1、蛋白質純化與結晶的原理獲得蛋白質的晶體結構的第一個瓶頸，就是制備大量純化的蛋白質(>10 mg)，其濃度通常在10 mg/ml 以上，并以此為基礎進行結晶條件的篩選。運用重組基因的技術，將特定基因以選殖(clone)的方式嵌入表現載體(expression vector)內，此一載體通常具有易于調控的特性。之后再將帶有特定基因的載體送入可快速生長的菌體中，如大腸桿菌(Escherichia coli)，在菌體快速生長的同時，也大量生產表現載體上的基因所解譯出之蛋白質。一般而言純度越高的蛋白質比較有機會形成晶體，因此純化蛋白質的步驟就成為一個重要的決定因素。在取得高純度的蛋白質溶液后，接下

2、來就是晶體的培養。蛋白質晶體與其他化合物晶體的形成類似，是在飽和溶液中慢慢產生的，每一種蛋白質養晶的條件皆有所差異，影響晶體形成的變量很多，包含化學上的變量，如酸堿度、沈淀劑種類、離子濃度、蛋白質濃度等；物理上的變數，如溶液達成過飽和狀態的速率、溫度等；及生化上的變數，如蛋白質所需的金屬離子或抑制劑、蛋白質的聚合狀態、等電點等，皆是養晶時的測試條件。截至目前為止，并無一套理論可以預測結晶的條件，所以必須不斷測試各種養晶溶液的組合后，才可能得到一顆完美的單一晶體(圖一) 。蛋白質晶體的培養，通常是利用氣相擴散法(Vapor Diffusion Method) 的原理來達成；也就是將含有高濃度的蛋

3、白質(10-50 mg/ml)溶液加入適當的溶劑，慢慢降低蛋白質的溶解度，使其接近自發性的沈淀狀態時，蛋白質分子將在整齊的堆棧下形成晶體。舉例來說，我們將蛋白質溶于低濃度(1.0 M) 的硫酸銨溶液中，將它放置于一密閉含有高濃度(2.0 M)硫酸銨溶液的容器中，由氣相平衡，可以緩慢提高蛋白質溶液中硫酸銨的濃度，進而達成結晶的目的(圖二)。蛋白質晶體在外觀上與其他晶體并無明顯不同之處，但在晶體的內部，卻有很大的差異。一般而言，蛋白質晶體除了蛋白質分子外，其他的空間則充滿約40 %至60 %之間的水溶液，其液態的成分不僅使晶體易碎，也容易使蛋白質分子在晶格排列上有不規則的情形出現，造成晶體處理時的

4、困難及繞射數據上的搜集不易等缺點。但也由于高含水量的特性，讓蛋白質分子在晶體內與水溶液中的狀態，極為相似。所以由晶體所解出的蛋白質結構，基本上可視為自然狀態下的結構。· 蛋白質結構解析的方法簡介到目前為止，蛋白質結構解析的方法主要是兩種，x射線衍射和NMR。近年來還出現了一種新的方法，叫做Electron Microscopy。其中X射線的方法產生的更早，也更加的成熟，解析的數量也更多，我們知道，第一個解析的蛋白的結構，就是用x晶體衍射的方法解析的。而NMR方法則是在90年代才成熟并發展起來的。這兩種方法各有優點和缺點。首先來說一下，這兩種方法的一般的步驟和各自的優點和缺點。電子顯微

5、鏡（electron microscopy）作為一種新型的技術，目前的應用還是非常少，并且比較狹窄，我可能等到最后在給它作些介紹，而且相信絕大多數人也沒有聽說過，也不會有很大的興趣。首先是X晶體衍射。首先要得到蛋白質的晶體。通常，都是將表達蛋白的基因PCR之后克隆到一種表達載體中，然后在大腸桿菌中誘導表達，提純之后摸索結晶條件，等拿到晶體之后，工作便完成的80，將晶體進行x射線衍射，收集衍射圖譜，通過一系列的計算，很快就能得到蛋白質的原子結構。用x射線的優點是：速度快，通常只要拿到晶體，甚至當天就能得到結構，另外不受大小限制，無論是多大的蛋白，或者復合體，無論是蛋白質還是RNA、DNA，還是結

6、合了什么小分子，只要能夠結晶就能夠得到其原子結構。所以x射線方法解析蛋白的瓶頸是摸索蛋白結晶的條件。這個時候運氣就顯的特別重要。關于這個有好多有趣的離子。據說國外一個同學在摸索兩個月無果之后，毅然去度假，就將蛋白扔在一個很隨便的地方，等度假回來之后，卻發現已經結晶了。 然后，來說一下NMR。NMR（nuclear magnetic resonance）現象早已發現了很久，然后將這種方法用來解析蛋白結構，卻是近一二十年的事情。不過到今天為止，用nmr方法來解析結構已經十非常成熟的方法。原理暫且放在一邊，先說常規步驟。首先通過基因工程的方法，表達出目的蛋白，提純之后，摸索一下蛋白穩定的條件，如果蛋

7、白沒有聚合，而且折疊良好，便將蛋白樣品（通常是1mM3mM，500ul，Ph67的PBS）裝入核磁管中，放入核磁譜儀中，然后用一系列寫好的程序控制譜儀，發出一系列的電磁波，激發蛋白中的H、N13、C13原子，等電磁波發射完畢，在收集受激發的原子所放出的“能量”，其實也是小磁場，通過收集數據、譜圖處理、電腦計算從而得到蛋白的原子結構。它的優點就是，蛋白在液體中得到結構，是一個動態的結構，事實上所有在pdb中或者文獻中發表的NMR結構都是十個或者二十個結構的ensemble（集合），這就是因為這些結構都是進行能量優化后符合條件的結構，或者說就是溶液中的蛋白結構。因為是動態就很容易的研究蛋白與其他蛋

8、白或者配基的相互作用。缺點是，受大小的限制，到目前為止NMR解析蛋白結構的上限是50kd。 無論是晶體還是NMR，蛋白都要符合下面的條件：首先表達量要大，象NMR要求1個mM500UL，這就要求十幾個毫克，結晶要摸索很多的條件也需要大量的蛋白。所以蛋白一定要在胞質中表達才行。其次，蛋白要折疊。我們知道許多蛋白，尤其是真核蛋白在大腸桿菌中是以包含體的形式存在，這種情況下是不行的，除非復性。如果你的蛋白在胞質中表達，如果你不確定是不是表達，可以從分子篩上的位置，或者掃CD確定一下，當然最簡單的是做一個NMR一維譜，只需要幾分鐘。小于20Kd的蛋白可以考慮NMR，因為NMR研究功能核相互作用方面是更加擅長的，而且不需要結晶，現在速度也不慢。如果比較大，可以考慮晶體解析。 對于用NMR來解析結構，最重要的條件就是非常昂貴的核磁譜儀，以及同位素標記蛋白。只要采集了譜之后