1、管碟法測定抗生素的效價目錄概述1基本原理2菌液制備3基本操作及注意事項4操作要點5檢定的影響因素61概述抗生素微生物檢定法是國際上通用的、經典的抗生素效價測定方法。隨著HPLC等化學分析技術的發展，一些抗生素效價的測定已被化學方法所替代，但由于以下原因，抗生素微生物檢定法，目前在各國藥典中仍占有重要地位。1.微生物檢定法可直觀、特異的反應出抗生素藥品的抗菌活性，顯示臨床的特點。2.多組分抗生素由于不同組分生物活性的差異，化學測定結果難以準確表征組分、組成、含量和活性的關系。3.許多抗生素品種由于各種原因目前沒有適當的化學分析方法表征其活性。4.同時微生物法所需的儀器設備簡單，成本低。在中國藥典

2、2010年版二部附錄抗生素微生物檢定法及2015版藥典中，詳細描述了管碟法和濁度法測定抗生素效價的方法，根據公司生產及檢測情況，主要是硫酸慶大霉素和硫酸慶大霉素顆粒，采用抗生素管碟法測效價來計算含量，因此，此章主要介紹管碟法。抗菌活性抗菌活性是指抗菌藥物抑制或殺死病原微生物的能力。抗生素的抗菌活性通常用效價來表示。在臨床應用中，抗生素的抗菌活性可準確地反應抗生素的醫療價值。 如：硫酸鏈霉素 798單位/毫克 青霉素G鈉 1670單位/毫克2010版藥典二部附錄及2015版藥典，在適宜條件下，根據量反應平行線原理，利用抗生素在瓊脂培養基內的擴散作用，比較標準品與供試品兩者對接種的試驗菌產生抑菌圈

3、的大小，測定供試品的效價。2基本原理 兩種互動作用：一種是抗生素溶液向培養基內呈球面狀擴散作用；另一種是試驗菌的生長作用。 當培養到一定時間，瓊脂培養基的兩種互動作用達到動態平衡時，瓊脂培養基中便形成透明的抑菌圈。即：在抑菌圈中因抗生素濃度高于抑菌濃度，試驗菌生長受到抑制，此處瓊脂培養基成透明狀；在抑菌圈邊緣抗生素濃度恰好等于抗生素最低抑菌濃度。抑菌圈的形成量反應平行線原理：當抗生素濃度的對數劑量和反應呈直線關系，且供試品和標準品的作用性質相同時，供試品和標準品的兩條量-反應關系曲線相互平行。（中國藥典二部附錄XIV生物檢定統計法）根據中國藥典2010年版二部附錄要求，硫酸慶大霉素和硫酸慶大霉

4、素顆粒測效價，選取短小芽孢桿菌作為試驗菌。取短小芽孢桿菌CMCC(B)63202的營養瓊脂斜面培養物，接種于盛有營養瓊脂培養基的培養瓶中，在3537培養7日，用革蘭氏染色法涂片鏡檢，應有芽孢85%以上。用滅菌水將芽孢洗下，在65加熱30分鐘，備用。3菌液制備流程圖凍干菌粉 營養肉湯半固體瓊脂斜面制菌懸液穿刺管（保藏及傳代用）備注：每經過一次培養箱培養，菌的代數就增加一代。參考：藥品微生物學檢驗技術主編：蘇德模 馬緒榮 2007年出版（復活）1.復活 從菌種保藏機構購回的標準菌株，是冷凍干燥粉，需經過復活。（凍干菌種為第0代）無菌操作，將冷凍干燥菌種安瓿用75%乙醇消毒后，用砂輪在安瓿頸部刻線，

5、用無菌紗布掰開，或灼熱安瓿頂部，立即作滅菌濕紗布蓋住頂部，安瓿頂部便驟然裂開，小心移去玻璃碎片，用一無菌毛細管吸取0.5-1ml適宜的液體培養基，直插安瓿底部，擠出營養肉湯培養基，在底部振搖使菌粉溶解，再將安瓿內菌液吸出，接種至營養肉湯培養基。35-37度培養18-24小時。（此為第一代）制保藏用菌株將營養肉湯培養物，用接種針沾取菌苔（菌液），沿半固體培養基中心向管底作直線穿刺。穿刺到保藏管中，同樣溫度35-37度，培養18-24h，然后，放置2-8度冰箱保存，作為保藏及傳代用的菌株。試驗用菌種穿刺管1支，按無菌操作要求，接種于盛有30ml普通瓊脂培養基的大三角瓶中，旋轉三角瓶使全部瓊脂培養基

