1、改良的鹽酸羥胺法測生物樣品SOD活性一 SOD（T-SOD）活力測定：原理：羥胺在有氧環境下發生自氧化可產生超氧陰離子，產生的超氧陰離子可由NBT還原率而檢測，在SOD存在下，超氧陰離子被分解，NBT還原被抑制。因此，用比色法測定NBT還原產物可以間接反映SOD的酶活力。儀器：可見光分光光度計試劑：75mM Na2CO3 /NaHCO3緩沖液（pH=10.2，含0.15mM EDTA-Na2）5mM NH2OH·HCl0.3%（V/V）Triton X-100 0.3ml0.98mM NBT 0.1ml甲酸步驟：1. 用1:5組織勻漿（血清可直接取樣），3000rpm離心30min，

2、取上清20ul稀釋至0.1ml2. 按順序加入如下試劑：75mM Na2CO3 /NaHCO3緩沖液 2.0ml5mM NH2OH·HCl 0.5ml0.3%（V/V）Triton X-100 0.3ml0.98mM NBT 0.1ml3. 立即計時，于37恒溫水浴10min（避光）。4. 2.0ml甲酸終止反應。5. E560nM比色，記錄OD值。計算結果：酶單位表示：在本實驗條件下，抑制率達50%所對應的提取液SOD含量即一個SOD單位（U）?？捎妹縢蛋白（U/g protein）表示。二 Mn-SOD活性測定：基于氰化物抑制CuZn-SOD非Mn-SOD活性的原理，在上述緩沖液

3、中加入KCN，使最終反應體系中的KCN濃度達到2mM，即將緩沖液配成含3mM的KCN。37孵育45分鐘，以抑制CuZn-SOD。其余操作、步驟、計算方法同上。三 CuZn-SOD酶活力 = T-SOD酶活力單位 Mn-SOD酶活力注意事項：1) 對照組（非酶管）取樣品同體積的三蒸水，其余步驟同樣品。2) 若測血中SOD，可取血清20ul，其余地操作步驟同上。來自：第四軍醫大學碩士王建宏學位論文診斷劑量超聲對鼠胚胎和人絨毛脂質過氧化及超微結構的影響。導師：錢蘊秋。單位及專業：西京醫院超聲診斷科，超聲診斷學。1991.5-1992.6。參考秦緒軍、常耀明碩士論文原始參考文獻：1、 Kono Y.

4、Generation of superoxide radical during autoxidation of hydroxylamine and an assay for superoxide dismutase. Arch Biochem Biophys. 1978 Feb; 186(1):189-95. 或者Yasuhisa Kono. Generation of superoxide radical during autoxidation of hydroxylamine and an assay for superoxide dismutase. Anchives of Bioche

5、mistry and Biophysics. 1978 Feb; 186(1):189-95.2、 Yisun et al. Free Rad Res Comms 1988; 4:299-309.劉樹元制作2003-5-7熒光法測定血清脂質過氧化產物（MDA）原理：過氧化脂質降解產物中的丙二醛（簡稱MDA），可與硫代巴比妥酸（簡稱TBA）縮合，形成紅色產物。此紅色物質在波長532nm有極大吸收峰，可用分光光度法進行定量測定。若以515nm為激發光，則在553nm有最強熒光強度，故可用熒光法進行微量測定。靈敏度高，再現性好，試樣用量少，是該方法的優點。儀器：熒光分光光度計試劑：1) MDA標準儲

6、備液（1mmol/L 四乙氧基丙烷或四甲氧基丙烷水溶液）：準確稱取22.03mg1，1，3，3-四乙氧基丙烷加水定容至100ml，放4冰箱，可保存三個月。2) MDA標準應用液（1mol/L）：準確量取標準儲備液0.1ml于100ml容量瓶中，用水稀釋至刻度，用時再準確稀釋（現用現配）。3) 1/24mol/L H2SO4 4) 10% 磷鎢酸溶液5) 0.67 硫代巴比妥酸（TBA）：新鮮配制（溶于水與冰醋酸等體積混合液）。6) 正丁醇（水飽和）步驟：血清樣品 50l1/24mol/L H2SO4 4.0ml10%磷鎢酸 500l混勻放置5min 2000rpm離心10分鐘棄上清 ，空在濾紙

