1、實驗九 植物原生質體分離及融合一、實驗目的一、實驗目的 學習植物原生質體的分離及融合的原理，掌握其操作方法。二、實驗原理二、實驗原理 植物原生質體是具有質膜，但去掉了細胞壁的植物細胞，分離的原生質體在培養條件下具有再生新壁，進行連續的細胞分裂并分化成完整植株的能力，即具有細胞全能性。細胞壁的主要成份是纖維素和果膠質，它們分別經纖維素酶，果膠酶處理即可分解，從而脫去細胞壁。由于質膜完全暴露，原生質體具有攝取大分子(如核酸)，細胞器(如核、葉綠體)和細菌，病毒的能力，因此是進行遺傳操作，基因轉移的好材料。而原生質體融合是實現上述目的的一個極為重要的手段。同種或異種原生質體可在聚乙二醇(PEG)誘導

2、下產生異核體，實現體細胞雜交，實現廣泛的遺傳重組，創造新的生物類型。PEGPEG為為一種高分子化合物，能與水、蛋白質、和一種高分子化合物，能與水、蛋白質、和碳水化合碳水化合物等物等一些基團能形成氫鍵一些基團能形成氫鍵。普遍。普遍認為聚乙二醇分子能改變認為聚乙二醇分子能改變各類細胞的各類細胞的膜結構膜結構，使兩細胞接觸點處質膜的，使兩細胞接觸點處質膜的脂類脂類分子發分子發生疏散和重組，由于生疏散和重組，由于兩細胞兩細胞接口處雙分子層質膜的相互親接口處雙分子層質膜的相互親和以及彼此的表面張力和以及彼此的表面張力作用，從而作用，從而使細胞發生融合使細胞發生融合聚乙二醇（PEG）由于含有醚鍵而具有負極

3、性，與水、蛋白質和碳水化合物等一些正極化基團能形成氫鍵，當聚乙二醇（PEG）分子足夠長時，可作為臨近原生質表面之間的分子橋而使之粘連、聚乙二醇（PEG）也能連接鈣等陽離子，鈣可在一些負極化基團和聚乙二醇（PEG）之間形成橋，因而促進粘連。從而引起原生質體融合：高鈣高pH由于增加了質膜的流動性，因而也大大提高了融合頻率，洗滌時滲透壓沖擊也可能起作用。三、實驗用品三、實驗用品 (一)材料：植物葉片(菠菜葉片) (二)用具：倒置顯微鏡，離心機，過濾篩(100目)，漏斗，燒杯，吸管，長注針，注射器(5-10m1)等； (三)試劑： 1纖維素酶2，果膠酶l。 在0.65M甘露醇，0.05MCaCl22H

4、20和0.1MES中，PH調至5.6-6.0。 20.16M CaCl22H20溶液(內含0.1MES)PH5.6。 322蔗糖溶液。 430聚乙二醇(PEG)溶液 5高PH高鈣洗脫液(PH=9) 0.1M CaCl22H20 0.1M梨酶醇 0.5ml100ml 1M Tris 60.24M CaCl22H20四、實驗方法四、實驗方法 (一)原生質體的分離收集： 1取菠菜葉片撕去下表皮，每小組稱0.2g切成小塊放到10ml酶液中，在26下酶解4-5小時，或酶含量減半過夜，期間輕輕搖動幾次。 2用100目的過濾篩過濾。 3用與濾液等體積的0.16M CaCl22H20溶液沖洗過濾篩，使沖洗液沖

5、入過濾液。 4濾液用離心機100-300rpm，離心5分鐘棄上清。 5沉淀中加入0.16M CaCl22H20溶液1-2ml于沉淀，輕搖使之懸浮，用帶長針頭的注射器自離心管底部輕輕地加入6-8ml 22蔗糖溶液，使之形成界面。6靜置待原生質體形成一條帶時棄去上、下液及殘渣，用吸管吸取收集原生質體。蔗糖漂浮方法： 1）用細口吸管吸22%蔗糖溶液約3ml，小心插入盛有原生質體懸液的離心管底部，緩緩將蔗糖溶液擠出，由于比重不同，蔗糖溶液與原生質體懸液中間有一明顯界面(注意要有明顯界面). 2靜置后此時死細胞及碎片降至蔗糖溶液內，聚集在離心管底部，而活細胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面處， 3) 用細管吸取漂浮在上下界面處的健康原生質體，轉入干凈的離心管中7用0.24M CaCl22H20溶液洗滌一次，離心吸去上清液。8沉淀中加入l-2mlO.16MCaCl22H20溶液懸浮沉淀，用血球計數板計數，使原生質體密度為2105個ml。9取一滴于載玻片上，低倍鏡觀察原生質體的純度和完整性，也可用熒光顯微鏡檢查。 (二)原生質體融合操作 1取上述原生質體液兩滴，間隔5mm滴