6、表面被菌液浸潤，多余的菌液用吸管吸出棄入消毒液中。將已接種的三角瓶置3537的培養箱中培養710天，用革蘭氏染色法涂片鏡檢，應有芽孢85%以上，用滅菌水20ml洗下芽孢，制成懸液，在65水浴中加熱30分鐘，即得。置5冰箱中保存。制工作用菌懸液革蘭染色法 具體操作步驟： 涂片 干燥（自然干燥、培養箱內） 固定（火焰） 染色（包含初染、媒染、脫色、復染四步）涂片染色染色初染：初染：草酸銨結晶紫染1分鐘，自來水沖洗。媒染：媒染：加碘液覆蓋涂面染1分鐘，自來水沖洗。脫色：脫色：加95%酒精數滴，并輕輕搖動進行脫色，30秒后自來水沖洗。復染：復染：加沙黃（復紅）復染液30秒后，自來水沖洗。自然干燥或用吸

7、水紙吸去水分，鏡檢。染色的結果：染色的結果：革蘭陽性菌呈紫色，革蘭陰性菌呈紅色。圖片染色步驟涂片涂片鹽水鹽水 95% 95%乙醇乙醇自然干燥自然干燥媒染媒染1min1min脫色脫色 30s30s固定固定初染初染1min1min復染復染30s干燥干燥鏡檢鏡檢接種環接種環草酸草酸銨結銨結晶紫晶紫碘液碘液復紅復紅革蘭染色原理 由于細菌細胞壁的結構和組成不同，將細菌分為革蘭陽性菌和革蘭陰性菌。 G菌：細胞壁厚，肽聚糖網狀分子形成一種透性孔障，當乙醇脫色時，肽聚糖脫水而孔障縮小，透性降低,故保留結晶紫-碘復合物不易被洗脫而保留在細胞膜上，菌體呈紫色為革蘭陽性菌。 G菌：肽聚糖層薄，交聯松散，乙醇脫色不能

8、使其結構收縮，其脂含量高,乙醇將脂溶解，細胞壁透性加大，結晶紫-碘復合物溶出細胞壁，沙黃復染后菌體呈紅色為革蘭陰性菌。革蘭染色注意事項1.革蘭染色成敗的關鍵是脫色時間，如脫色過度，革蘭陽性菌也可被脫色而被誤認為革蘭陰性菌；如脫色時間過短，革蘭陰性菌也會被誤認為是革蘭陽性菌。因此必須嚴格把握脫色時間。 2.選用培養1824小時菌齡的細菌為宜，若細菌太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭陽性菌轉呈陰性菌。革蘭染色結果革蘭染色結果革蘭染色結果革蘭染色結果管碟法的操作步驟預試驗 試驗準備 雙碟的制備 供試品、標準品溶液的制備 菌層的制備 放置小鋼管 滴加抗生素溶 液 雙碟的培養 抑菌圈的測量 結果的可 靠性

9、檢驗及效價測定4基本操作及注意事項預試驗：確定最佳的試驗條件：調整試驗菌的濃度、使用量、抗生素濃度、培養基等，使抑菌圈的大小符合規定，即二劑量法高劑量濃度標準品溶液所致的抑菌圈直徑在1822mm,三劑量法中間劑量濃度標準品溶液所致的抑菌圈直徑在1518mm. 高低劑量之比為2:1.試驗結果中抑菌圈直徑不應該過大或者過小，在試驗之前，可以先做一個關于用不同濃度菌液配制的瓊脂培養基菌層預試驗，選擇抑菌圈直徑在1822mm的菌液濃度為試驗用濃度（菌液濃度約為106個/mL）。批量試驗中后期，菌液保存的時間過久，菌株就會逐漸衰亡，生長周期不一致，影響其對抗生素的敏感度，導致抑菌圈變大、模糊或者出現雙圈

