1、細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力測定細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力測定 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模阂弧?shí)驗(yàn)?zāi)康模? 1掌握細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法掌握細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法2. 2. 掌握測定細(xì)胞活力的方法。掌握測定細(xì)胞活力的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理n培養(yǎng)的細(xì)胞在一般條件下要求有一定的密度才能培養(yǎng)的細(xì)胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好，所以要進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)果以每生長良好，所以要進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示。細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理和方法與血細(xì)毫升細(xì)胞數(shù)表示。細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理和方法與血細(xì)胞計(jì)數(shù)相同。胞計(jì)數(shù)相同。三、實(shí)驗(yàn)材料n儀器、材料與試劑儀器、材料與試劑n1 1儀器：普通顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板、試管、儀器：普通顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板、試管、吸管

2、、分光光度計(jì)。吸管、分光光度計(jì)。n2 2材料：細(xì)胞懸液。材料：細(xì)胞懸液。n3 3試劑：試劑：0.40.4臺盼蘭，臺盼蘭，0.50.5四甲基偶氮四甲基偶氮唑鹽（唑鹽（MTTMTT）、酸化異丙醇）、酸化異丙醇n四、操作步驟四、操作步驟n1 1細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)將血球計(jì)數(shù)板及蓋片用擦試干凈，并將蓋將血球計(jì)數(shù)板及蓋片用擦試干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。片蓋在計(jì)數(shù)板上。將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間。使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間。靜置靜置3 3分鐘。分鐘。n計(jì)數(shù)計(jì)數(shù) ：在低倍鏡下計(jì)算計(jì)數(shù)板的四角大方格：在低倍鏡下計(jì)算計(jì)數(shù)板的四角大方格（每個(gè)大

3、方格又分（每個(gè)大方格又分1616個(gè)小方格）內(nèi)的細(xì)胞數(shù)。數(shù)個(gè)小方格）內(nèi)的細(xì)胞數(shù)。數(shù)出計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)室四角四大格中的細(xì)胞數(shù)，如細(xì)出計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)室四角四大格中的細(xì)胞數(shù)，如細(xì)胞壓在格線上時(shí)，數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右。胞壓在格線上時(shí)，數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右。n細(xì)胞濃度計(jì)算：細(xì)胞濃度計(jì)算： 四大格的細(xì)胞總數(shù)除以四大格的細(xì)胞總數(shù)除以4 4，得，得出平均每大格的細(xì)胞數(shù)，每大格的容積為出平均每大格的細(xì)胞數(shù)，每大格的容積為0.1mm0.1mm3 3，因此，不同稀釋倍數(shù)細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度可用下因此，不同稀釋倍數(shù)細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度可用下式計(jì)算：式計(jì)算：n細(xì)胞濃度（細(xì)胞數(shù)細(xì)胞濃度（細(xì)胞數(shù)mlml）（四大格的細(xì)胞數(shù)）（四大格

4、的細(xì)胞數(shù)4 4）1000010000稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)n注意：鏡下偶見由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，注意：鏡下偶見由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)占應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)占10%10%以上，說明分以上，說明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液散不好，需重新制備細(xì)胞懸液2 2細(xì)胞活力測定細(xì)胞活力測定n在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力，由總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力，由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對細(xì)胞是否有損傷作用。復(fù)

5、蘇后的細(xì)胞也的過程對細(xì)胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。n用用臺盼蘭臺盼蘭染細(xì)胞，死細(xì)胞著色，活細(xì)胞不著色，染細(xì)胞，死細(xì)胞著色，活細(xì)胞不著色，從而可以區(qū)分死細(xì)胞與活細(xì)胞。利用細(xì)胞內(nèi)某些從而可以區(qū)分死細(xì)胞與活細(xì)胞。利用細(xì)胞內(nèi)某些酶與特定的試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，也可測定細(xì)胞相酶與特定的試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，也可測定細(xì)胞相對數(shù)和相對活力。對數(shù)和相對活力。n臺盼藍(lán)活力測定機(jī)理：臺盼藍(lán)活力測定機(jī)理：n正常的活細(xì)胞，胞膜結(jié)構(gòu)完整，能夠排斥臺盼藍(lán)，正常的活細(xì)胞，胞膜結(jié)構(gòu)完整，能夠排斥臺盼藍(lán)，使之不能夠進(jìn)入胞內(nèi)；而喪失活性或細(xì)胞膜不完使之不能夠進(jìn)入胞內(nèi)