7、上1/24mol/L H2SO4 2.0ml10%磷鎢酸 300l混勻放置5min， 2000rpm離心5分鐘棄上清 ，空在濾紙上樣品管 空白管 標準管雙蒸水 1.0ml(震1分鐘) 1.0ml /標準品 / / 1/0.5/0.25/0.125/0.0625各1.0ml0.67TBA 1.0ml 1.0ml 1.0ml振蕩、混勻 100準確水浴1h取出流水冷卻至室溫正丁醇（水飽和） 4.0ml振蕩抽提1分鐘，2000rpm離心5分鐘取上清（正丁醇層）約3.0ml(若出現混濁，可加一滴無水乙醇)測定熒光強度，激發光（515nm）發射光（553nm）計算結果：丙二醛濃度=0.5×1.0

8、0/0.05×1.05/0.5×f/F = 21×f/F nmol/ml血液f：樣品溶液的熒光強度F：標準溶液的熒光強度注意事項：棄上清時，不要回手。改良熒光法測定還原型谷胱甘肽原理：OPT在PH為8.0的時候與還原型谷胱甘肽合成GSH-OPT，在一定的激發波長和發射波長下進行熒光測定，從而對GSH進行定量。儀器：熒光分光光度計試劑：1）0.1%鄰苯二甲醛（OPT）溶液：臨用前稱取OPT10mg溶于10ml甲醇，混勻。2）0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液（含5mmol/L EDTA）：稱取Na2HPO4.12H2O 35.814g、 EDTA-Na2 1.861g，

9、用蒸餾水溶解并定容至1L，調節pH至8.3。3）1：4甲醛溶液：1體積甲醛加4體積磷酸鹽緩沖液混合。4）GSH標準儲存液：新鮮配制，將GSH配成1mg/ml水溶液5）GSH標準應用液：新鮮配制，取標準儲備液用水稀釋成0.5ug/ml的溶液。6）10%的三氯醋酸溶液步驟：試劑（ml） 測定管 標準管 空白待測樣品 0.2 應用液 0.2 雙蒸水 0.210%的三氯醋酸 0.2 0.2 0.2搖勻，室溫靜置10 min，5000g離心10min,，吸上清上清液 0.1 0.1 0.1甲醛 0.1 0.1 0.1搖勻，靜置5min0.1mol/L緩沖液 3.6 3.6 3.6搖勻，立即加入OPT溶液

10、0.2ml，搖勻，靜置40min測定：激發波長350nm, 發射波長425nm，空白調0，讀取熒光讀數。計算結果：測定管熒光讀數標準管熒光讀數GSH 濃度(umol/L)= ×1000÷307.3注意事項：1）GSH的濃度是在2.5ug/ml內，線性關系良好，最低檢出限為25ng/ml。2）本法測定過程中，加入OPT后，40min熒光值達最高讀數，在其后20min內穩定。3）可用偏磷酸沉淀劑代替10%的三氯醋酸，但須在40C下完全沉淀。4）用三氯醋酸沉淀蛋白，為達到最佳PH值8.0，故使用pH8.3的磷酸鹽緩沖液。5）甲醛的作用是降低非特異性干擾。 熒光法測定氧化型谷胱甘肽

11、原理：OPT在PH為12時，與GSSG特異地結合成GSSG-OPT，在一定的激發波長和發射波長下可進行熒光測定，從而對GSSG定量。N-乙基馬來酰亞胺（NEM）能與GSH絡合，并防止GSH轉變為GSSG，可用來消除GSH轉變為GSSG對GSSG含量測定結果的影響。儀器：熒光分光光度計試劑：1）25%偏磷酸 2）1mg/mlOPT：用甲醇配制。 3）0.04mol/L NEM水溶液 4）0.1mol/L NaOH 5）GSSG標準液：0.5ug/ml，用0.1mol/LNaOH配制。步驟：1）樣品制備：采集全血，加入0.06體積的SBE抗凝，12000g離心1.5min，分離上清，冰浴待測?；蛉?/p>

12、組織0.5g，加入7.5ml磷酸鈉-EDTA緩沖液、25%偏磷酸溶液2ml，制成5%的勻漿。室溫下6500g離心15分鐘，分離上清液，置冰浴中待測。 2）吸取0.5ml上清，加入0.2ml NEM溶液，室溫靜置30min。 3）加入0.1mol/L NaOH溶液4.3ml，混勻待測。 4）加樣檢測：試劑（ml） 0 1 2 3 4 5 樣品管GSSG標準液 0 0.1 0.5 1.0 1.5 2.0 /待測樣品液 / / / / / / 0.1NaOH 2.0 1.9 1.5 1.0 0.5 0 1.9OPT-甲醇液 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1GSSG含量（