10、。如若菌株不純，也會造成這樣的結果。因此，菌液在使用一段時間后，可以重新配制純化或者減小原來菌液在使用中的稀釋倍數。試驗準備：雙碟、鋼管、毛細滴管、吸管的清洗及滅菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培養基、緩沖液的準備、半無菌間的紫外消毒等. 抗生素試驗中，玻璃雙碟、小鋼管往往會連續使用。由于清洗方面的原因，它們還是容易殘留上次試驗中的抗生素（慶大霉素、爭光霉素、鏈霉素等）或者被清洗用的殺菌劑（如新潔而滅、洗潔精、去污粉等）污染，以至于在下次試驗中造成抑菌圈不正常的現象。因此，在清洗時要尤為注意多用流水沖洗。雙碟的制備：每只雙碟加底層培養基約20ml,待培養基凝固后,將雙碟放入3537培養箱中,待用.

11、無菌室工作臺面可能因為使用時間已久，變得凹凸不平或者傾斜，會影響培養基菌層的厚度均勻性。菌層越薄，形成的抑菌圈越大，會給試驗造成很大的誤差。我們可以在桌面上放置一塊足夠大的玻璃平板，保證雙碟放置區域的平整。在雙碟底部預先標記樣品的高低濃度區域，在加注培養基底層的時候，有順序地按照一致方向排列。接下來加注培養基菌層的時候，仍然按照原來的位置與方向排列。這樣，即使桌面不夠水平，還是能夠保證培養基菌層是在水平的培養基底層上鋪開，達到消除誤差的目的。試驗中加注的培養基如果溫度太低，就容易在內部結塊，或者加注到雙碟之后不能及時鋪開，使得培養基表面為非水平面，會給試驗帶來誤差。加注6080的培養基底層之后

12、，不應立即給雙碟加蓋。因為溫度過高的培養基會形成大量的水蒸氣，在雙碟蓋上凝集并滴落在已經凝固定的培養基底層上，會給培養基菌層的加注帶來影響。供試品、標準品溶液的制備：估計供試品的效價,根據試驗要求設計供試品、標準品溶液稀釋步驟,平行制備供試品、標準品相關劑量的溶液.依公司產品，硫酸慶大霉素和硫酸慶大霉素顆粒，采用的是二劑量法，試驗中，制成高、低濃度的溶液。 依中國藥典2010版及2015版二部附錄要求，菌層的制備：注意菌層培養基溫度；根據預試驗確定加入菌層培養基的菌液量,注意制備菌層的速度和平整度. 制備瓊脂培養基菌層時，培養基溫度過高或者受熱時間太長都會導致試驗菌死亡。當菌種為非芽孢桿菌的時

13、候，現象尤為明顯，甚至會出現無菌生長。因此，培養基應放在50水浴中保溫。當加入試驗菌種混勻后，應盡快加注到底層培養基上。在試驗的時候，如果從大瓶內用刻度吸管吸取帶菌培養基吸管中培養基量少極易冷卻，加在底層培養基上就不易均勻鋪開，導致菌層厚度不均，影響到抑菌圈的直徑。因此可以事先把配制好的培養基分裝在具塞試管內，每管5mL，濕熱滅菌后放在50水浴鍋內保溫(水浴溫度：細菌為4850，芽孢可至60)。試驗中，再分別加入菌液混勻，配制成帶菌瓊脂。震蕩混勻后繼續保溫5min使培養基溫度回升，然后直接倒在底層培養基上，轉動雙碟使培養基均勻鋪開。放置小鋼管放置小鋼管時，注意管與管之間不能太靠近，否則會引起相

14、鄰的兩個抑菌圈之間的抗生素擴散區中的濃度增大，相互影響形成卵圓形或橢圓形抑菌圈。管與雙碟邊緣同樣也不能太靠近，因為液面浸潤作用，邊緣的瓊脂培養基菌層為非平面，會影響抑菌圈的形狀。小鋼管放置時，要小心地從同一高度垂直放在菌層培養基上，不得下陷，不得傾斜，不能用懸空往下掉的方法。放置之后，不能隨意移動，要靜置5min，使之在瓊脂內稍下沉降穩定后，再開始滴加抗生素溶液。滴加抗生素溶液：注意標準品、供試品高、低劑量溶液滴加順序,保證滴加速度和加量的均勻一致.滴加抗生素要按照SHTHSLTL（二劑量法）或者SHTHSMTMSLTL（三劑量法）的順序滴加。滴加之前，滴管至少要用被滴液體沖洗3次。在滴加抗生