6、；而喪失活性或細(xì)胞膜不完整的細(xì)胞，胞膜的通透性增加，可被臺盼藍(lán)染成整的細(xì)胞，胞膜的通透性增加，可被臺盼藍(lán)染成藍(lán)色。通常認(rèn)為細(xì)胞膜完整性喪失，即可認(rèn)為細(xì)藍(lán)色。通常認(rèn)為細(xì)胞膜完整性喪失，即可認(rèn)為細(xì)胞已經(jīng)死亡胞已經(jīng)死亡。n將一定濃度的細(xì)胞懸液與將一定濃度的細(xì)胞懸液與0.4%0.4%臺盼蘭以臺盼蘭以9:19:1混合。混合。n染色染色2 2一一3 3分鐘。分鐘。n吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。n鏡下取幾個(gè)任意視野分別計(jì)死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)，鏡下取幾個(gè)任意視野分別計(jì)死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)，計(jì)細(xì)胞活力。計(jì)細(xì)胞活力。n死細(xì)胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細(xì)死細(xì)胞能被臺盼蘭染

7、上色，鏡下可見深蘭色的細(xì)胞，活細(xì)胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。另外，胞，活細(xì)胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。另外，活力測定可以和細(xì)胞計(jì)數(shù)合起來進(jìn)行，但要考慮活力測定可以和細(xì)胞計(jì)數(shù)合起來進(jìn)行，但要考慮到染液對原細(xì)胞懸液的加倍稀釋作用。到染液對原細(xì)胞懸液的加倍稀釋作用。細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膎掌握細(xì)胞凍存的方法。掌握細(xì)胞凍存的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理n在不加任何條件下直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)和外在不加任何條件下直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會形成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)環(huán)境中的水都會形成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、蛋白械損傷、電解質(zhì)升高、滲透

8、壓改變、脫水、蛋白變性等，引起細(xì)胞死亡。變性等，引起細(xì)胞死亡。n如向培養(yǎng)液加入保護(hù)劑，可使冰點(diǎn)降低。在如向培養(yǎng)液加入保護(hù)劑，可使冰點(diǎn)降低。在緩慢緩慢的凍結(jié)的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)胞。胞。n細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)速度要快，使之迅速通過細(xì)胞最易受細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)速度要快，使之迅速通過細(xì)胞最易受損的損的5 500，細(xì)胞仍能生長，活力受損不大。，細(xì)胞仍能生長，活力受損不大。n目前常用的保護(hù)劑為二甲亞砜（目前常用的保護(hù)劑為二甲亞砜（DMSODMSO）和甘油，）和甘油，它們對細(xì)胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿它們對細(xì)胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞。透細(xì)胞。影

9、響冷凍效果的因素n1 1、冷凍速率、冷凍速率n細(xì)胞冷至細(xì)胞冷至-10-10-15-15之間時(shí)，細(xì)胞外溶液之間時(shí)，細(xì)胞外溶液先出現(xiàn)結(jié)冰，而細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)仍保持未結(jié)冰先出現(xiàn)結(jié)冰，而細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)仍保持未結(jié)冰狀態(tài)、細(xì)胞內(nèi)未結(jié)冰的水分子會向細(xì)胞外狀態(tài)、細(xì)胞內(nèi)未結(jié)冰的水分子會向細(xì)胞外流動。流動。n冷凍速度慢，細(xì)胞內(nèi)水分外滲多，細(xì)胞內(nèi)冷凍速度慢，細(xì)胞內(nèi)水分外滲多，細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度增高、細(xì)胞不發(fā)生結(jié)冰。溶質(zhì)濃度增高、細(xì)胞不發(fā)生結(jié)冰。n冷凍速度快，細(xì)胞內(nèi)水分沒足夠時(shí)間外滲，冷凍速度快，細(xì)胞內(nèi)水分沒足夠時(shí)間外滲，會發(fā)生結(jié)冰。會發(fā)生結(jié)冰。n2、冷凍保存溫度、冷凍保存溫度 液氮（液氮（-196 -196 ）是最佳保存溫度。）