13、1;g） 0 0.05 0.25 0.5 0.75 1.0將各管混勻，室溫下靜置30min選擇激發波長337.8nm，發射波長421.6nm，以標準曲線中的0管作對照，測定各管熒光強度。計算結果：以GSSG標準液的濃度為坐標橫軸，以其對應的熒光強度值為坐標縱軸，繪制標準曲線，求直線回歸方程。將樣品管的熒光測定值代入方程，可直接求出待測樣品中的GSSG的含量。注意事項：1）OPT可與GSH在PH8.0時結合，故可測定GSH含量，用0.1M磷酸鈉0.005M EDTA緩沖液(pH8.0)替換NaOH，同時樣品不用NEM處理。2）GSSG及GSH在室溫下形成熒光物質需一定時間，20min尚不能穩定，

14、25min反應基本完全，2h內穩定不變，故選擇30min。3）本法的特點是可同時測定GSH與GSSG。分光光度法測定谷胱甘肽過氧化物酶的活力原理：谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）可促進氫過氧化物與還原型谷胱甘肽的反應。谷胱甘肽過氧化物酶的活力，可以其酶促反應的速度來表示。另外，利用氧化型谷胱甘肽和輔酶2在谷胱甘肽還原酶作用下的反應，測定輔酶2的減少，亦可求出谷胱甘肽過氧化物酶的活力。測定酶促反應中過氧化物或還原型谷胱甘肽的消耗，則可求出酶的活力，GSHPX ROOH+2GSH ROH+GSSG+H2O H2O2+2GSH 2H2O+GSSGGSSG+2NADPH NADP+GSH儀器：可見光分光光

15、度計試劑：1）疊氮化納磷酸緩沖液（PH7.0）：NaN3 0.065g、EDTA-Na2 11.6g、Na2HPO4.12H2O 8.74g、 NaH2PO4.2H2O 2.43g，以雙蒸水溶解，稀釋至100ml，再以NaOH調節pH至7.0，4保存。2）1.0mmol/L GSH溶液：須當日配制。稱取GSH 3.07mg，以疊氮化納磷酸緩沖液溶解并稀釋至10.0ml。3）1.25-1.50mmol/L的H2O2溶液：須當日配制。吸取30% H2O2 13ul，以蒸餾水稀釋至100ml。4）偏磷酸沉淀液：含1.67%偏磷酸、0.05% EDTA及28%NaCl。稱取適量試劑后用三蒸水溶解，可微

16、微加熱促溶，充分溶解后趁熱過濾。5）0.32mol/L的磷酸氫二鈉溶液6）DTNB顯色液：稱取0.04g DTNB、檸檬酸納1.0g溶于蒸餾水中并稀釋至100ml，盛于棕色瓶4可保存一個月。步驟： 1）GSH標準曲線的制定(ml)：10ml的容量瓶中試劑（ml） 1 2 3 4 5 6GSH液 0 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00偏磷酸沉淀液 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0蒸餾水 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0GSH系列（µmol/L）0 20 40 60 80 100標準液系列 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0磷酸氫二鈉

17、 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5DNTB溶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.55min內422nm比色，以蒸餾水調02）全血GPX的測定(ml)：樣品制作：采集全血50ul，蒸餾水稀釋到2.0ml酶促反應（樣品管） 非酶促反應（非酶管） 空白管GSH液0.4ml GSH液0.4ml /血樣稀釋液0.4ml 蒸餾水0.4ml /37水浴5min 37水浴5min /H2O2（37預溫）0.2ml H2O2（37預溫）0.2ml /偏磷酸沉淀液4.0ml 偏磷酸沉淀液4.0ml 顯色反應(調0)混勻后，3000rpm離心10min上清2.0ml 上清2.0ml 蒸餾水

18、0.4ml 偏磷酸1.6ml磷酸二氫鈉2.5ml 磷酸二氫鈉2.5ml 磷酸二氫鈉2.5mlDTNB 0.5ml DTNB 0.5ml DTNB 0.5ml422nm5min內讀取光密度計算結果：Log(非OD空OD)log(樣OD空OD)3min×0.004mlGPX= 谷胱甘肽過氧化物酶活力的測定DTNB直接顯示法一原理 測定酶促反應中GSH的消耗量，則可求出酶的活力。（注意最后計算時，必須扣除非酶促反應所引起的GSH減少部分。）GSH-Px2GSH+H2O2 GSSG+2H2OGSH量的測定：GSH+DTNB 5-硫代2-硝基苯甲酸陰離子 該產物呈較穩定的黃色，測定其在422nm波長的光吸收值，可計算出GSH的量，從而可反映并計算出GSH-Px的活性。二試劑與儀器1.試劑 1）疊氮化納磷酸緩沖液