15、素到小鋼管的時候，由于毛細管內抗生素溶液往往會有氣泡或者毛細管開口端有液體殘留，繼續滴加容易造成氣泡膨脹破裂，使溶液濺落在瓊脂培養基表面造成破圈。因此一旦毛細管中出現氣泡或者殘留，就重新吸取抗生素溶液進行滴加，毛細管口應避免太細，滴加的時候離開小鋼管口距離不要太高。TH樣品的高濃度SH標品的高濃度SL標品的低濃度TL樣品的低濃度滴加中若有濺出，可用濾紙片輕輕吸去，不致造成破圈。在滴加中還有可能出現抗生素溶液滴入小鋼管后，沒有與瓊脂培養基菌層接觸，有一段空氣被壓在溶液與培養基之間，這樣是不會產生抑菌圈的。此時可以小心的用滴管吸出小鋼管內的抗生素溶液，棄去。換滴管重新滴加。抗生素溶液滴加后，液面應

16、該與小鋼管管口齊平，液面反光呈黑色。（抗生素液體加入量不能按滴計算，即使同一滴管，每滴的量也有差異。）如果抗生素溶液滴加過滿，可以用無菌濾紙片小心吸去多余部分。雙碟的培養：根據培養溫度的要求在培養箱中進行培養,培養箱中水平碟放的雙碟數以不超過三層為宜。滴加了抗生素溶液后的雙碟忌震動，要輕拿輕放。在搬運到培養箱的過程中，可以預先在培養箱中墊上報紙鋪平，再把雙碟連同墊于桌上的玻璃板小心運至培養箱，緩慢推入箱內。雙碟在37下培養約16h。時間太短會造成抑菌圈模糊，太長則會使菌株對抗生素的敏感性下降，在抑菌圈邊緣的菌繼續生長，使得抑菌圈變小。在培養過程中，如果溫度不均勻（過于接近熱源），會造成同一雙碟

17、上細菌生長速率不等，使抑菌圈變小或者不圓。所以把雙碟放入培養箱時，要與箱壁保持一定的距離，雙碟疊放也不能超過3個。培養中，箱門不得隨意開啟，以免影響溫度。應經常注意溫度，防止意外過冷過熱。抑菌圈的測量：抑菌圈測量儀的使用,每組試驗雙碟應在相同的測量參數下進行測量.硫酸慶大霉素顆粒劑，采取每組12只，同時做一份平行樣品，共做2組，試驗后，剔除部分不合格品。采用抑菌圈自動測量分析儀ZY-300IV型，自動掃描出抑菌圈，測出直徑并計算出產品效價。（中國藥典2010版附錄XIV生物檢定統計法）結果的可靠性檢驗及效價測定：抑菌圈測量儀提供計算結果.如低于估計效價的90%或高于估計效價的110%時，應調整

18、其估計效價，重新試驗。除另有規定外，本法的可信限率不得大于5%。1.試驗菌需新鮮培養，傳代最好不超過5次,以防止菌種老化變異.芽孢桿菌培養物用滅菌水洗下后,應在65加熱30分鐘,使菌體的菌齡一致,用革蘭氏染色,應有芽孢85%以上.2.加入菌懸液的體積,一般不少于0.3ml,并且不大于上層培養基體積的2%.如果加入菌懸液的體積過小,則在同次實驗中,不同次加入菌懸液的體積相差較大,造成實驗誤差；如果加入菌懸液的體積過大,則會使上層培養基變稀,并且因菌懸液的溫度較低,加至培養基5操作要點中可能造成培養基結塊,影響測定結果.對于加入菌懸液體積的控制,可通過調節菌懸液的濃度來實現.3.放置孵箱培養時排放

