.      Sop E是一種具有鳥苷酸交換因子活性的效應蛋白， 它能夠與Sop B合作發揮功能。Sop

7、 E通過激活RHO GTPase進而活化下游的p21-activated kinase （PAK） , PAK磷酸化宿主細胞內的肌球蛋白MYO6, 使MYO6募集到富含肌動蛋白的胞膜上， 這時Sop B參與其中， 與MYO6一起啟動PI3K信號通路， 在沙門菌侵入位點產生磷脂酰肌醇三磷酸 （PIP3） , 促進細胞骨架接頭蛋白的聚集13, 啟動細胞骨架的重排。盡管SopE與SopB功能上有部分重疊， 但其對細胞骨架的重排機制有所不同。一方面， Sop E的鳥苷酸交換因子活性能激活Rac1和Cdc42, 從而募集WAVE調控復合體 （WAVE regulatory complex, WRC） 和

8、神經Wiskott-Aldrich綜合征蛋白 （neural Wiskott-Aldrich syndrome protein, N-WASP） , 激活胞膜上的肌動蛋白相關蛋白ARP2/3;另一方面， Sop E通過影響WASP家族成核促進因子的聚集和激活 （圖1） , 引起局部肌動蛋白的多聚化， 并進一步引起胞膜的褶皺， 促進沙門菌的入侵14.      除了Sop B和Sop E, Sip A和Sip C一樣可以通過調節細胞骨架促進沙門菌的入侵， 它們直接與T3SS插入位點處的肌動蛋白結合從而發揮功能。Sip A抑制肌動蛋白的解聚并能促進肌動蛋白在

9、細菌侵入上皮細胞的位點聚集 （圖1） ;Sip C可能通過與中等纖維蛋白互作進而影響細胞骨架15.為了完成感染宿主細胞的過程， 沙門菌分泌上述多種效應蛋白進入宿主的上皮細胞中， 破壞肌動蛋白細胞骨架， 通過引起胞飲作用促進沙門菌的入侵。         除了操縱宿主細胞骨架蛋白引發胞飲之外， 沙門菌還能引起胃腸道內局部的炎癥反應， 完成感染宿主細胞的過程。但是， 作為機體的防御性反應， 炎癥反應能使機體代謝增強， 促進抗體的形成， 增強吞噬細胞的吞噬功能， 不利于沙門菌的存活與增殖。因此， 在進入宿主細胞后， 沙門菌能夠逆轉已經發生重

10、排的細胞骨架， 并分泌效應蛋白抑制機體的炎癥反應 （圖2） .      胃腸道的局部炎癥反應能夠增強沙門菌對其他腸道菌群的競爭性， 促進沙門菌的侵入16.大多數SPI-1編碼的效應蛋白都能通過MAPK和NF-B途徑產生促炎細胞因子IL-8, 引起腸道的炎癥反應。宿主細胞受到沙門菌的刺激時， 細胞表面的Toll樣受體 （Toll-like receptor, TLR） 能識別沙門菌的脂多糖等組分， 進而激活吞噬細胞， 啟動對機體內細菌的殺傷， 同時也能激活炎癥相關的Caspase編碼基因的轉錄17, 如Caspase-1編碼基因。Caspase1能特異剪

11、切無活性的促炎癥細胞因子IL-18和IL-1前體， 使其成為有活性的細胞因子， 促進炎癥反應的發生。通過T3SS輸送到宿主胞質中的鞭毛絲狀體蛋白Fil C和桿狀蛋白Prg J能夠激活巨噬細胞中Caspase1編碼基因的表達。Caspase1啟動吞噬細胞釋放促炎性細胞因子IL-18和IL-1， 同時促進T細胞釋放IL-17和IL-22, 在幾種細胞因子的共同作用下， 腸道黏膜中的炎癥反應進一步擴大18.除此之外， 能激活Caspase1編碼基因表達的效應蛋白還有Sip B, 這種SPI-1易位子蛋白被注入到細胞膜中并轉移至線粒體， 造成細胞膜和線粒體損傷從而激活Caspase1編碼基因19, 活

12、化IL-18和IL-1， 使宿主發生炎癥反應。Sop E是具有鳥苷酸交換因子活性的效應蛋白， 在誘導宿主細胞骨架重排后， 繼續利用Rho GTPase Rac1和Cdc42來激活基質細胞的Caspase 1編碼基因， 引起腸道炎癥20.Sip A的作用也與激活炎癥性Caspase家族成員有關， 它最早被發現為是一種與沙門菌侵入宿主細胞過程相關的效應蛋白， 既可以促進肌動蛋白聚合， 協助沙門菌進入上皮細胞；也能促進多核粒細胞向腸道上皮細胞遷移， 對促進Caspase3編碼基因的轉錄發揮著重要的作用， 從而直接誘導炎癥反應21.      在沙門菌進入宿主細

