1、WORD格式(一) 常用的微生物別離純化方法菌種別離純化的方法有： 稀釋混合倒平板法、 稀釋涂布平板法、平板劃線別離法 、稀釋搖管法、液體培養(yǎng)基別離法、單細(xì)胞別離法、選擇培養(yǎng)別離法等。其中前三種方法最為常用 ,不需要特殊的儀器設(shè)備 , 別離純化效果好 , 現(xiàn)分別簡(jiǎn)述如下1. 稀釋混合倒平板法平板是指經(jīng)熔化的固體培養(yǎng)基倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中 , 冷卻凝固而成的盛有固體培養(yǎng)基的平皿。該法是先將待別離的含菌樣品 , 用無(wú)菌生理鹽水作一系列的稀釋 (常用十倍稀釋法 , 稀釋倍數(shù)要適當(dāng) ), 然后分別取不同稀釋液少許 (0.5-1.0ml)于無(wú)菌培養(yǎng)皿中 , 傾入已熔化并冷卻至 50左右的瓊脂培養(yǎng)基 , 迅速

2、旋搖 , 充分混勻。待瓊脂凝固后 , 即成為可能含菌的瓊脂平板。于恒溫箱中倒置培養(yǎng)一定時(shí)間后 , 在瓊脂平板外表或培養(yǎng)基中即可出現(xiàn)分散的單個(gè)菌落。 每個(gè)菌落可能是由一個(gè)細(xì)胞繁殖形成的。挑取單一個(gè)菌落 , 一般再重復(fù)該法 1-2 次, 結(jié)合顯微鏡檢測(cè)個(gè)體形態(tài)特征 ,便可得到真正的純培養(yǎng)物。 假設(shè)樣品稀釋時(shí)能充分混勻 ,取樣量和稀釋倍數(shù)準(zhǔn)確 ,那么該法還可用于活菌數(shù)測(cè)定。專業(yè)資料整理WORD格式圖 4 混合倒平板操作法示意圖作法示意圖圖 5 涂布平板操專業(yè)資料整理WORD格式2. 稀釋涂布平板法采用上述稀釋混合倒平板法有兩個(gè)缺點(diǎn)， 一是會(huì)使一些嚴(yán)格好氧菌因被固定在瓊脂中間 ,缺乏溶氧而生長(zhǎng)受影響

3、,形成的菌落微小難于挑取；一是在傾入熔化瓊脂培養(yǎng)基時(shí)，假設(shè)溫度控制過(guò)高 ,易燙死某些熱敏感菌，過(guò)低那么會(huì)引起瓊脂太快凝固 , 不能充分混勻。在微生物學(xué)研究中, 更常用的純種別離方法是稀釋涂布平板法。該法是將已熔化并冷卻至約 50(減少冷凝水 )的瓊脂培養(yǎng)基 , 先倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中 , 制成無(wú)菌平板。待充分冷卻凝固后 ,將一定量 (約 0.1 ml)的某一稀釋度的樣品懸液滴加在平板外表 , 再用三角形無(wú)菌玻璃涂棒涂布 ,使菌液均勻分散在整個(gè)平板外表 , 倒置溫箱培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落。專業(yè)資料整理WORD格式另一種簡(jiǎn)單快速有效的涂布平板法, 可省去含菌樣品懸液的稀釋, 直接吸取經(jīng)振蕩分散的樣品懸浮液

4、l 滴參加 1 號(hào)瓊脂平板上 , 用一支三角形無(wú)菌玻璃涂棒均勻涂布, 用此涂棒再連續(xù)涂布2 號(hào)、3 號(hào)、4 號(hào)平板 (連續(xù)涂布起逐漸稀釋作用， 涂布平板數(shù)視樣品濃度而定), 翻轉(zhuǎn)此涂棒再涂布5 號(hào)、 6 號(hào)平板 , 經(jīng)適溫倒置培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落。該法可稱之為玻璃涂棒連續(xù)涂布別離法。3. 平板劃線別離法先倒制無(wú)菌瓊脂培養(yǎng)基平板,待充分冷卻凝固后 ,用接種環(huán)以無(wú)菌沾取少量待別離的含菌樣品,在無(wú)菌瓊脂平板外表進(jìn)展有規(guī)那么的劃線。劃線的方式有連續(xù)劃線、 平行劃線、扇形劃線或其它形式的劃線。通過(guò)這樣在平板上進(jìn)展劃線稀釋, 微生物細(xì)胞數(shù)量將隨著劃線次數(shù)的增加而減少 , 并逐步分散開(kāi)來(lái)。經(jīng)培養(yǎng)后 ,可在平板