19、應不得超過三層,避免因培養溫度不均勻而導致各雙碟中抑菌圈大小不一. 4.在制備菌層培養基時,將菌液加入菌層培養基后,立即充分搖勻,但應避免產生氣泡. 5.標準品與供試品溶液濃度的比值應控制在2%以內，以保證兩者的濃度偏差在一定的范圍內。6.培養基的PH值對試驗結果影響很大，使用時培養基的PH值應調節到適合該品種試驗的最佳范圍。對氨基糖苷類堿性抗生素而言，在偏堿性條件下抗菌活性比較強，通常滅菌后的PH值范圍為7.8-8.0。如抑菌圈清晰，當圈偏小時，可考慮把培養基的PH值調高至8.0.1.試驗菌種：當試驗菌種中含有對抗生素敏感度不同的兩種或兩種以上的菌株時，由于各菌株的最低抑菌濃度不同，在形成抑

20、菌圈時可能出現雙圈及邊緣模糊不清，影響測量抑菌圈的準確度。因此，應定期將試驗菌種進行平板分離，經涂片鏡檢后，挑選典型的單個菌落作為工作用菌種。陳舊的試驗菌培養物也會使抑菌圈邊緣模糊，故試驗時應用新鮮制備的試驗菌液。6檢定的影響因素2.培養基：培養基的質量對抑菌圈的大小和清晰度都有影響，故對配制培養基用的幾種主要原材料如胨、牛肉膏、酵母膏及瓊脂等都應通過預試驗選擇適宜的品種使用。慶大霉素檢定用的培養基是號。3.雙碟的制備：鋪雙碟底層培養基時，培養基的溫度不宜過高，一般將融化后的培養基在室溫冷至約70時加入雙碟中為宜，否則加雙碟蓋后，底層培養基上會出現冷凝水。當鋪菌層培養基時，由于冷凝水的局部冷卻

21、和稀釋作用，可使菌層培養基凝固后表面不平。菌層培養基一定要鋪均勻，這是決定抗生素效價測定的關鍵。故要求鋪菌層時一定要與鋪底層時雙碟的位置、方向相一致。制備菌層時，培養基的溫度不要過高，受熱時間也不宜過長，特別是一些對熱敏感的試驗菌更要注意。否則，可使試驗菌部分或全部被殺死，導致抑菌圈破裂或甚至無抑菌圈形成。因此，一定要按規定控制菌層培養基的溫度。在雙碟培養基上放置小鋼管的距離要合適。當距離太小而抑菌圈又太大時，則相鄰兩個抑菌圈之間的抗生素擴散區中抗生素的濃度增大，形成互相影響的卵圓形或橢圓形抑菌圈。在滴加抗生素溶液至小鋼管時，若毛細滴管口不圓整或有小缺口，或管內有氣泡，均可使抗生素溶液從管口濺

22、出；若加液太滿，溶液會從小鋼管口溢出；小鋼管底部不平，溶液會從底部漏出。以上原因均會造成抑菌圈不圓整或破裂成桃形。防止的辦法是滴管口要圓整，管口不能太細，管內不能有氣泡，加液時滴管口離校鋼管的距離不能太高，小鋼管兩端面要平。4.雙碟的培養溫度和時間：培養箱的溫度要均勻，每組雙碟要放在同一層盤內，在培養過程中，不要開啟培養箱，以免影響培養箱內的溫度。雙碟的培養時間也與抑菌圈的清晰度有關。5.抗生素污染：無抑菌圈形成的原因，大多由于抗生素污染所致。因此，在進行抗生素效價測定時，要嚴防抗生素污染。防止的辦法是將配置和稀釋抗生素溶液所用的容器與制備培養基所用的容器嚴格分開，切不可將抗生素溶液撒于地面，以免抗生素附著在微小塵埃上隨風飄落在雙碟瓊脂培養基上，而造成抑菌圈破裂或無抑菌圈形成。6.標準品：抗生素微生物檢定發的實驗采用標準品與供試品對比試驗的平行線原理。因此，要求標準品與供試品必須是同質的抗生素。如標準品與供試品所含的活性物質不同，則標準品和供試品的兩條劑量反應線不成平行直線關系，就不能按平行線原理計算效價。各種抗生素都有它同質的標準品，決不能用這一型抗生素組分制備的標準品，去測定另一型抗生素的供試品。7.抑菌圈質量的控制（1）抑菌圈的性狀試驗中，常有抑菌圈破裂，不圓，甚至破圈的情況，其原因是多方面的：在滴加抗生素溶液時，藥液濺出、毛細滴管碰到鋼管