13、胞后， 細胞骨架將會恢復， 為避免炎癥反應的擴大對沙門菌的生存造成不利影響， 沙門菌會釋放其他效應蛋白來抑制炎癥反應。Spt P就是其中一種這樣的效應蛋白， 在沙門菌感染后使Rho GTPase失活， 逆轉重排的細胞骨架。Spt P具有蛋白質酪氨酸磷酸酯酶活性， 能夠抑制MAPK途徑介導的炎癥反應和IL-8的分泌。在感染后期， Spt P使AAA+ATPase去磷酸化， 這些功能對沙門菌的胞內增殖至關重要22.E3泛素連接酶效應蛋白Ssp H1和SPI-1效應蛋白Avr A都能夠下調宿主因沙門菌入侵而產生的IL-8, 其中Ssp H1結合并使絲/蘇氨酸蛋白激酶N1泛素化， 從而抑制NF-B的活

14、性23.Avr A具有乙酰轉移酶活性， 能夠靶向MAPK和NF-B通路來抑制由于吞噬細胞細胞凋亡而引起的炎癥；Spv C是一種具有磷酸蘇氨酸裂解酶活性的效應蛋白， 與Avr A一樣靶向MAPK和NF-B通路， 除此之外它還能通過抑制IL-8和腫瘤壞死因子的生成從而降低炎癥反應對細菌胞內生存的影響24.      Ste A可以被T3SS1和T3SS2分泌到上皮細胞和吞噬細胞中， 它在He La細胞中的功能體現在引起許多基因表達的改變， 激活包括調控細胞外基質組織、細胞增殖和絲/蘇氨酸激酶信號通路在內的多個基因表達；抑制包括調控免疫反應、細胞死亡、細胞粘附

15、和細胞遷移等基因的表達， 這些功能也暗示著Ste A能夠調節宿主的炎癥反應25.      Spv D也能通過影響NF-B通路來抑制炎癥反應的進行。Spv D和宿主蛋白Xpo2相互作用， 阻斷了importin-從細胞核中正常循環， 影響了Rel A （p65） 向細胞核內的遷移， 并進一步抑制了受NF-B調控的啟動子激活26.Pip A、Gog A和Gtg A屬于同一家族的效應蛋白， 它們靶向NF-B通路中的各個組成部分， 這些效應蛋白作為蛋白酶切除Rel A （p65） 和Rel B轉錄因子， 來抑制炎癥反應的發生27.    &

16、#160; 除了通過抑制NF-B和MAPK通路抑制炎癥反應之外， 沙門菌還可能通過抑制T細胞的激活來阻止炎癥反應的擴大。在沙門菌侵入抗原提呈細胞后， 效應蛋白Ste D能夠結合MHC類分子和宿主的E3泛素連接酶MARCH8, 促使MHC類分子被泛素化降解， 從而消耗抗原提呈細胞表面的MHC類分子， 抑制T細胞的激活， 阻止T細胞介導的炎癥反應的進行28.在有效抑制宿主的炎癥反應后， 沙門菌能夠在胞內形成SCV并在其中增殖。      在SCV的成熟過程中， 它需要與核內體產生短暫的相互作用， 這會導致一些早期核內體的標記物在SCV上聚集， 包括

17、轉鐵蛋白受體、核內體抗原1和small GTPase RAB5.這些標記物隨后會被后期核內體標記物或是溶酶體標記物所代替， 包括溶酶體相關的膜蛋白， GTPase RAB7, 濾泡ATPase和膽固醇等。在沙門菌侵入宿主細胞后形成SCV的初期， SCV會因為其濾泡膜上的修飾而與典型的吞噬體組分產生形態學的差異。      在SCV的修飾過程中， SPI-2效應蛋白發揮了巨大的作用。SPI-2編碼的某些T3SS效應蛋白常常定位在SCV上， 提示這些效應蛋白很可能參與細胞內體膜的修飾， 其中Sif A和Sse J是兩種被廣泛認可的參與了宿主胞膜修飾的效應蛋白