5、外表形成分散的單個(gè)菌落。但單個(gè)菌落并不一定是由單個(gè)細(xì)胞形成的，需再重復(fù)劃線1-2 次, 并結(jié)合顯微鏡檢測(cè)個(gè)體形態(tài)特征, 才可獲得真正的純培養(yǎng)物。該法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便快速。專業(yè)資料整理WORD格式圖 6 平板劃線別離操作法示意圖個(gè)體細(xì)胞的生長(zhǎng)難以測(cè)定 , 而且生長(zhǎng)與繁殖是交替進(jìn)展的 , 因此，微生物的生長(zhǎng)繁殖一般不是依據(jù)個(gè)體細(xì)胞的大小 , 而是以群體細(xì)胞數(shù)目的增加作為指標(biāo)的。測(cè)定微生物細(xì)胞數(shù)量的方法很多 , 主要有顯微鏡直接計(jì)數(shù)法、平板菌落計(jì)數(shù)法、光電比濁法、最大可能數(shù) (MPN) 法、膜過(guò)濾法等。測(cè)定酵母細(xì)胞數(shù)或霉菌孢子數(shù)常采用在顯微鏡下直接進(jìn)展計(jì)數(shù)的方法 , 該計(jì)數(shù)方法被廣泛應(yīng)用于酒精、啤酒和白

6、酒等的工業(yè)化生產(chǎn)中。平板菌落計(jì)數(shù)法被廣泛應(yīng)用于食品、飲品、水質(zhì)和活菌制劑等的含菌指數(shù)或污染程度的檢測(cè)。該計(jì)數(shù)方法又稱平板活菌計(jì)數(shù)法, 其最大優(yōu)點(diǎn)是可以獲得活菌數(shù)的信息。但是, 該計(jì)數(shù)法操作過(guò)程較繁,需要培養(yǎng)一定時(shí)間才有結(jié)果, 且測(cè)定結(jié)果易受多種因素的影響。專業(yè)資料整理WORD格式光電比濁計(jì)數(shù)法是采用光電比色計(jì)或分光光度計(jì) , 測(cè)定菌懸液的光密度或透光度 , 其優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便迅速 , 可以連續(xù)測(cè)定 , 適合于自動(dòng)控制。但該法除了受菌體濃度影響外 , 還受細(xì)胞形態(tài)、大小、培養(yǎng)液成分及所采用光波長(zhǎng)等因索的影響。(一)顯微鏡直接計(jì)數(shù)法該法是將酵母菌或霉菌孢子懸液 , 放在血球計(jì)數(shù)器載玻片與蓋玻片之間的計(jì)數(shù)

7、室中， 在顯微鏡下直接進(jìn)展計(jì)數(shù)， 是一種常用的微生物計(jì)數(shù)方法。Thoma 血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的厚載玻片, 玻片的中間局部刻有四條溝槽 , 形成三個(gè)平臺(tái)。中間的平臺(tái)較寬且比兩邊的平臺(tái)略低 , 其中央刻有一小方格網(wǎng)的計(jì)數(shù)區(qū) , 計(jì)數(shù)區(qū)的面積為 l 平方毫米。另一種計(jì)數(shù)器中間平臺(tái)的中間又被一短的橫溝槽分為兩半 , 成為兩個(gè)小平臺(tái) , 每個(gè)小平臺(tái)上面各刻有一個(gè)計(jì)數(shù)區(qū) , 共有兩個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)。當(dāng)蓋上特定蓋玻片時(shí) , 蓋玻片與計(jì)數(shù)室的空間厚度正好是 0.l 毫米 , 這樣計(jì)數(shù)室的體積為 0.l 立方毫米 , 即 0.000l 毫升。計(jì)數(shù)室有兩種刻度形式 , 一種是全區(qū)分 16 大格 , 每大格再分 25 小

8、格 , 一共 400 小格。另一種是全區(qū)分 25 大格 , 每大格再分 16 小格 , 也是 400 小格。專業(yè)資料整理WORD格式計(jì)數(shù)時(shí) , 可將酵母菌液 (或孢子懸液 )充滿計(jì)數(shù)室 , 在顯微鏡下按規(guī)定數(shù) 4 個(gè)或 5 個(gè)大格的總細(xì)胞數(shù) , 再求得每小格內(nèi)平均的細(xì)胞數(shù) , 即可計(jì)算出每 ml 培養(yǎng)液中的細(xì)胞總數(shù)。每ml 菌 液 酵 母 菌細(xì) 胞 數(shù)=每 小格 平 均 酵 母 細(xì)胞 數(shù)40010000稀釋倍數(shù)。(二)平板菌落計(jì)數(shù)法該法的根本原理是：將待測(cè)含菌樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋, 使其中的微生物充分分散成單個(gè)細(xì)胞 , 然后取一定量的稀釋樣品液 , 接種到平板上。經(jīng)過(guò)一定時(shí)間培養(yǎng)后 , 由每個(gè)單細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而形成肉眼可見(jiàn)的單菌落 , 即一個(gè)單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個(gè)活菌。 最后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù) , 根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣量 , 換算出單位樣品中所含的活菌數(shù)。專業(yè)資料整理WORD格式實(shí)際上，由于待測(cè)樣品不易完全分散成單個(gè)細(xì)胞 , 故所形成的菌落并非都是單菌落 , 有一局部是由 2 個(gè)以上的細(xì)胞長(zhǎng)成的 , 因此平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果會(huì)比實(shí)際偏低。 現(xiàn)在已采用菌落形成單位 (cfu)來(lái)表示樣品的活菌含量。(三)光電比濁計(jì)數(shù)法光電比濁計(jì)數(shù)法的原理是：光線透過(guò)菌懸液時(shí) , 其透光率與細(xì)胞濃度成反比 , 而光密度與細(xì)胞濃度成正比。 透光率或光密度可以由光電池準(zhǔn)確測(cè)出 (光波通常