10、是最佳保存溫度。n3、復(fù)溫速度、復(fù)溫速度 越快越好，越快越好，37 水浴中，水浴中，1-2min1-2min完成復(fù)溫。完成復(fù)溫。n4、冷凍保護(hù)劑、冷凍保護(hù)劑 保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷的物質(zhì)，常用保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷的物質(zhì)，常用甲亞甲亞砜（砜（DMSODMSO）和甘油。）和甘油。三、實(shí)驗(yàn)材料n1 1儀器：儀器：44冰箱，冰箱，-70-70冰箱，液氮罐，離心機(jī)，冰箱，液氮罐，離心機(jī)，水浴鍋，微量加樣器等水浴鍋，微量加樣器等n2 2材料：凍存管（塑料螺口專用凍存管或安瓿材料：凍存管（塑料螺口專用凍存管或安瓿瓶）、離心管、吸管等。瓶）、離心管、吸管等。n3 3試劑：試劑：0.250.25胰酶、培養(yǎng)基、含保

11、護(hù)劑的培養(yǎng)胰酶、培養(yǎng)基、含保護(hù)劑的培養(yǎng)基（即凍存液）等。基（即凍存液）等。n四、操作步驟四、操作步驟n1 1凍存凍存 胰酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞懸液收集至離心管中。胰酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞懸液收集至離心管中。 1000rpm1000rpm離心離心5 5分鐘，棄上清液。分鐘，棄上清液。 沉淀加含保護(hù)液的培養(yǎng)基（培養(yǎng)基：沉淀加含保護(hù)液的培養(yǎng)基（培養(yǎng)基：DMSO=1:1DMSO=1:1），計(jì)數(shù)，調(diào)整至），計(jì)數(shù)，調(diào)整至5 510106 6/ml/ml左右。左右。 將懸液分至凍存管中，每管將懸液分至凍存管中，每管1 ml1 ml。 n將凍存管口封嚴(yán)。如用安瓿瓶則火焰封口，封將凍存管口封嚴(yán)。如用安瓿瓶則火焰封口，封

12、口一定要嚴(yán)，否則復(fù)蘇時(shí)易出現(xiàn)爆裂。口一定要嚴(yán)，否則復(fù)蘇時(shí)易出現(xiàn)爆裂。n貼上標(biāo)簽，寫明細(xì)胞種類，凍存日期。凍存管貼上標(biāo)簽，寫明細(xì)胞種類，凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細(xì)繩。外拴一金屬重物和一細(xì)繩。n按下列順序降溫：室溫按下列順序降溫：室溫44（2020分鐘分鐘冰箱冰箱冷凍室（冷凍室（-20 -20 ）（）（1 1小時(shí)）小時(shí)）氣態(tài)氮（過夜）氣態(tài)氮（過夜）液氮。液氮。n注意：操作時(shí)應(yīng)小心，以免液氮凍傷。液氮定期注意：操作時(shí)應(yīng)小心，以免液氮凍傷。液氮定期檢查，隨時(shí)補(bǔ)充，絕對不能揮發(fā)干凈，一般檢查，隨時(shí)補(bǔ)充，絕對不能揮發(fā)干凈，一般3030立立升的液氮能用升的液氮能用1 11.51.5月。月。n2 2復(fù)蘇復(fù)蘇n從液氮中取出凍存管、迅速置于從液氮中取出凍存管、迅速置于3737溫水中并溫水中并不斷攪動。使凍存管中的凍存物在不斷攪動。使凍存管中的凍存物在1 1分鐘之內(nèi)融化。分鐘之內(nèi)融化。n打開凍存管，將細(xì)胞懸液吸到離心管中。打開凍存管，將細(xì)胞懸液吸到離心管中。n1000rpm1000rpm離心離心1010分鐘，棄去上清液。分鐘，棄