18、。在沙門菌侵入哺乳動物上皮細胞后， 能夠將一種具有甘油磷脂-膽固醇酰基轉移酶活性的效應蛋白Sse J釋放到宿主細胞質中， 隨后Sse J被募集到宿主細胞內吞噬體膜表面， 在那里與small GTPase Rho A結合并活化， 活化后的Sse J能夠修飾這些內吞體膜的磷脂和固醇的組分， 最終引起細胞質中膽固醇酯在脂滴內的積累29.SCV中脂質成分的改變可能影響SCV相關蛋白的募集， 比如Sif A在被募集后就起著聯系SCV和微管網絡的功能。效應蛋白Sse L是一種去泛素化酶， 能阻止脂滴在細胞內的聚集， 這暗示著它可能在防止SCV中脂質組成發生變化中起著重要的作用30.SPI-2效應蛋白的一些

19、特殊的酶活性使它們能夠操縱small GTPase活性， 還能通過翻譯后修飾從SCV中去除蛋白， 利用內吞回收途徑或去泛素化作用阻止蛋白的遷移， 這些都能導致SCV膜蛋白和脂質含量的變化。         沙門菌侵入宿主細胞后形成SCV并在其中增殖， 在這個過程中， SCV中的沙門菌會通過T3SS分泌SPI-2效應蛋白， 這些效應蛋白穿過SCV膜進入宿主細胞質中， 參與調控SCV向細胞核區域移動。隨著沙門菌在SCV內的不斷增殖， 位于細胞核周圍的SCV在效應蛋白的作用下繼續向細胞外圍遷移， 最終從宿主上皮細胞中釋放進入腸腔中， 進一步

20、感染鄰近的上皮細胞。      近年來的研究表明， SCV胞內移動與內體小管 （endosomal tubule） 的活力相關， 沙門菌感染后分泌的效應蛋白能促進內體小管的延伸， 這一過程依賴LAMP1蛋白和微管蛋白的活性。沙門菌進入宿主細胞后， 能產生微管連接蛋白SNX3, 它能招募RAB7和LAMP1這兩種蛋白聚集， RILP能將活化了的RAB7連接在動力蛋白 （Dynein） 上形成復合物， 這種復合物在早期感染時SCV的向心移動中發揮作用31.SCV在宿主細胞內能募集驅動蛋白， 而一些沙門菌的效應蛋白則反向調控這一過程， Sif A就是具有這種功

21、能的一種效應蛋白， 它可以與宿主細胞內的SKIP蛋白相互作用， SKIP能下調驅動蛋白在SCV上的募集并能調控濾泡膜的活性， Sif A與SKIP的互作將SCV聯系到微管骨架網絡中。從Sif A和SKIP互作形成的復合體中， 可以看出Sif A有兩個不同的結構域：氨基端結合SKIP蛋白；羧基端CAAX模體翻譯后被脂化， 與效應蛋白Sop E一樣具有鳥苷酸交換因子活性， 能夠與GDP結合的Rho A相互作用， 最終， Sif A、SKIP、Sse J和Rho GTPases合作誘導內體形成內體小管32, 將SCV與微管蛋白網絡相聯系， 促進SCV的移動。     &

22、#160;Ste A在SCV的胞內移動中也發揮著重要的作用。研究表明， 敲除ste A基因的沙門菌感染細胞后會出現更少的纖絲蛋白， 造成SCV的聚集并產生形態上非正常的濾泡， 同時， 這些表型可以通過抑制微管動力蛋白和驅動蛋白1的活性而恢復正常33.由此可見， Ste A的功能與動力蛋白的活性相關， 它參與了SCV濾泡膜活性的調節。Ste A特異性與PI （4） P結合， 而且在被感染的細胞中， Ste A和PI （4） P都定位在SCV的膜表面34, 這暗示著Ste A很有可能通過靶向宿主細胞中PI （4） P參與對SCV胞內移動的調節。      效

23、應蛋白Sse F和Sse G也參與調控SCV的聚集和定位， 可能發揮著穩定SCV上動力蛋白活性的功能。在被感染的上皮細胞中Sse F和Sse G能幫助SCV靠近高爾基體網絡， Sse F和Sse G首先發生相互作用， 然后直接與哺乳動物ACBD3相互作用， ACBD3是一種多功能的胞漿高爾基體網絡相關蛋白， 從而將SCV錨定在高爾基體網絡中35.Ste A可能與Sse F和Sse G有著功能上的聯系， 這也暗示著Ste A直接或間接調控著濾泡相關微管的移動33.      另一種T3SS效應蛋白Pip B2能夠募集驅動蛋白1到SCV膜上， 通過調節驅動蛋

24、白活性影響沙門菌的毒力， 在哺乳動物細胞中Pip B2能夠重組內體/溶酶體組分， 這一活性同時能夠引起溶酶體中富含糖蛋白的膜小管結構沿著微管向遠離SCV的方向延伸， 這些膜相關的管狀結構就是沙門菌誘導產生的纖絲蛋白36, 這些證據指示著Pip B2很有可能參與SCV在胞內的移動。Sif A不但與SCV的穩定性相關， 而且與沙門菌的毒力密切相關。Sop D2與Sif A在功能上相互影響， Sop D2能夠引起SCV的穩定性降低， 使敲除了sif A的突變株在胞漿內被釋放。在sif A的突變株中敲除sop D2能夠重新使SCV膜發生轉運， 并且形成新的纖絲蛋白37.這說明Sop D2和Sif A對

25、SCV膜的動態變化起著拮抗的作用， 影響著SCV在胞內的移動。除此之外， Sop D2還被證明與沙門菌逃脫宿主免疫防御相關。沙門菌侵入宿主細胞形成SCV后， 激活宿主的免疫防御反應， 促使SCV向溶酶體轉運并降解。Sop D2能抑制這一過程， 它能與宿主的調節性GTPase Rab7結合， 從而抑制宿主因子RILP和FCYO1與Rab7的結合， 阻止Rab7依賴的SCV向溶酶體內的移動38-39.         沙門菌能侵入多種類型的哺乳動物細胞并在其中存活， 這與沙門菌通過分泌系統釋放到宿主細胞內效應蛋白的功能密不可分。近年來，

26、隨著沙門菌在宿主細胞內生存和增殖的分子機制被廣泛地研究， 人們對于效應蛋白的探索不僅僅局限于其結構和功能， 更聚焦于這些效應蛋白如何影響宿主細胞的生理活動40.本課題組長期致力于沙門菌毒力調控方面的探索， 已有研究發現， SPI-1基因的表達由復雜的調控系統所控制， 而Hil D作為沙門菌SPI-1的主要調控元件， 其中第297位賴氨酸的乙酰化可以增加Hil D蛋白的穩定性， 卻會降低其與DNA結合的親和力， 最終導致沙門菌侵入宿主細胞的能力減弱41.這暗示著沙門菌體內某些調控蛋白的翻譯后修飾會影響T3SS效應蛋白的表達， 最終影響沙門菌的毒力。另外， 本課題組首次在腸出血性大腸桿菌中鑒定到了

27、型分泌系統效應蛋白Kat N, 并闡明了其在感染宿主細胞后所發揮的降低胞內活性氧含量的作用42.相關工作也為研究細菌的分泌系統提供了新的思路。      盡管研究者們已經對某些效應蛋白靶向的宿主細胞因子有了較為清楚的了解， 但是更多效應蛋白在真核細胞內的靶點知之甚少。因此對沙門菌效應蛋白的研究來說， 確定各效應蛋白靶向的宿主因子及信號通路仍是目前研究工作的重點。隨著分子生物學技術的發展， 利用細胞體內標記蛋白質譜技術、全基因組CRISPR敲除篩選 （Genome-wide CRISPR knock out screen） 等研究手段， 對真核宿主細胞內的

28、因子進行研究， 有助于更加精準地發現沙門菌效應蛋白的靶點及背后的分子機制， 挖掘其下游的信號通路。我們期待快速發展的分子生物學技術能夠鑒定出更多的沙門菌效應蛋白靶點， 這些靶點可能作為新型的抗菌治療靶點， 相信在接下來的幾十年中， 人們對于沙門菌感染的防控有進一步的突破。         1Zhou D, Mooseker MS, Galan JE.An invasion-associated Salmonella protein modulates the actin-bundling activity of plastin.Pro

29、ceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1999, 96 （18） :10176-10181.   2Diepold A, Armitage JP.Type III secretion systems:the bacterial flagellum and the injectisome.Philosophical transactions of the Royal Society of London.Series B, Biological sciences

30、, 2015, 370 （1679） .   3Hansen-Wester I, Hensel M.Salmonella pathogenicity islands encoding type III secretion systems.Microbes and infection, 2001, 3 （7） :549-559.   4La Rock DL, Chaudhary A, Miller SI.Salmonellae interactions with host processes.Nature reviews.Microbiology, 2015, 13 （4） :191-205.  &#